相应面法提取工艺分析

响应面优化酶法提取夏枯草总黄酮的工艺研究

开题报告人：王玲燕指导老师：葛立军班级：药学专升本（2）班目录一二三六

五四选题依据和目标研究技术路线研究方案课题关键及难点完成该课题已具备的条件参考文献

七研究进度安排一.选题依据和目标

背景：夏枯草PrunellavulgarisL，别名：麦穗夏枯草、铁线夏枯草等。唇形科，夏枯草属。多年生草本植物,广泛分布于我国河南、安徽、江苏等省。夏枯草含有芸香苷、金丝桃苷等黄酮类成分。具有清肝明目、活血化瘀及抗癌、抗氧化等作用。研究内容：本课题以夏枯草黄酮为研究对象，采用响应面优化酶法，以夏枯草黄酮得率为响应值，进行响应面分析(RSM)，得出夏枯草黄酮提取的最佳工艺条件。意义：酶法提取夏枯草黄酮的工艺较好,所得的黄酮得率较高,为以后的工业生产提供依据。夏枯草单因素试验温度PH酶解时间Box-Behnken的中心组合原理工艺流程酶处理粗提物工艺条件加酶量响应面试验Design-Expert软件三.课题关键问题及难点1.关键问题纤维素酶解是本课题的关键用纤维素酶使其细胞壁破裂，并使其黄酮类成分溶出完全，提高黄酮得率。因为酶具有专一性，作用条件较温和等特点。2.难点响应面法实验条件的优化是本课题的难点。首先必须通过大量的试验数据建立一个合适的数学模型，然后再用此数学模型作图，如何获取误差范围内的实验数据是本实验的难点。四、研究已具备的条件1.前期筹备了大量研究所需资料，及查阅了丰富相关的文献。2.

掌握了相关的实验技能。3.所需仪器，包括离心机、摇床、旋转蒸发仪、水浴箱、电子天平等。4.芦丁、乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、石油醚、硫酸亚铁、纤维素酶

5.经费充足研究工作基础所需仪器和设备所需试剂经费情况五、研究方案5.1最大吸收波长选择和标准曲线制备称取适量芦丁标准品，用乙醇溶解后，加入5%亚硝酸钠溶液0.3mL，振荡摇匀，放置6min；再加入10%硝酸铝0.3mL，振荡摇匀，放置6min；最后加入4%氢氧化钠试液4mL，加乙醇定容至刻度，摇匀，放置15min。在紫外分光光度计200-800nm处进行波长扫描，测定最大吸收波长。精密称取芦丁对照品1mg置50mL容量瓶中，加适量乙醇溶解，并稀释至刻度，摇匀备用。量取对照品溶液0，1，2，3，4，5mL，分别置10mL容量瓶中，加入5%亚硝酸钠溶液0.3mL，振荡摇匀，放置6min；再加入10%硝酸铝0.3mL，振荡摇匀，放置6min；最后加入4%氢氧化钠试液4mL，加乙醇定容至刻度，摇匀，放置15min。采用分光光度法，在最大吸收波长处测定吸光度，以对照品量（mg/mL）为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。1.最大吸收波长的选择2.标准曲线的制备五、研究方案5.2总黄酮提取方法和其含量测定准确称取5.00g夏枯草，用纤维素酶预处理，酶解后灭活，并离心。然后加入一定体积某浓度的乙醇，在一定温度下加热回流一定的时间，过滤。弃去滤渣，测量并记录滤液体积V，得到夏枯草总黄酮的乙醇溶液，即待测液。取0.5mL待测液，加入5%亚硝酸钠溶液0.3mL振荡摇匀，放置6min后加入10%硝酸铝溶液0.3mL振荡摇匀，放置6min后加入4%氢氧化钠溶液4mL，加乙醇定容至刻度，摇匀，放置15min，用分光光度法在510nm测定吸光度值，由标准曲线计算得总黄酮含量。总黄酮提取总黄酮含量五、研究方案（1）酶的种类对夏枯草黄酮得率的影响（2）加酶量对夏枯草黄酮得率的影响（3）

pH值对夏枯草黄酮得率的影响（4）酶解温度对夏枯草黄酮得率的影响（5）酶解时间对夏枯草黄酮得率的影响5.3单因素试验表6-1酶的种类对黄酮提取率的影响酶的种类纤维素酶果胶酶蛋白酶空白对照(醇提)黄酮得率(%)表6-2加酶量对黄酮提取率的影响加酶量U/ml1234黄酮得率(%)表6-3PH对黄酮提取率的影响PH3.54.04.555.5黄酮得率(%)表6-4酶解温度对黄酮提取率的影响酶解温度(℃)4045505560黄酮得率(%)表6-5酶解时间对黄酮提取率的影响酶解时间11.522.53黄酮得率(%)五、研究方案5.4响应面试验系统考察酶解法的工艺参数，根据已有的资料及实际情况，选用加酶量（X1），酶解温度（X2），pH（X3），酶解时间（X4），作为考察因素，具体参数详见因素水平表（表1），以测得的浸提取样品中总黄酮含量为考察指标，选用响应面实验表（表3）提取，得到相应供试液。表6-6因素水平水平因素X1加酶量(U/ml)X2酶解温度(℃)X3pHX4酶解时间(h)-114541.502504.52135552.5表6-7响应面实验表试验X1加酶量(U/ml)X2酶解温度(℃)X3pHX4酶解时间(h)黄酮得率(%)1-1-1002-110031-10041100500-1-1600-117001-1800119-100-110-100111100-1121001130-1-10140-1101501-1016011017-10-1018-10101910-10201010210-10-1220-10123010-12401012500002600002700002014.12—2015.04查找资料，文献综述2015.04—2015.05开题报告，实验准备2015.05—2015.09完成实验，整理数据2015.09—2015.11撰写论文，论文答辩六.研究进度安排

1.王兰,赵麟.响应面分析法优化柿叶总黄酮提取工艺[J].安徽农业科学.2011(03).2.于敬,周晶.生物酶解技术在中药提取中的应用[J].现代药物与临床,2010,25(5):340-344.3.薛明，冯怡，徐德生．夏枯草化学成分及药理作用的研究概况[J]．江苏中药，2005，26(5)：55--56．4.