蛋白质的化学修饰

关于蛋白质的化学修饰第一页，共三十六页，2022年，8月28日主要内容化学修饰的原理蛋白质侧链的修饰蛋白质肽链的交联蛋白质化学修饰的应用蛋白质化学修饰的局限性第二页，共三十六页，2022年，8月28日一、化学修饰的原理概念：从广义上说，凡是通过化学基团的引入或除去，而使蛋白质共价结构发生改变，都可称为蛋白质的化学修饰。有的情况下化学结构的改变并不影响蛋白质的生物学活性(称非必需部分的修饰);但大多情况下将导致生物活性的改变(如下降以至完全丧失)。影响蛋白质化学修饰反应进程的因素：1.蛋白质功能基的反应性；2.修饰剂的反应性。第三页，共三十六页，2022年，8月28日主要内容化学修饰的原理蛋白质侧链的修饰蛋白质肽链的交联蛋白质化学修饰的应用蛋白质化学修饰的局限性第四页，共三十六页，2022年，8月28日二、蛋白质侧链的修饰蛋白质侧链的修饰主要是通过选择性的试剂或亲和标记试剂与蛋白质侧链上特定的功能基团发生化学反应而实现的。其重要作用是用于探测活性部位的结构。理想情况下,修饰试剂只是选择性地与某一特定的残基反应,很少或几乎不引起蛋白质分子构象变化。在20种常见AA残基中，仅具极性的侧链基团才能够进行化学修饰，这些基团的反应性取决于其亲核性。第五页，共三十六页，2022年，8月28日蛋白质侧链的修饰2.1特定的AA残基侧链基团的反应试剂

（4种方法）

2.2巯基的化学修饰2.3氨基的化学修饰（3种方法）2.4羧基的化学修饰2.5咪唑基的化学修饰2.6二硫键的化学修饰第六页，共三十六页，2022年，8月28日2.1特定的AA残基侧链

基团的反应试剂（4种）2.1.1酰化及其相关反应

这类化学修饰试剂如乙酰咪唑、酸酐磺酰氯、硫代三氟乙酸乙酯和O-甲基异脲等，在室温(20ºC~25ºC)，pH4.5~9.0的条件下可与蛋白质某些侧链基团如-NH2、-OH、-SH及酚基等发生酰基化反应。第七页，共三十六页，2022年，8月28日2.1.2烷基化反应

此类试剂(如DNFB、碘代乙酸、碘代乙酰胺、苯甲酰卤代物、碘甲烷等)常带有活泼的卤素原子，因其电负性而使烷基带部分正电荷，易于导致蛋白质分子的亲核基团(如-NH2、-SH、-COOH、-SCH3和咪唑基

)发生烷基化。第八页，共三十六页，2022年，8月28日2.1.3氧化和还原反应H2O2、N-溴代琥珀酰亚胺等具有很强氧化性，能将侧链基团(-SH\-SCH3\吲哚基\咪唑基和酚基)氧化,往往易使肽链断裂(故要控制好氧化条件);光敏剂存在下的光氧化是比较温和的氧化作用。2-巯基乙醇、巯基乙酸和二硫苏糖醇(DTT)等主要用于-S-S-的还原剂。连四硫酸钠或钾是一温和的氧化剂，常用于-SH的可逆保护剂。第九页，共三十六页，2022年，8月28日2.1.4芳香环取代反应蛋白质AA残基的酚羟基在3和5位上易于发生亲电取代的碘化和硝化反应。这类修饰反应的典型例子为四硝基甲烷(TNM),

可以作用于Tyr的酚羟基,形成3-硝基Tyr衍生物。这种产物有特殊光谱，可用于直接的定量测定。第十页，共三十六页，2022年，8月28日蛋白质侧链的修饰2.1特定的AA残基侧链基团的反应试剂

