第九章蛋白质相互作用与定量蛋白质组学

蛋白质相互作用与定量

蛋白质组学研究技术第九章蛋白质相互作用主要研究技术酵母双杂交技术进展TAP（TandemAffinityPurification)技术进展自动化、高通量酵母双杂交技术和TAP技术定量蛋白质组学研究技术主要内容：一、蛋白质相互作用Protein-ProteinInteractions蛋白质相互作用控制着生命过程的各个方面YeastTwoHybridMassSpectrometry二、酵母双杂交技术及进展

YeastTwo-Hybrid，Y2H.

FieldsS.andSongO.:

Nature,1989,340:245-246研究蛋白质相互作用的方法,利用转录因子组件式（modular）结构的性质。Y2H就是将需要研究的蛋白质设计成“诱饵”，以钓出能与诱饵蛋白发生物理相互作用的蛋白质（被捕食蛋白质）。一个单转录因子有：

DBD:DNAbindingdomainDNA结合结构域。

AD:Activationdomain,转录激活结构域：能激活RNA聚合酶起始转录。

诱饵蛋白B+DBD:不能起始转录被捕食蛋白的ORF+AD:不能起始转录。当诱饵蛋白和被捕食蛋白在同一细胞中表达，如发生相互作用，RNA聚合酶将启动报告基因His3转录，合成组氨酸，如His3不表达，细胞不能生长。FieldsS.andSongO.

Anovelgeneticsystemtodetectprotein-proteininteractions.Nature,1989,340:245-246

优点：酵母细胞几乎能表达所有生物基因。缺点：

并非所有蛋白质能在酵母核内正常行使功能，不正确的蛋白质折叠结构：假阳性假阴性Y2H开始以转录因子Gal4为基础，依靠招募RNA聚合酶II激活转录。1997：Marsoliter等建立以RNA聚合酶III为基础的Y2H，假阳性率更低。反向双杂交系统：reversetwo-hybridsystem.

构建反向筛选的报告基因（URA3，U合成所必需），蛋白质互作激活报告基因表达，使细胞不能成活。分离杂交系统，split-hybridsystem

利用2个相互整合的报告基因。细胞质中的双杂交系统：

SOS招募系统：SOSrecruitmentsystem利用Ras信号传导途径的基本性质：两种蛋白相互作用，就会将hSos(人的鸟苷酸交换因子)招募到膜上，激活Ras,使酵母细胞在限制温度下成活和增殖。其他新的双杂交系统：

分离的泛素系统split-ubiquitinsyatem.(PNAS,1996,91:10340-10344)利用泛素的功能特点。当分别与泛素N端和C端部分融合的两个蛋白质相互作用时，使分离的泛素的两部分靠近，泛素专一性的蛋白酶就会识别泛素，导致报道蛋白的解离释放。单杂交系统，onehybridsystemDNA和蛋白质间相互作用。鉴定与特定DNA序列直接作用的蛋白质。三杂交系统，threehybridsystem

RNA或小分子配体和蛋白质的相互作用三者共同作用，才能激活转录。三、酵母双杂交技术在蛋白质组学中的应用Interactome互作组：全面详尽的蛋白质相互作用图谱。病毒、细菌、酵母、线虫等。T7噬菌体：首先用于大规模Y2H分析：

55个有25个相互作用。丙型肝炎病毒HCV：编码10个成熟蛋白，有5个相互作用。

酿酒酵母：6000多个ORF,1996完成基因组计划，阵列筛选法得到281个相互作用；文库筛选法得到692个相互作用：Uetz,P.etal.,Nature,2000,403:623-627.线虫：148个相互作用：

WalhoutA.J.etal.:

Science,2000,287:116-122.四、噬菌体展示技术

（Phagedisplay）

噬菌体展示技术是利用噬菌体的外壳蛋白与目的蛋白或多肽融合表达，将目的蛋白表达在噬菌体颗粒的外部，在蛋白质水平上进行“Biopanning”体外筛选，十分适用于酶与其配体或抑制剂、抗原决定簇、细胞表面受体的筛选等等。这个筛选的过程很简单，将目标肽或蛋白质固定于平板上，铺上噬菌体，噬菌体外壳融合蛋白与目标肽结合，不能结合的噬菌体颗粒将被洗掉，再将结合的噬菌体洗下，进行扩增培养，再进行一到两次的轮回，就能够分离到特定的噬菌体颗粒。

