cas9培训技术讲座

CRISPR/Cas9:生物体和细胞基因组编辑的革命性技术YSYBiotech2014年4月10日敲降（knockdown）过表达（overexpression)RNA干扰（RNAi）MO敲降（mophorlinoKD）功能缺失（过少）（lossoffunction)功能获得（过多）（gainoffunction)全身性过表达(ubiquitoustransgenic)

组织特异性过表达(tissuespecifictransgenic)基因位点特异性过表达（knockin）全身性敲除（conventionalKO）条件性敲除

（conditionalKO）敲除（knockout）基因功能的研究敲降（RNAi）2002年Science十大科学进展之首基因敲除(GeneKnockout)

基因敲除

:将生物体（或细胞）中的基因改变成无功能性基因（无效等位基因：nullallele）的一种遗传学技术【Ageneknockout(KO)isagenetictechniqueinwhichoneofanorganism‘sgenesismadeinoperative.

/wiki/Gene_knockout

】研究基因功能的金标准定向的基因敲除（TargetedDisruptionofAGene)基因敲除突变体（广义上）的获得：1、随机突变（如ENU饱和突变等）需要通过位置克隆（positionalcloning）确定突变基因；费时费力。2、定向的基因敲除精确传统上定向的基因敲除是通过基因打靶（genetargeting）技术实现的基因打靶(GeneTargeting)基因打靶是利用同源重组原理改变细胞或生物体内源性基因的遗传学技术【Genetargetingisagenetictechniquethatuseshomologousrecombinationtochangeanendogenousgene.

/wiki/Gene_targeting】特点（基因修饰精确、遗传背景清晰干净）：1、删除基因2、去除外显子3、定点插入一个基因（Knockin）4、引入点突变5、就制作删除基因或外显子而言，可实现永久性(conventional,

全身性)或条件性（conditional,

组织或时空）特异性的基因敲除起始，以酵母为模式生物，建立了一套外源基因插入、修饰、标记、同源重组转化子筛选系统的建立、载体同源序列DNA（靶标）双链断裂提高同源重组效率的利用

20世纪80年代/wiki/File:GeneTargeting.png正负筛选策略MarioRenatoCapecchi

MartinJohnEvans

OliverSmithies

1989年依赖于胚胎干细胞的传统的基因打靶/info/targvectdesign.htmlNextpage百万分之一的同源重组率；打靶载体含正负筛选标记。向酵母学习传统的基因打靶（GeneTargeting）的技术瓶颈

1、需要胚胎干细胞只有小鼠上能建立胚胎干细胞大鼠的胚胎干细胞虽有报道，但没有后续的工作2、极低的同源重组率干细胞同源重组发生率较高，但也只有百万分之一

通过将基因敲除的个体或细胞与正常的个体或细胞相比较，研究者可以揭示特定基因的功能。基因敲除技术特点：在基因组水平上将目标基因修改成无效等位基因，遗传背景干净清晰，是研究基因功能的金标准。敲降（RNAi或MOKD）的缺点：1、仅部分抑制该基因的功能；2、在转录后（包括翻译）水平上下调基因表达，不能遗传3、非特异性强；脱靶效率高如何突破基于传统的基因打靶（GeneTargeting）实现基因敲除（GeneKnockout）的技术瓶颈？向细胞学习！DNADamageandDNArepairDNAdamage,duetoenvironmentalfactorsandnormalmetabolicprocessesinsidethecell,occursatarateof1,000to1,000,000molecularlesionspercellperday

/wiki/DNA_repairDouble-strandBreaksandRepairDouble-strandbreaks(DSBs),inwhichbothstrandsinthedoublehelixaresevered,areparticularlyhazardoustothecellbecausetheycanleadtogenomerearrangements.ThreemechanismsexisttorepairDSBs:1)non-homologousendjoining(NHEJ)2)microhomology-mediatedendjoining(MMEJ),3)homologousrecombination(HR)Non-homologousendjoining(NHEJ)NHEJ(coinedin1996byMooreandHaber)isreferredtoas"non-homologous"becausethebreakendsaredirectlyligatedwithouttheneedforahomologoustemplate.Itisaerror-pronerepair.NHEJtypicallyutilizesshorthomologousDNAsequencescalledmicrohomologiestoguiderepair.Thesemicrohomologiesareoftenpresentinsingle-strandedoverhangsontheendsofDSB.Whentheoverhangsareperfectlycompatible,NHEJusuallyrepairsthebreakaccurately.Impreciserepairleadingtolossofnucleotidescanalsooccur,butismuchmorecommonwhentheoverhangsarenotcompatible.InappropriateNHEJcanleadtotranslocationsandtelomerefusion,hallmarksoftumorcells./wiki/Non-homologous_end_joiningHomologousrecombination(HR)

