植物细胞工程-课件chater7plant anther cultureand hybriding

CHAPTER7

植物单倍体育种和花药（粉）培养

第一节植物单倍体育种第二节花药和花粉培养染色体是遗传物质的载体。染色体数目的变化会导致形态、解剖、生理、生化等诸多遗传特性的变化。倍性变异与倍性育种自然界各物种的染色体数目是相对稳定的，而且体细胞染色体数为性细胞的二倍。但植物细胞中染色体数目也会发生成倍增加或减少的现象。细胞含有3个以上染色体组的个体叫多倍体,仅含配子染色体数的个体叫做单倍体，这些都属于倍性变异。本章主要介绍倍性变异的规律及其在植物育种中的应用。在大多数生物的体细胞中，染色体都是两两成对的。体细胞中成双的染色体可以分为两套染色体,经减数分裂形成的配子只含一套染色体,叫做一个染色体组(genome)

。染色体组(genome)与倍性人体细胞的染色体每一物种生殖细胞内的全部染色体，在形态和功能上各不相同，但是包含了控制生物体生长发育、遗传和变异的全部信息，这样的一组完整的非同源染色体，叫做一个染色体组。单倍体在生物的体细胞中，染色体的数目不仅可以成倍地增加，还可以成倍地减少。体细胞中含有本物种配子染色体数的生物个体。例如，蜜蜂的蜂王和工蜂的体细胞中有32条染色体，而雄蜂的体细胞中只有16条染色体。像蜜蜂的雄蜂这样，体细胞中含有本物种配子染色体数目的个体，叫做单倍体。对于二倍体生物而言，它的单倍体的体细胞中只含有一个染色体组。例如，玉米是二倍体，它的体细胞中含有2个染色体组、20条染色体，它的单倍体植株的体细胞中含有1个染色体组、10条染色体。单倍体植株经过人工诱导使染色体数目加倍，重新恢复到正常植株的染色体数目，不仅能够正常生殖，而且每对染色体上的成对的基因都是纯合的，自交产生的后代不会发生性状分离。因此，利用单倍体植株培育新品种，只需要两年时间，就可以得到一个稳定的纯系品种。与常规的杂交育种方法相比，明显地缩短了育种年限。早在20世纪70年代初，我国就开始用花药体培养选育新品种，育成了“京花一号”小麦等新品种。“京花一号”小麦穗大粒多，丰产性好，而且适应性和抗病性强，现在已经大面积推广种植。多倍体体细胞中含有3个或3个以上染色体组的生物叫做多倍体。

多倍体的一般细胞体积比较大。因染色体增多，反映在个体的根、茎、叶、果实等显粗大。所以农业中把多倍体作为一种重要的育种方法。第一节植物单倍体育种单倍体植株的特性和利用单倍体育种及优势单倍体的获得花药培养花粉培养单倍体单倍体是指体细胞中含有本物种配子染色体数的生物个体。减数分裂形成的细胞就是单倍体细胞。配子是减数分裂产生的细胞，这种细胞中的全部染色体就称为染色体组（也称基因组），在这个染色体组中，各种染色体都只有一条，或者说，在一个染色体组中，各种染色体都只有一条，都是成单的。从染色体形态特征上看，单倍体染色体数只有二倍体的一半，因而其细胞的核变小，从而导致营养器官和繁殖器官变小，如气孔、叶片、花药、花较小及植株矮化；另一方面，单倍体植株的特点还常常是开花茂盛、较早、延续时间长、花粉粒显著不正常，败育（90～99%甚至更高），结实极少而籽粒小，所以常将不育性作为鉴别单倍体的标志；单倍体植株的性状有变化，能形成新的性状，比如水稻单倍体可以变成无芒的、丛生性的、叶扭曲的等等。单倍体植株的特性单倍体育种