（4种方法）

2.2巯基的化学修饰2.3氨基的化学修饰（3种方法）2.4羧基的化学修饰2.5咪唑基的化学修饰2.6二硫键的化学修饰第十一页，共三十六页，2022年，8月28日2.2巯基的化学修饰巯基具有很强的亲核性，是蛋白质分子中最容易反应的侧链基团。常用的修饰剂有3种：1.烷基化试剂特别是碘乙酸和碘乙酰胺是很重要的-SH修饰剂。修饰产物相当稳定，易于分析。此类试剂还能与Met\Lys\His反应。第十二页，共三十六页，2022年，8月28日2.有机汞试剂是最早使用的-SH修饰剂之一，其中最常用的是对氯汞苯甲酸，它与-SH形成的衍生物在250nm处有最大吸收，可容许低浓度蛋白质的光谱定量分析。其中2-氯汞-4-硝基苯酚(MNP)与蛋白质分子中侧链-SH反应很快,并在395nm处产生1个负差吸收峰.3.-SH的氧化也是一种专一性很高的化学修饰手段.H2O2一般用于氧化-SH形成-S-S-或在较大量时形成磺酸，也可以生成次磺酸。第十三页，共三十六页，2022年，8月28日蛋白质侧链的修饰2.1特定的AA残基侧链基团的反应试剂

（4种方法）

2.2巯基的化学修饰2.3氨基的化学修饰（3种方法）2.4羧基的化学修饰2.5咪唑基的化学修饰2.6二硫键的化学修饰第十四页，共三十六页，2022年，8月28日2.3氨基的化学修饰氨基的修饰可分为三类：引入正电荷的修饰；电荷消失的修饰；引入负电荷的修饰。第十五页，共三十六页，2022年，8月28日2.3.1引入正电荷的修饰Lys--NH2以非质子化形式存在时很活泼,是蛋白质分子中亲核反应活性很高的基团，可被选择性修饰。Lys修饰后侧链留下可电离的带正电的基团。还原烷基化：醛与Lys侧链反应形成希夫碱，再用硼氢化钠（NaBH4）还原希夫碱，得到稳定衍生物。

P-NH2+RCHOP-N=CHRP-NH-CH2R-H2O+H2O[H]第十六页，共三十六页，2022年，8月28日2.3.2电荷消失的修饰这类试剂可抑制Lys--NH2的质子化,使形成的衍生物不带电。1.乙酰化：在微碱性pH下，氨基与乙酸酐反应生成乙酰化衍生物。2.芳香化：三硝基苯磺酸与氨基作用,生成的衍生物为黄色，可定量测定-NH2。

(其它:DNFB\DNS)三硝基苯磺酸(TNBS)第十七页，共三十六页，2022年，8月28日2.3.3引入负电荷的修饰1.乙酰化:

此反应类似于乙酸酐与氨基反应,但酸酐(如琥珀酸酐)所带负电荷全部引入到侧链上。2.烷基化：第十八页，共三十六页，2022年，8月28日蛋白质侧链的修饰2.1特定的AA残基侧链基团的反应试剂

（4种方法）

2.2巯基的化学修饰2.3氨基的化学修饰（3种方法）2.4羧基的化学修饰2.5咪唑基的化学修饰2.6二硫键的化学修饰第十九页，共三十六页，2022年，8月28日2.4羧基的化学修饰由于羧基在水溶液中的化学性质,使得蛋白质分子中Glu和Asp的修饰很有限,产物一般是酯类或酰胺类.目前最常用的标准方法,在比较温和的条件下就可进行胃蛋白酶与[14C]硼氟化三甲洋盐在pH5时酶完全失活,研究表明两-COOH为该酶必需基团第二十页，共三十六页，2022年，8月28日蛋白质侧链的修饰2.1特定的AA残基侧链基团的反应试剂

（4种方法）

2.2巯基的化学修饰2.3氨基的化学修饰（3种方法）2.4羧基的化学修饰2.5咪唑基的化学修饰2.6二硫键的化学修饰第二十一页，共三十六页，2022年，8月28日2.5咪唑基的化学修饰His残基的咪唑基可通过N原子的烷基化或C原子的亲核取代来进行修饰。焦碳酸二乙酯(DPC)是最常用的His残基的修饰试剂,在近中性时专一性较好,使His残基的咪唑基上1个N羧乙基化,并使得在240nm处的光吸收增加。在碱性条件下该取代反应是可逆的。第二十二页，共三十六页，2022年，8月28日蛋白质侧链的修饰2.1特定的AA残基侧链基团的反应试剂

