高效液相色谱仪的原理及应用

高效液相色谱仪的原理及应用2023/2/5一、高效液相色谱法的定义和分类流动相是液体的色谱称为液相色谱（LC）。在液相色谱中，采用颗粒十分细的高效固定相，并采用高压泵输送流动相，全部工作通过仪器完成，这种色谱称为高效液相色谱（HPLC）

。第一节高效液相色谱法原理2023/2/5一、高效液相色谱法的定义和分类液相色谱：平板色谱和柱色谱。液相色谱：分配色谱、液固色谱、离子交换色谱、尺寸排阻色谱。气相色谱：挥发性物质，不能用于热不稳定物质分析。液相色谱：可分析各种物质，热不稳定物质，但流动相有毒，运行操作比GC难。能用GC就用GC。2023/2/5二、液相色谱中常用术语和参数只针对HPLC特有的，其余术语与第三章同。粒间体积（V0）：色谱柱填充剂颗粒间隙中流动相所占有的体积。孔体积（Vp）

：色谱柱中多孔填充剂的所有孔洞中流动相所占有的体积。2023/2/5二、液相色谱中常用术语和参数柱外体积（Vext）：从进样系统到检测器之间色谱柱以外的液路部分中流动相所占有的体积。液体总体积（Vtot）

：粒间体积、孔体积和柱外体积之和。淋洗体积（V）：从进样开始计算的通过色谱柱的实际淋洗体积。2023/2/5三、反相高效液相色谱由非极性固定相和极性流动相所组成的液相色谱体系。其代表性的固定相是十八烷基键合硅胶(ODS柱），代表性的流动相是甲醇和乙腈。是当今液相色谱的最主要分离模式。溶质在填料表面的烃类和流动相之间进行分配。溶质在吸附于填料表面烃类上的“改良固定相”和流动相之间进行分配溶质被吸附于填料表面烃类分子上，类似吸附色谱。2023/2/5四、正相高效液相色谱是由极性固定相和非极性（或弱极性）流动相所组成的HPLC体系。其代表性的固定相是改性硅胶、氰基柱等，代表性的流动相是正己烷。吸附色谱也属正相HPLC。溶剂洗脱强度近似地随溶剂的介电常数增加而增大，洗脱能力越弱，溶质在柱上保留时间越长。2023/2/5第二节高效液相色谱仪的组成Agilent11002023/2/51.输液系统2.进样系统3.分离系统4.检测系统5.数据处理系统一高效液相色谱仪系统高压泵流动相溶剂废液色谱柱进样口检测器2023/2/51、输液系统

贮液装置脱气装置高压输液泵梯度淋洗系统输液系统的功能:

1.提供足够的驱动力使流动相通过填充柱2.使流动相流量精确和稳定3.使流动相组成精确2023/2/5

分析用高效液相色谱的流动相贮罐，常用1L的锥形瓶加一个电磁搅拌器，在连接到泵入口处的管线上要加一个过滤器。

(1)贮液装置2023/2/5(2)脱气装置用于脱去流动相中的溶解气体，流动相先经过脱气装置再输送到色谱柱。脱气机、超声脱气、真空脱气等。

2023/2/5(3)高压输液泵主要部件之一，压力：150～350×105

Pa。为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（<10μm），液体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高速是高效液相色谱的特点之一。μL/min~几千mL/min应具有压力平稳、流量稳定可调、耐腐蚀等特性2023/2/5(4)梯度淋洗装置2023/2/5等度洗脱输液泵进样器色谱柱柱温箱检测器单一或混合溶剂2023/2/5分析时间长分离度差

MeOH/H2O=6/4MeOH/H2O=8/2等度洗脱怎样解决呢？2023/2/5梯度洗脱

A泵进样器色谱柱柱温箱检测器

B泵AB时间B浓度2023/2/595%30%MeOH梯度洗脱优点：可提高分离度、缩短分离时间、降低最小检测量和提高分离精度。2023/2/5

流路中为高压力工作状态，通常使用耐高压的六通阀进样装置：2、进样系统2023/2/5

高效分离柱直型不锈钢管，内径1～8mm，柱长5～40cm。3、分离系统2023/2/5色谱柱填料C18色谱柱十八烷基硅基化学键合到多孔硅胶或陶瓷微粒SIL多孔硅胶微粒ZORBAXEclipseXDB-C8辛基硅烷化学键合到多孔硅胶微粒上2023/2/5柱的保养：1.柱子在任何情况下不能碰撞、弯曲或强烈震动；2.当柱子和色谱仪联结时，阀件或管路一定要清洗干净；3.要注意流动相的脱气；4.避免使用高粘度的溶剂作为流动相；5.进样样品要预先提纯；6.严格控制进样量；7.每天分析工作结束后，要清洗进样阀中残留的样品；8.每天分析测定结束后，都要用适当的溶剂来清洗柱；9.若分析柱长期不使用，应用适当有机溶剂保存并封闭；2023/2/51）柱压低于150kg/cm2（15cm色谱柱）2）柱温在40℃左右，最高使用温度为50℃3）流动相pH使用范围为2～7.5ODS柱的使用注意点：2023/2/5目前最常用的检测器主要有：紫外-可见检测器荧光检测器电化学检测器折光示差检测器蒸发光散射检测器质谱检测器4、检测系统2023/2/5