AtypeofgeneticrecombinationinwhichnucleotidesequencesareexchangedbetweentwosimilaroridenticalmoleculesofDNA.Occurringduringmeiosis.WidelyusedbycellstoaccuratelyrepairDSB.HRisalsousedinhorizontalgenetransfertoexchangegeneticmaterialbetweendifferentstrainsandspeciesofbacteriaandviruses.

/wiki/Homologous_recombinationTheNHEJandHROccurringnearbytheDSBsitesGenetargetingdependsonDSBsitesspontaneousoccurringintargetgenes.IncreasingDSBsitesdefinitelyimprovetheefficiencyofgenetargetingorgeneknockout.MethodstoCreateDSBnearbytheTargetGene

(Restrictionenzyme:anenzymethatcutsDNAatspecificrecognitionnucleotidesequencesknownasrestrictionsites.)制备一个人工的限制性内切酶Doyonetal,2008.Heritabletargetedgenedisruptioninzebrafishusingdesignedzinc-fingernucleases.NatBiotechnol.2008Jun;26(6):702-8.Epub2008May25.Mengetal,Targetedgeneinactivationinzebrafishusingengineeredzinc-fingernucleases.NatBiotechnol.2008Jun;26(6):695-701

GenomeEditingUsingZFNTechnologyWhatIsZFNTechnology?Zincfingernucleases(ZFNs)areaclassofengineeredDNA-bindingproteinsthatfacilitatetargetededitingofthegenomebycreatingdouble-strandbreaksinDNAatuser-specifiedlocations./life-science/functional-genomics-and-rnai/zinc-finger-nuclease-technology/learning-center/what-is-zfn.html划时代的突破！Figure1:EachZincFingerNuclease(ZFN)consistsoftwofunctionaldomains:a.)ADNA-bindingdomaincomprisedofachainoftwo-fingermodules,eachrecognizingauniquehexamer(6bp)sequenceofDNA.Two-fingermodulesarestitchedtogethertoformaZincFingerProtein,eachwithspecificityof≥24bp.b.)ADNA-cleavingdomaincomprisedofthenucleasedomainofFokI.WhentheDNA-bindingandDNA-cleavingdomainsarefusedtogether,ahighly-specificpairof'genomicscissors'arecreated./life-science/functional-genomics-and-rnai/zinc-finger-nuclease-technology/learning-center/what-is-zfn.htmlZFNKnockoutAnimalCreationviaMicroinjection/life-science/functional-genomics-and-rnai/zinc-finger-nuclease-technology/learning-center/what-is-zfn.htmlZFN：zinc-fingernucleaseDoyonetal,2008.Heritabletargetedgenedisruptioninzebrafishusingdesignedzinc-fingernucleases.NATUREBIOTECHNOLOGYpublishedonline25May2008;doi:10.1038/nbt1409Componentsofyeast-basedchromosomalreportersystem:expressionvectorsfortheZFNs(top),targetgeneintegratedintothechromosomeattheHOlocus(middle).Afteradouble-strandbreak(DSB)isinducedatthetargetbyapairofZFNs,itisprocessedviasingle-strandannealing(SSA)torepairtheMEL1reportergene,theactivityofwhichcanberapidlyassayedinliquidculture.ZFN：zinc-fingernucleaseMengetal,2008.Targetedgeneinactivationinzebrafishusingengineeredzinc-fingernucleases.NATUREBIOTECHNOLOGYpublishedonline25May2008;doi:10.1038/nbt1398Figure1EngineeringZFNsthattargetkdrexon2usingabacterialone-hybridsystem.(a)Firstselectionstagetoidentifysinglezincfingerswithoptimizedbindingtoeach3-bpsubsitewithinarecognitionelement.(b)RecombinationofindividualzincfingersandsubsequentsecondselectionstageagainstfullZFPrecognitionelements.(c)SequencelogosareshownforthebindingspecificityofZFPsincorporatedintoZFNsforsubsequentanalysisinzebrafishembryos.(d)OverviewofapproachforZFN-targetedmutagenesisinzebrafishembryos.CuiX,JiD,FisherDA,WuY,BrinerDM,etal.(2010)Targetedintegrationinratandmouseembryoswithzinc-fingernucleases.NatBiotechnol29:64-67.ZFN-inducedtargetedintegration(HR)利用ZFN技术进行基因敲除和基因打靶的技术瓶颈1、构建ZFN很困难，需要进行复杂的分子重组2、获得有活性的ZFN非常非常困难