（4种方法）

2.2巯基的化学修饰2.3氨基的化学修饰（3种方法）2.4羧基的化学修饰2.5咪唑基的化学修饰2.6二硫键的化学修饰第二十三页，共三十六页，2022年，8月28日2.6二硫键的化学修饰同-SH类似,-S-S-具有其特有的特性,可用来进行特异的修饰,通常是通过还原的方法.这些方法通常与某些-SH修饰方法结合,以阻止再氧化成-S-S-或计算断裂开的-S-S-数目。常用的有:巯基乙醇(具高度选择性和长的半衰期.但要有变性剂,且使用大大过量的巯基乙醇)、Cleland试剂包括二硫苏糖醇(DTT)及其差向异构体二硫赤藓糖醇(DTE)(勿需过量还原剂)。-S-S-经还原成为-SH，一般情况下很容易自动氧化，故需经过羧甲基处理防止重新氧化。第二十四页，共三十六页，2022年，8月28日主要内容化学修饰的原理蛋白质侧链的修饰蛋白质肽链的交联蛋白质化学修饰的应用蛋白质化学修饰的局限性第二十五页，共三十六页，2022年，8月28日三、蛋白质肽链的交联双功能试剂：指具有两个反应活性部位，可在相隔较近的两个氨基酸残基间搭桥、形成多肽链内、链间或蛋白质分子间的交联，而不引起蛋白质构象的重大改变的试剂。双功能试剂还可将一蛋白质分子偶联到一个化学惰性的水不溶性的生物大分子上，形成固定化蛋白质。表征交联在一起的氨基酸残基或蛋白质,可提供许多关于蛋白质构象和蛋白质间相互作用的信息。第二十六页，共三十六页，2022年，8月28日交联剂的应用研究蛋白质的折叠:

当蛋白质浓度很大时,交联剂也能形成分子间的交联键,使蛋白质对变性趋于稳定。

如Rajput等用戊二醛将胰蛋白酶和胰糜蛋白酶交联在一起。这种固定化的杂化酶的优点是，显著地降低了杂化酶中胰蛋白酶的自溶作用，同时也使反应器的体积大大缩小。酶分子内的交联常可提高酶分子构象的稳定性，防止酶失活。因此，设法增加酶分子表面交联键的数目是酶固定化的方法之一。第二十七页，共三十六页，2022年，8月28日3.3交联剂的应用测定蛋白质亚基的量:

如用辛二亚氨酸二甲酯作用于齐聚体蛋白质,使在同一亚基内和多亚基间的Lys残基之间形成交联,再进行SDS,则可测定其分子量和亚基的数目,以阐明亚基的组合情况(如单体、二聚体还是三聚体等）。用交联剂还能测定蛋白质上残基间的距离。如用跨度为0.37~1.45nm的一系列亚氨酯交联糖原磷酸化酶b,再结合SDS系统测定出,在有效交联形成的四聚体上的两Lys残基间距离约为0.8nm。第二十八页，共三十六页，2022年，8月28日主要内容化学修饰的原理蛋白质侧链的修饰蛋白质肽链的交联蛋白质化学修饰的应用蛋白质化学修饰的局限性第二十九页，共三十六页，2022年，8月28日五、蛋白质化学修饰的应用5.1用于测定蛋白质分子中某种氨基酸的数量研究蛋白质性质时，常需测定其中含有某种AA的数量。当然用AA分析法可得到此数据。但当只需知道某一AA的数量,不需知道其它AA数量时,则应建立仅对某一氨基酸的快速灵敏的分析方法,实际上是用于蛋白质定量化学修饰。常用且灵敏度高的方法是对氯汞苯甲酸与-SH作用;三硝基苯磺酸与-NH2作用。用荧光法可测定微量蛋白质,

灵敏度高，常用荧光胺。第三十页，共三十六页，2022年，8月28日5.2在蛋白质序列分析中的应用用于测定蛋白质及多肽化学结构的许多方法都是以蛋白质化学修饰为基础的。A.控制酶解程度:如常用胰蛋白酶专一水解碱性氨基酸(Arg和Lys)的-COOH所形成的肽键。若要使胰蛋白酶只水解Arg所形成的肽键,可用三氟乙酰化法将Lys--NH2保护起来,使它转变为酶不能水解的产物。B.化学裂解:最理想且普遍采用的是CNBr专一性裂解Met的-COOH所形成的肽键。第三十一页，共三十六页，2022年，8月28日5.3确定蛋白质残基的功能化学修饰结合保护实验可研究底物或其它配位体对修饰速度和程度影响。如用磷酸吡哆醛修饰Fru-6-P激酶时,发现有两个Lys被修饰,酶活力丧失;而在Fru-2,6-PP存在时,则可减弱修饰作用,保护激酶活力。若修饰的可逆性与生物功能的改变有对应关系,也可为确定某一残基的可能功能提供有利证据;用于蛋白质变构部位上必需AA残基的