测定α淀粉酶活力的方法

试验五 激活剂、抑制剂、温度及PH对酶活性的影响一、目的要求 通过试验加深对酶性质的生疏，了解测定α-淀粉酶活力的方法。二、试验原理生物催化剂催化生化反响时具有：催化效率好、有高度的专一性、反响条件温顺、催化活力与辅基，辅酶，金属离子有关等特点。能提高酶活力的物质，称为激活剂。激活剂对酶的作用有肯定的选择性，其种类多为无机离子和简洁的有机化合物。使酶的活力中心的化学性质发生变化，导致酶的催化作用受抑制或丧失的物质称为酶抑制剂。氯离子为唾液淀粉酶的激活剂，铜离子为其抑制剂。应留意的是激活剂和抑制剂不是确定的，有些物质在低浓度时为某种酶的激活剂，而在高浓度时则为该酶的30%浓度时可抑制唾液淀粉酶的活性。酶促反响中，反响速度到达最大值时的温度和PH值称为某种酶作用时的最适温度和PH值。温度对酶反响的影响是双重的：一方面随着温度的增加，反响速度也增加，直至最大反响速度为止；另一方面随着温度的不断上升，而使酶逐步变性从而使反响速度降低。同样，反响中某一PH范围内酶活力可达最高，在最适PH的两侧活性突然下降，其变化趋势呈钟形曲线变化。食品级α-淀粉酶是一种由微生物发酵生产而制备的微生物酶制剂，主要由枯草芽孢杆菌、PH、对α-淀粉酶属水解酶，作为生物催化剂可随机作用于直链淀粉分子内部的α-1,4糖苷键，快速地将直链淀粉分子切割为短链的糊精或寡糖，使α-淀粉酶为液化淀粉酶。α-淀粉酶不能水解淀粉支链的α-1,6糖苷键，因此最终水解产物是麦芽糖、葡萄糖和α-1,6本试验通过淀粉遇碘显蓝色，糊精按其分子量的大小遇碘显紫蓝、紫红、红棕色，较小的〔少于6个葡萄糖单位α-淀粉酶作用于淀粉基质的水解过程，从而了解酶的性质以及动力学参数。三、激活剂和抑制剂对唾液淀粉酶活力的影响〔一〕试剂及材料1、1：30唾液淀粉酶配置 用蒸馏水漱口，1min后收集唾液，以1：30倍蒸馏水稀释。2、0.2%可溶性淀粉 称取可溶性淀粉0.2g，预加20mL蒸馏水调匀，然后倒入80mL沸水中，连续煮沸至溶液透亮，冷却后补水至100mL。3、1%NaCl溶液 称取1.0g氯化钠，加水溶解稀释至100mL。4、1%CuSO4溶液 称取1.0g硫酸铜，加水溶解稀释至100mL。5、标准稀碘液 称取11g碘，22g碘化钾，置研钵中，参加适量的水研磨至碘完全溶解，并加水稀释定容至500mL。吸取2mL上述碘液，参加10g碘化钾，用水稀释至500mL。〔二〕仪器设备 电热恒温水浴锅。〔三〕操作方法取试管3根，编号后按下表配置试验样液。试管 0.2%可溶 1%NaC 1%CuSO4 蒸馏水 混匀，放入 1：30唾液淀粉酶序号性淀粉l37水浴中12.0mL1.0mL//保温10min。1.0mL22.0mL/1.0mL/马上参加唾1.0mL32.0mL//1.0mL液淀粉酶。1.0mL用点滴管并不断从试管中吸取样液于比色白瓷板，用稀碘液检验试管内淀粉被淀粉酶水解的程度，记录各试管内样液遇碘不显蓝色的先后挨次，解释试验现象的缘由。四、温度与PH值对α-液化淀粉酶活力的影响〔一〕试剂与材料12%可溶性淀粉溶液 称取可溶性淀粉2.0g〔预先在105℃烘干预加20mL蒸馏水调匀，然后倾入80mL沸水中煮沸至溶液透亮，冷却后定容至100mL。2、PH4.0、5.0、6.0、7.0、8.0磷酸氢二钠–柠檬酸缓冲溶液〔1〕0.2mol/mLNa2HPO4 称取35.60gNa2HPO4.2H2O100mL。〔2〕使用酸度计，用柠檬酸调整至所需的PH值。3、供试酶液的制备 称取固体α-液化淀粉酶1.00g，参加PH6.0磷酸氢二钠–柠檬酸缓冲溶液100mL(缓冲液的参加量视酶活力大小而定掌握酶解反响在5-10min内完成)，于40℃恒温水浴中活化0.5小时然后用3000rpm/min离心机离心分别5min，酶提取液于冰箱保存，供试验用。4、标准比色液〔CoCl.6H2O〕40.2439g0.4748500mL。乙液：称取铬黑T40.00mg，溶解并定容至100mL。使用时取甲液40.0mL、乙液5.0mL，混合。混合比色液宜放置冰箱保存，使用7天后重配置。5、标准稀碘液。〔二〕仪器设备 电热恒温水浴锅。〔三〕操作方法12、不同温度对α-液化淀粉酶活力的影响取4根Φ25×200mm试管，按下表配制反响溶液。试管序号试管序号12342%可溶性淀粉20.0mL20.0mL20.0mL20.0mLPH6.0缓冲液5.0mL5.0mL5.0mL5.0mL把四根试管分别放入50℃、60℃、70℃、80℃恒温水浴中预热10min分别加供试酶液0.5mL0.5mL0.5mL0.5mL反响完成时间记50℃60℃70℃80℃录〔min〕参加供试酶液后，马上用秒表或手表记时，充分要匀，定时用点滴管从各反响试管中分别吸取1-2滴反响液，滴入预先盛有2/3稀碘液的比色白瓷板孔穴内，从淀粉遇碘显色的变化状况，跟踪淀粉在淀粉酶作用下被水解的过程，当穴内颜色反响由紫色渐渐变为红棕色，与标准比色液的颜色一样时，即达反响终点，记录酶解反响完成所需时间。3、不同PH值对α-液化淀粉酶活力的影响取5根Φ25×200mm试管，按下表配制反响溶液。序号2%可溶性淀粉缓冲溶液供试酶液 反响完成时间记〔min〕120mLPH4.0 5.0恒温水0.5mLmL浴60℃320mLPH6.0 5.0mL预 热10min。0.5mL420mLPH7.0 5.00.5mLmL520mLPH8.0 5.00.5mLmL试管其它操作与温度对酶活力影响试验一样。试管五、结果计算和争论淀粉酶活力单位定义为 在肯定条件下，1g酶制剂1小时内液化可溶性淀粉的克数。酶活力单位(U/g)=60200.021 nt 0.5——可溶性淀粉的用量m；——酶解反响完成所需的时间mi；——测定时稀释酶液用量m；——可溶性淀粉溶液的浓度；n——酶制剂稀释倍数1、不同温度对α-液化淀粉酶活力影响的结果记录试验结果试验结果50℃60℃70℃80℃2、不同pH值对α-液化淀粉酶活力影响的结果记录试验结果试验结果pH4.0pH6.0pH7.0pH8.0分别以PH值、温度为横坐标，以酶活力单位为纵坐标，绘制PH值—酶活力单位、温度—酶活力单位图。争论分析试验结果。六、思考题1、从试验操