研究人员通常还需要验证以及几十个不同的ZFNs，来证明其中一个有效。/?articles.view/articleNo/39239/title/A-CRISPR-Fore-Cas-t/

Dongetal.,2011.PLoSONE,6(12):e28897.我们的发明：斑马鱼胚胎作为筛选系统筛选有活性的ZFN专利申请号:CN201110052372

国际上首例养殖鱼类基因敲除突变体GenomeEditingUsingTALENTechnologyTAL(transcriptionactivator-like)effectors(TALEs):proteinssecretedbyXanthomonasbacteria(gram-negativebacteria).Theseproteinscanbindpromotersequencesinthehostplantandactivatetheexpressionofplantgenesthataidbacterialinfection.TheyrecognizeplantDNAsequencesthroughacentralrepeatdomainconsistingofavariablenumberof~34aminoacidrepeats./wiki/TAL_effectorBochJ,BonasU(September2010)."XanthomonasAvrBs3Family-TypeIIIEffectors:DiscoveryandFunction".AnnualReviewofPhytopathology

48:419–36.向细菌学习！SCIENCEVOL32611DECEMBER2009NucleicAcidsResearch,2011,Vol.39,No.12UnitAssemblyBedellVM,WangY,CampbellJM,PoshustaTL,StarkerCG,etal.(2012)Nature491:114-118.TALEN-inducedtargetedintegration(HR)Dongetal.,2011.PLoSONE,6(12):e28897.我们的发明：斑马鱼胚胎作为筛选系统筛选有活性的ZFN专利申请号:CN201110052372

同样适合于筛选鉴定TALEN的活性！TALEN技术靶向突变黄颡鱼胚胎细胞基因组中的mstnbDongetal.,2014.Zebrafish利用TALEN技术进行基因敲除或基因打靶的技术瓶颈1、构建TALEN依然耗时、耗力2、获得有活性的TALEN不容易

研究人员通常还需要验证十几个不同的TALENS来证明其中一个有效。

/?articles.view/articleNo/39239/title/A-CRISPR-Fore-Cas-t/

基因组工程学里程碑式的技术—CRISPR/Cas9Gajetal.,2013.TrendsinBiotechnology,09May2013伟大时代的到来一、癌症免疫疗法：癌症治疗的标靶是身体的免疫系统而不是直接针对肿瘤。二、CRISPR:

这种基因编辑技术是在细菌中被发现的，但研究人员现在将其作为一种外科手术刀而指向了个体基因。其普及性在今年出现飙升，因为有超过12个研究团队用它来操控多个植物、动物及人类细胞的基因组。六、迷你器官:

在体外生长迷你人样“类器官”上取得了显著的进步。这些类器官包括肝芽、迷你肾及微型大脑。八、人类的克隆胚胎:

成功地从克隆的人类胚胎中得到了干细胞。【Science】2013年度十大科学突破2013年度的10大科学人物《自然》评选出了2013年度10大科学人物，张锋（FengZhang，音译）位列第一。DNA“编辑大师”张锋CRISPR/Cas9基因组编辑技术CRISPR：(ClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromicRepeats)arelocicontainingmultipleshortdirectrepeatsthatarefoundinthegenomesofabout40%ofsequencedbacteriaand90%ofsequencedarchaea.IshinoY,ShinagawaH,MakinoK,AmemuraM,NakataA(1987)."Nucleotidesequenceoftheiapgene,responsibleforalkalinephosphataseisozymeconversioninEscherichiacoli,andidentificationofthegeneproduct".JBacteriol169(12):5429–33.RepeatMojica,F.J.;Díez-Villaseñor,C.;Soria,E.;Juez,G.(2000)."BiologicalsignificanceofafamilyofregularlyspacedrepeatsinthegenomesofArchaea,Bacteriaandmitochondria".Molecularmicrobiology36(1):244–246.doi:10.1046/j.1365-2958.2000.01838.x.SRSRJansen,R.;Embden,J.D.;Gaastra,W.;Schouls,L.M.(2002)."IdentificationofgenesthatareassociatedwithDNArepeatsinprokaryotes".Molecularmicrobiology43(6):1565–1575.CRISPR

/wiki/CRISPR向古细菌学习！HorvathP,BarrangouR(January2010)."CRISPR/Cas,theimmunesystemofbacteriaandarchaea".Science327(5962):167–70.