由于进行简单染色体加倍后就可得到纯合的二倍体，主要应用于育种。

单倍体育种：

将具有单套染色体的单倍体植物，经人工染色体加倍，使其成为纯合二倍体。从中选出具有优良性状的个体，直接繁育成新品种；或选出具有单一优良性状的个体，作为杂交育种的原始材料，称为单倍体育种。单倍体育种的优势：1、控制杂种分离，缩短育种周期2、排除显隐性基因干扰，提高选择效率3、作诱变材料提高诱变效率4、克服远缘杂交不育5、快速纯化栽培品种单倍体育种控制杂种分离，缩短育种周期通常杂种材料必须经过4-5代以上的近交分离和人工选择，才能获得主要性状基本纯合的基因型。而获得单倍体后再进行人工加倍，只需一个世代就可以获得纯合二倍体，这就可以大大加速育种进程，缩短育种年限，节约人力、物力和土地资源等单倍体育种的优势传统杂交育种需8~10年，单倍体育种只需2年时间就可得到纯合体单倍体育种的优势排除显隐性基因干扰，提高选择效率等位基因杂交育种选择频率单倍体育种选择频率1对：Aa2对：Aa和Bb3对：Aa、Bb和Ccn对：Aa。。。(½)11/21*21/22*21/23*21/2n*2(½)3(½)2(½)n效率比1/211/221/231/2n以隐性纯合体作为选择目标，传统杂交育种和单倍体育种的选择效率单倍体育种的优势3、诱变材料常规诱变难以使等位基因的两个成员同时发生突变；隐性基因突变往往被显性基因掩盖而不能表现。4、远缘杂交克服远缘杂种因染色体无法正常配对而导致的不育。5、纯化栽培品种通过对特定性状植株的花粉进行培育，获得单倍体植株进行加倍，得到纯系。单倍体育种的优势单倍体的获得1、自然筛选

1921年最早发现单倍体的曼佗罗，至今已发现高等植物中有20余科百余种有单倍体植株存在，但在自然界其频率较低（0.001～0.01%），加之高度不育或完全不育，往往自生自灭。自发单倍体未能得到广泛应用。2、人工诱发单倍体育种单倍体的自然发生在自然条件下，玉米、高梁、水稻、番茄等高等植物，偶尔也会出现单倍体植株。单倍体的获得自然发生孤雌生殖：由卵细胞不经受精直接发育成胚和植株。孤雄生殖：由精细胞单独发育形成胚和植株。无融合生殖：由反足细胞、助细胞等发育形成。体细胞减数分裂：几率很小。人工诱发单倍体实验诱导单倍体植物的产生是比较复杂的。因为单倍体植物常常是起源于单倍单性生殖，所以诱发单倍体方法的可归结为不经过受精作用、两性核的融合而刺激配子发育。单倍体的获得主要有两种方式：

孤雄生殖：花药（粉）培养，诱发小孢子单性发育形成植物体。

孤雌生殖：未受精子房或胚珠培养，诱发卵细胞单性发育形成植物体。早在1964年，印度的古哈（Guha）和马赫西瓦里（Maheshwari）两位教授就开始培养毛叶曼佗罗的花药，直到1966年，他们从毛叶曼佗罗的花药培养中得到了单倍体植株。他们的成功引起了世界范围内的花药培养热潮，至20世纪70年代，许多国家的科学家用花药培养发得到了水稻、茶、甘蓝、黑麦等单倍体植株。人工诱发孤雄生殖单倍体的获得

许多研究者曾试图利用异属、种的花粉授粉，经辐射线照射过的花粉授粉、延迟受粉、或借助于不正常温度（低温或高温）影响花粉粒萌发或影响受精过程的正常进行等方法获得具有单倍体胚的种子，从而得到单倍体植物。人工诱发孤雌生殖单倍体的获得

此外，因发现双胚或多胚种子长出的双生苗或多生苗中单倍体出现的频率常高于正常的单胚种苗，所以也试图由双生苗中分选出单倍体。或试用核替换、激素和化学药剂处理、机械刺激子房等方法诱发单倍体。但迄今用这些方法尚未能有效地获得大量的单倍体用于育种。人工产生单倍体以前所用的方法有：远缘杂交、延迟授粉、用射线照射花粉授粉、激素处理及激温处理等。单倍体的获得60年代中期，印度的Guha和Maheshwari首次报道由南洋金花花药培养获得大量花粉植株后，通过花药培养产生单倍体的技术已被成功推广到多种植物中，其中包括禾谷类作物和蔬菜等。利用花药或花粉培养以及胚囊中单倍的卵细胞培养，在育种上取得了较好的成绩。单倍体的获得第二节植物花药花粉培养技术