a.紫外检测器应用最广，对大部分有机化合物有响应。

UV灯光栅流通池参考二极管采样二极管截止棱镜氧化钬滤光片狭缝镜2镜12023/2/5b.光电二极管阵列检测器紫外检测器的重要进展；光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图。2023/2/5c.荧光检测器高灵敏度、高选择性；对多环芳烃、维生素B、黄曲霉素、卟啉类化合物、农药、药物、氨基酸、甾类化合物等有响应。2023/2/5d.质谱检测器：2023/2/5二、高效液相液相色谱固定相和流动相

1.固定相（1）全多孔型担体

由氧化硅、氧化铝、硅藻土等制成的多孔球体；早期采用100μm的大颗粒，表面涂渍固定液，性能不佳已不多见；现采用10μm以下的小颗粒，化学键合制备柱填料；（2）表面多孔型担体（薄壳型微珠担体）

30～40μm的玻璃微球，表面附着一层厚度为1～2μm的多孔硅胶。表面积小，柱容量底；2023/2/5（3）化学键合固定相化学键合固定相:目前应用最广、性能最佳的固定相；

a.硅氧碳键型：≡Si—O—C

b.硅氧硅碳键型：≡Si—O—Si—

C

稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广；

c.硅碳键型：≡Si—C

d.硅氮键型：≡Si—N2023/2/52.流动相

按流动相组成分：单组分和多组分；按极性分：极性、弱极性、非极性；按使用方式分：固定组成淋洗和梯度淋洗。常用溶剂：己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。2023/2/5流动相选择

在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。采用正相液-液分配分离时：首先选择中等极性溶剂，若组分的保留时间太短，降低溶剂极性，反之增加。也可在低极性溶剂中，逐渐增加其中的极性溶剂，使保留时间缩短。常用溶剂的极性顺序：水(最大)>甲酰胺>乙腈>甲醇>乙醇>丙醇>丙酮>二氧六环>四氢呋喃>甲乙酮>正丁醇>乙酸乙酯>乙醚>异丙醚>二氯甲烷>氯仿>溴乙烷>苯>四氯化碳>二硫化碳>环己烷>己烷>煤油(最小)2023/2/5

1、环境中有机氯农药残留量分析

固定相：薄壳型硅胶(37～50m)流动相：正己烷流速：1.5mL/min色谱柱：50cm2.5mm(内径)检测器：折光示差检测器

可对水果、蔬菜中的农药残留量进行分析。第三节HPLC的应用2023/2/52、稠环芳烃的分析

稠环芳烃多为致癌物质。固定相：十八烷基硅烷化键合相流动相：20%甲醇-水～100%甲醇线性梯度淋洗，2%/min

流速：1mL/min

柱温：50ºC柱压：70104Pa

检测器：紫外检测器2023/2/5例：液相色谱法测定食品中苯并(a)芘原理：样品经过提取、皂化以及柱层析净化，除去脂肪类物质、色素等杂质后，再通过液相色谱仪中的色谱柱，将苯并芘从多环芳烃物质中分离出来。求出样品中苯并芘的含量。仪器：(1)液相色谱仪：色谱柱：ODS柱，柱长250mm，Φ4mm；

柱温：30℃；流动相：75％甲醇；流速：2mL／min。(2)检测器：荧光检测器，激发波长369nm，荧光波长405nm。2023/2/5操作步骤：(1)定性测定用微量注射器吸取一定量的苯并芘标准溶液和样液，注入色谱仪内，根据苯并芘的出峰保留时间和样品中加标准样产生重叠的情况进行定性。(2)标准曲线的绘制用微量注射器准确吸取每1mL含1μg的苯并芘标准溶液1、2、3、4、5uL按照上述实验条件进行操作，以获得相应的色谱图。然后，分别测量各个色谱的峰面积。以峰面积为纵坐标，标准苯并芘量为横坐标，绘制标准曲线。(3)样品的测定：在上述实验条件下，吸取一定量经过柱净化的样品提取液，注入液相色谱仪中进行分离、分析，测得峰面积，然后从标准曲线上查出相应于此面积的苯并芘含量。2023/2/5

Waters515高效液相色谱泵，Wa