ShortsegmentsofforeignDNA,calledspacers,areincorporatedintothegenomebetweenCRISPRrepeats,andserveasa'memory'ofpastexposures.CRISPRspacersarethenusedtorecognizeandsilenceexogenousgeneticelementsinamanneranalogoustoRNAiineukaryoticorganisms.CRISPRFunctionsasaProkaryoticImmuneSystem(acquiredimmunity)Milestonework:JinekM,ChylinskiK,FonfaraI,HauerM,DoudnaJA,CharpentierEAprogrammabledual-RNA-guidedDNAendonucleaseinadaptivebacterialimmunity.Science.2012Aug17;337(6096):816-21.

/wiki/CRISPRCas9、tracrRNA和crRNA一起以某种方法攻击和crRNA配对的外来DNA

李君等,2013.CRISPR/Cas系统：RNA靶向的基因组定向编辑新技术遗传

35(11):1265―1273Cas9是一个核酸内切酶Cas9是由1409个aa组成（加上两端的核定位信号，编码序列全长4.5kb）含有2个核酸内切酶结构域：中间位置的HNH核酸内切酶结构域（H结构域，切割与crRNA互补的链）氨基端RuvC-like（R结构域，切割另外一条链）CRISPR/Cas9识别目标基因组DNA示意图(改自Malietal.,2013.Science,339(6121):823-6.)Koo,2013-7-23,accessedon2013-11-9,/news/show/6268.htmlSchematicdiagramofCRISPR/Cas9systemCas9适用的应用研究：敲除应用于动植物及微生物基因组水平上的编码基因的靶向基因敲除应用于动植物基因组水平上的非编码基因如lncRNA（longnon-codingRNA）和microRNA的靶向基因敲除多基因同时敲除Cas9适用的应用研究：敲入应用于动植物及微生物基因组水平上的编码基因的靶向基因敲入点突变、保守区域替换、或加入标签编码序列李君等,2013.CRISPR/Cas系统：RNA靶向的基因组定向编辑新技术遗传

35(11):1265―1273Genome-scaleScreeningGenome-scaleCRISPR-Cas9knockoutscreeninginhumancells.ShalemO,SanjanaNE,HartenianE,ShiX,ScottDA,MikkelsenTS,HecklD,EbertBL,RootDE,DoenchJG,ZhangF.Science.2014Jan3;343(6166):84-7.doi:10.1126/science.1247005.Epub2013Dec12.GeneticscreensinhumancellsusingtheCRISPR-Cas9system.WangT,WeiJJ,SabatiniDM,LanderES.Science.2014Jan3;343(6166):80-4.doi:10.1126/science.1246981.Epub2013Dec12.Cas9适用的应用研究：其它领域双突变的Cas9（dCas9）的C端加上VP16等具激活活性的功能结构域，则可以特异地激活目标基因的表达在双突变的Cas9（dCas9）的C端加上EVE等抑制活性的功能结构域，则可以特异地抑制目标基因的表达（Cell.2013Jul18;154(2):442-51）。应用于动植物基因组水平上目标基因的甲基化、去甲基化等表观修饰。Cas9实验的常见问题：Off-tragetFedorov,Y.,etal."Off-targetingBysiRNACanInduceToxicPhenotype."RNAAccepted(2006).RNAiOff-target

Cas9实验的常见问题：脱靶问题脱靶几率计算：如果目标位点突变率为30%，另外潜在位点的突变率（脱靶率）1%，因为这两个事件是独立事件，因此在指定的细胞中，既发生目标位点基因敲除同时又发生脱靶的概率即为30%1%=0.3%，是非常低的。是可控的。在一般的以研究为目的的实验中，脱靶并不是问题，只有用于治疗才是个问题RNAi的敲降也一样存在脱靶问题，只不过之前没有重视过。。。。。Talen也存在，只是做的人更多偏向Cas9技术CRISPR/Cas9技术脱靶问题已获解决17个碱基的设计GNNNNN。。NGG，比常规降低了5000倍，几乎就不再脱靶。