花药培养方法，简言之，就是把孢母细胞经过减数分裂后处于发育某一阶段的花药从植株上取下来，在无菌操作条件下接种在人工合成的培养基上，经过一段时间培养，花药中的花粉经细胞分裂和分化发育为植株。即离体培养条件使花粉改变自己的正常发育过程，进而形成单倍体植物。BACK离体培养小孢子发育成植物体的途径花粉的配子体发育途径花药培养技术

自然状况下，花粉(小孢子)发育形成雄配子体（2细胞或3细胞的花粉粒）花粉的孢子体发育途径离体培养条件下，花粉最终形成完整的植株，类似由一个合子细胞发育形成孢子体的过程，因此，把花粉在离体培养条件下发育形成单倍体植株称为花粉的孢子体发育途径。花药培养技术花粉的孢子体发育途径A花粉孢子体的发育途径

途径ABC

孢子体第一次在配子体配子体配子体分裂发生的时间第一次分裂之后第一次分裂之前第一次分裂之后

参与形成孢子体NN2N、3N、4N的染色质的量多N（2N、3N、3N）-X孢子体单倍体单倍体二、三、四倍体植株的倍性或多倍体或它们的非整倍体

花药培养技术花粉的孢子体发育途径B花药离体培养的主要过程：诱导花粉形成愈伤组织诱导愈伤组织分化苗使幼苗生长健壮花药培养技术花药培养材料准备诱导花粉脱分化、分裂分化培养和壮苗培养完整植物体形成驯化和移植花粉植株鉴定1、材料准备

对花粉发育时期进行选择。

挑选出适宜培养的花蕾以后，用一种适当的灭菌剂进行表面消毒。然后在无菌条件下将花药连同花丝一起夹出，置于一个无菌的培养皿中，取其中一个花药，在醋酸洋红中涂抹镜检，确定花粉的发育时期，如果发现符合要求，把其余雄蕊上的花药轻轻地从花丝上摘下，水平地放在培养基上进行培养（花药培养）。或者用这些花药制备花药悬浮液，以进行离体的花粉培养。在进行花药培养的时候，必须注意在整个操作过程中不应使花药受到损伤，若受损伤，则应淘汰，因为损伤常常会刺激花粉壁形成愈伤组织。逆境处理促进小孢子脱分化和再分化

培养前对花药进行低温、高温、高糖等逆境处理，对启动小孢子核分裂和愈伤组织形成起促进作用。

这一步是诱导花粉增殖，形成未分化的细胞团块。培养水稻花药一般用中国科学院北京植物所研制改良的N6培养基做基本培养基，添加2毫克/升2，4—D。接种时选用的花药，以处在单核发育中后期的较好，从植株外部形态看是孕穗的早中期。每次接种前要取样检查，镜检花粉，以外部形态对照，然后便于取样。诱导花粉形成愈伤组织花药培养技术诱导愈伤组织分化苗

待愈伤组织长至2～4mm，就可以进行植株的诱导了。这一步仍在N6培养基上进行，但附加物不是2，4——D，而是2毫克/升吲哚乙酸和2毫克/升激动素。方法是将愈伤组织在无菌条件下转移到添加过激动素等的分化培养基上，仍在25℃左右下培养，此时应辅之以光照，自然光最好，日光灯类也可（6h/d）。

已分化得到的小苗，让其继续成长。一般不需再换培养基既可长到一定大小（20cm左右）。然后拔去试管和培养瓶塞，置室温下1～2天，再移至事先准备好的瓦盆或直接移至大田，最初最好用薄膜或玻璃罩稍加维护，保持湿度，移栽时应将苗根上的培养基洗净。有的为了壮苗，在分化小苗芽长至1～2cm时移换一次培养基，在基本培养基的基础上降低蔗糖浓度，并补加1毫克/升吲哚乙酸，待苗在此培养基上长至20cm左右再移出。