噬菌体展示技术（Phagedisplay）·

Ph.D.-7PhageDisplayPeptideLibraryKit·

Ph.D.-12PhageDisplayPeptideLibraryKit·

Ph.D.-C7CPhageDisplayPeptideLibraryKit·Ph.D.PeptideDisplayCloningSystem五、表面等离子体共振技术SPR

SurfacePlasmonResonance

研究蛋白质相互作用的新方法。如瑞典BIACORE的单元蛋白质芯片。将诱饵蛋白作为配基，固化在几十纳迷厚的金属膜表面，加入含猎物蛋白的溶液，如有相互作用会特异性结合形成蛋白质复合物，使金属膜与溶液界面的折射率上升，导致共振角度改变。特点：快速、安全，不需标记物和染料，还可检测蛋白-核酸及其它分子间的相互作用。

SPRDNA生物传感器可用于基因突变的检测、PCR产物测定、病毒检测等。六、蛋白质间连锁图的建立已建立酿酒酵母1548个蛋白质间2358个相互作用网络:Fields,S.Lab:

Nat.Biotechnology2000,18:1257-1261.七、酵母双杂交技术方法首先是选择适当的载体系统：

BD,AD载体：Gal4,LexA系统，多已商业化。然后将待鉴定的蛋白分别构建到载体上。

筛选文库的双杂交实验流程。阵列筛选法：用不同结合型（a,α）的表达“猎物”和“诱饵”蛋白的酵母菌株一一结合，可推测已知的蛋白质间的相互作用。文库筛选法：用表达一种“诱饵”蛋白的酵母细胞和一个表达复杂的文库“猎物”蛋白的酵母细胞直接结合。可发现未知蛋白。八、双杂交系统及其应用主要商业公司：APPLIEDBIOSYSTEMSBIOSIGNALPACKARDINC.CLONTECHINVITROGENORIGENETECHNOLOGIESINC.PROMEGACORPQBIOGENESTRATAGENEClontech公司的酵母双杂交系统诱饵基因的扩增和表达载体的构建诱饵表达载体转化到酵母中,验证对酵母的毒性和自激活实验猎物文库的选择(预转化的文库和预制的文库),文库扩增,质粒提取诱饵和猎物用共转化或交配(Mating)的方法转化到同一酵母中涂布到约50个筛选平板上菌落长出后，挑取阳性菌落作beta-gal报道基因实验菌落PCR扩增猎物基因，测序Blast分析得到猎物基因序列阳性相互作用的重新验证(Co-IP,pull-down,共定位等功能实验）从事大规模酵母双杂交的研究机构AllianceforCellSignalingMyriadGeneticsInc.HybrigenicsCuragenProteinComplexBacteriaRainJ.C.,etal.Theprotein-proteininteractionmapofHelicobacterpylori.Nature409,211-215(2001)幽门螺旋菌（导致胃病）OrganismTechnologyNumberofassays(bait×prey)DetectedinteractionsAlreadyknownS.cerevisiae(~6000ORFs)ProteinarraysPoolsofprey192×proteomeproteome×proteome281692109S.cerevisiae(~6000ORFs)Poolsofbaitsandprey430assaysofpools96×9617512S.cerevisiae(~6000ORFs)Poolsofbaitsandprey3844assaysofpools96×96841105S.cerevisiae(~6000ORFs)Libraryscreening15×proteome1703S.cerevisiae(~6000ORFs)Libraryscreening11×proteome11334S.cerevisiae(~6000ORFs)Libraryscreening68×proteome191128YeastViralgenomeOrganismTechnologyNumberofassays(bait×prey)DetectedinteractionsAlreadyknownVacciniavrius(~266ORFs)Proteinarrayproteome×proteome379HCV(10ORFs)ProteinarrayLibraryscreening10×proteome22fragments×proteome0522T7LibraryscreeningRandom×Random254McCraithS.,etal.Genome-wideanalysisofvacciniavirusprotein-proteininteractions.Proc.Natl.Acad.Sci.97,4879-4884(2000)FlajoletM.,etal.AgenomicapproachofthehepatitisCvirusgeneratesaproteininteractionmap.Gene242,369-379(2000)BartelP.,etal.AproteinlinkagemapofEscherichiacolibacteriophageT7.NatureGenetics12,72-77(1996)Caenorhabditiselegans线虫OrganismTechnologyNumberofassays(bait×prey)DetectedinteractionsAlreadyknownC.elegans(~20000ORFs)ProteinarrayLibraryscreeing29×2927×proteome812463WalhoutA.J.M.,etal.ProteininteractionmappinginC.elegansusingproteinsinvolvedinvulvaldevelopment.