17个再加上双切口技术，脱靶几乎检测不到！SolvedOffTargetproblem：Cas9（D10A）介导的双切口增强基因组编辑的特异性SolvedOffTargetproblem：使用17nt或18ntgRNA增强Cas9对基因组编辑的特异性最大限度地解决脱靶问题：17ntgRNA+

Cas9n介导的双切口可最大程度地提高基因组编辑的特异性Ranetal.,2013Sep12;154(6):1380-9

比TALEN效率高Dongetal.,2011.PLoSONE,6(12):e28897.我们的发明：斑马鱼胚胎作为筛选系统筛选有活性的ZFN专利申请号:CN201110052372

同样适合于筛选鉴定sgRNA的活性！斑马鱼1号染色体基因（约1400个基因）敲除计划文章案例EffectivegenetargetinginrabbitsusingRNA-guidedCas9nucleasesdoi:10.1093/jmcb/mjt04150ng/ulCas9mRNAplus6ng/ulsgRNARNA-guidedendonucleasesHighlyefficientgeneknockoutinmiceandzebrafishwithRNA-guidedendonucleasesHyun-TaekKimpublishedonlineNovember19,2013GenomeResOne-StepGenerationofMiceCarryingMutationsinMultipleGenesbyCRISPR/Cas-MediatedGenomeEngineeringRudolfJaenischCell153,910–918,May9,2013GenerationofGene-ModifiedCynomolgusMonkeyviaCas9/RNA-MediatedGeneTargetinginOne-CellEmbryosCell156,1–8,February13,2014Cas9mRNA(20ng/ml)andsgRNAs(5ng/ml)Cas9细胞怎么做

确定待敲除基因的靶位点并设计识别靶位点的识别的一对DNAOligo（引物）2.构建可表达sgRNA的Cas9质粒3.含sgRNA表达元件的Cas9质粒的活性检测4.利用Cas9质粒建立knock-out细胞系1，如何设计？以CFTR为例NCBI中找到对应的exon2构建可表达sgRNA的Cas9质粒

将合成的Oligos以逐步降温的方法退火成双链，然后与尧顺禹生物提供的Cas9质粒进行连接，连接后转化感受态的大肠杆菌，再进行涂板。电转如293T、3T3等模式细胞或目的细胞脂转荧光鉴定转染效率Puro药筛3-5天部分细胞抽提DNA、并PCR送测序通过测序套峰情况初步判断活性效率PCR产物连接TA克隆，验证准确效率3含sgRNA表达元件的Cas9质粒的活性检测

YSYsgRNA活性检测（专利）含识别位点的基因组片段（400-600bp）gRNA+Cas9mRNA斑马鱼受精卵发育24hpfYSY超微量试剂盒5个胚胎混合制备DNA模板通过测序套峰情况初步判断活性效率PCR产物连接TA克隆，验证准确效率套峰图4.利用Cas9质粒建立knock-out细胞系

电转如293T、3T3等模式细胞或目的细胞脂转荧光鉴定转染效率Puro药筛3-5天部分细胞抽提DNA、并PCR送测序通过测序套峰情况初步判断活性效率PCR产物连接TA克隆，验证准确效率其余细胞消化成单细胞克隆，继续培养并结合效率数据筛选获得稳定敲除细胞系PCR检测单克隆细胞，筛选非3的整数倍突变稳定建系成功Cas9动物模型怎么做体外转录成sgRNA（Cas9的mRNA单独转录，戴帽或加尾）显微注射到胚胎（斑马鱼、小鼠、大鼠、果蝇、热带爪蟾等）筛选F0代，内交或与WT杂交YSYsgRNA活性检测（专利）构建sgRNA表达质粒F1代YSY-CRISPR/Cas9Kit将正反向两个引物进行退火将退火产物与线性化的质粒连接转化感受态细胞转化子鉴定送2个经PCR验证有阳性条带的菌液去测序使用质粒提取试剂盒从经测序确认含正确重组质粒的菌液中提取质粒。细胞基因敲除载体（常规）细胞基因敲除载体（D10A）基因点突变细胞建系方式一：方式二：细胞敲入建系（长片段）动物模型基因敲除方式一：方式二：不同技术组合应用思路微阵列芯片、二代高通量测序微阵列芯片高通量测序RNA水平DNA水平RNA水平DNA水平转录组miRNAlncRNA外显子捕获SNPChIP全转录组测序物种重测序cGHDN