使幼苗生长健壮花粉植株的形态发生方式A、器官发生方式花粉粒经均等分裂或不均等分裂，形成多细胞花粉粒，突破花粉壁形成不规则，松散的细胞团，即花粉愈伤组织。愈伤组织继续培养，再生成单倍体植株。如甘蓝、水稻等。B、类胚体发生方式花粉粒经均等分裂或不均等分裂，形成多细胞花粉粒，经进一步培养以胚状体形式释放出来，最后形成植物体。如曼佗罗、烟草等。诱导愈伤组织分化苗

待愈伤组织长至2～4mm，就可以进行植株的诱导了。这一步仍在N6培养基上进行，但附加物不是2，4——D，而是2毫克/升吲哚乙酸和2毫克/升激动素。方法是将愈伤组织在无菌条件下转移到添加过激动素等的分化培养基上，仍在25℃左右下培养，此时应辅之以光照，自然光最好，日光灯类也可（6h/d）。花药培养技术

已分化得到的小苗，让其继续成长。一般不需再换培养基既可长到一定大小（20cm左右）。然后拔去试管和培养瓶塞，置室温下1～2天，再移至事先准备好的瓦盆或直接移至大田，最初最好用薄膜或玻璃罩稍加维护，保持湿度，移栽时应将苗根上的培养基洗净。有的为了壮苗，在分化小苗芽长至1～2cm时移换一次培养基，在基本培养基的基础上降低蔗糖浓度，并补加1毫克/升吲哚乙酸，待苗在此培养基上长至20cm左右再移出。

使幼苗生长健壮花药培养技术形态鉴定细胞学鉴定分子标记鉴定如等位酶、RFLP、RAPD等进行分子标记。单倍体植株的鉴定花药培养技术自然加倍水稻的自然加倍频率较高，常可达50%左右或更高，所以一般不用采取特殊措施，也可得到若干株系，这样效果较好，无副作用。人工加倍目前主要采取秋水仙素处理。使用的药品浓度普遍是0.1～0.2%。处理方法有：小苗浸泡法、生长锥处理和培养基加倍。染色体的加倍花药培养技术秋水仙素加倍染色体的原理秋水仙素（C22H25O6）与正在分裂的细胞接触后，可抑制微管的聚合过程，不能形成纺锤丝，使染色体无法分向两极，从而产生染色体加倍的核。

适宜浓度的秋水仙素溶液，能阻碍纺锤丝的形成，但对染色体结构无明显影响。处理的细胞在一定时间内可恢复正常，重新进行分裂。花药培养及单倍体应用存在的问题1、诱导频率低2、体细胞干扰3、倍性变异4、药壁绒粘毡层对花粉发育的作用5、白化苗问题花药培养技术花粉培养又称小孢子培养。将花粉从花药中分离出来成为分散或游离的状态，通过培养使花粉启动脱分化，进而发育成完整植株的一种技术。始于1953年。

花粉培养的特点

较之花药培养，它对植物的遗传变异和作物育种研究更具有重要意义：1、可排除花药培养中花丝、药壁等体细胞的干扰；2、便于实验因果分析。花药壁组织为花粉脱分化机制分析增加了困难和干扰；3、一个花药中花粉数目巨大，可减少试验用材料；4、花粉除数量多，还具有单细胞、单倍性和较高同步性特点。直接培养直接分离花粉进行培养哺养培养以裂开的花药（同种或异种）做哺育组织进行花粉培养（绒毡层的作用）花粉培养方式花粉培养

花药培养一般在光照（12～18h，5000～10000lx）、28℃和黑暗（12～16h）、22℃周期交替的条件下进行。但最适培养条件因培养系统不同而异，应分别确定。在对培养发生反应的花药中，壁组织逐渐变褐，并且因物种的不同，在培养3～8周后，由于花粉愈伤组织或花粉植株不断生长所施加的压力，药壁破裂，当花粉小植株长到3～5cm高时，将它们一个个的由愈伤组织剥离下来，转移到另外一种培养基上，以促进根系发育。最后，将生根的植株移入小花盆内的土壤中。稻、麦等的花药培养先形成愈伤组织再分化，而烟草则形成胚状体，可直接成苗。以水稻花药培养单倍体植株为例介绍培养方法。

花药接种后，置于25℃左右的条件下培养，不需加光，约一周后，花药开始变为褐色，一般在一个月内可以看到花药裂开长出愈伤组织。愈伤组织出现频率，一般杂种花药比稳定品种高，