Science287,116-122(2000).九、TAP（TandemAffinityPurification)技术进展NATUREBIOTECHNOLOGYVOL17OCTOBER1999特点：高纯度一次实验可以鉴定多个组分体内纯化复合体材料需要量少花费低、时间少靶蛋白可能含有TEV蛋白酶切位点EGTA可能影响复合体的稳定Nature,415:141-147,January,2002十、自动化、高通量酵母双杂交技术和TAP技术HyNet™:YeastTwo-HybridStrategyHySpec™:ProteinScienceandMassSpectrometryBioinformaticsAnalysisMyriadGeneticsInc.Myriad,Hitachi,Oracle&FriedliJoinForcesToMapTheEntireHumanProteome

$185MillionCollaborationtoDetermineAllHumanProteinInteractionsAndDecipherBiochemicalPathwaysAutomatedPlatingandColonyPickingLiquidmatingandplating

PickingToolRetrievingaColony

InoculatingaPlateofLiquidCulture

AutomatedPCRsetupandSequenceAnalysis

HighThroughputPCRofORFsGateway®CloningandCloneArchiveHumancelllysatepreparationGenedeliveryBacterialExpressionProteinPurificationProteinPulldownsMultidimensionalchromatographyseparationCombinedESI-MSandMALDI-MS在药物开发中的应用AwardedUSPatentonp10TumorSuppressorGeneCholesterolDisordersRepresentNovelDrugTargetsDiscoversNovelHepatitis'C'TargetDiscoversHighCholesterolGeneNovelDrugTargetforColorectalCancerNovelDrugTargetforHepatitisBNovelProstate（前列腺）CancerGeneMajorCauseofHereditaryObesityMajorDepression（抑郁）Gene

Automatedyeasttwohybrid

screening100,000clonesperdayArrayformatFulldatatrackingMegaMate－Genetix十一、定量蛋白质组学研究技术

QuantitativeproteomicsMannM.:Nat.biotechnol.,1999,17:954-955.

把一个基因组表达的全部蛋白质或一个复杂的混合体系中所有的蛋白质进行精确的定量和鉴定的一门科学。（TrendsBiotechnol.,1999,17:121-127）

蛋白质染色强度：定量要求：染色强度与蛋白质量成正比；通用性好（不同蛋白质具有相同染色能力）高灵敏度染色不影响后续鉴定（如不影响MS

中蛋白质分子的离子化过程）定量蛋白质组学方法：多维色谱-质谱联用技术蛋白质荧光染色技术同位素标记技术同位素亲和标签技术蛋白质芯片技术1、荧光染色定量技术有两种染料：

共价结合：花青染料

多位点结合，蛋白质溶解度降低，用量少，灵敏度低。

非共价结合：（1）与蛋白质没有特定的亲和力，在疏水性环境中才产生荧光：如苯乙烯基染料：

SyproOrange,SyproRed,SyproRuby…

尼罗河红：NileRed.

（2）与蛋白质有特定的亲和力

RuBPS：一种钌螯合剂。Amersham:

2-DDIGE:FluorescenceTwo-dimensionalDifferentialGelElectrophoresis荧光双向差示凝胶电泳技术。利用与蛋白质共价结合的染料。

Proteomics,2001,1:377-396.2、采用同位素编码亲和标签技术

IsotopeCodedAffinityTags,ICAT:

Gygietal:

Nat.Biotechnol.,1999,17:994-999.关键：ICTA试剂:三部分组成。可定量分析：蛋白质标记酶切亲和色谱分离MS信号强度定量测序。3、稳定同位素代谢标记技术

Odaetal.,PNAS,1999,96:6591-6596.方法：两组酵母细胞：14N99.6%+15N0.4%

15N>96%(Mr大).2-D、染色找出差异蛋白，酶解后进行MALDI-TOF-MS分析：精确定量。缺点（1）只适合于微生物（2）同位素影响微生物生长与蛋白合成（3）同位素标记Mr增加，加大数据检索难度。4、蛋白质芯片技术将蛋白质组的部分或全部蛋白质种类制作成蛋白质芯片（诱饵蛋白，如抗体）,这样的芯片可以用于筛选特定分子的相互作用分子。实质上是大规模的ELISA技术。技术关键：（1）空间上固定能辨别单一蛋白成分的分子。（2）检测混合物中单个蛋白与它们相应的识别分子间的相互作用。类型：玻璃板芯片

3D胶芯片（3Dgelpadchip）微孔芯片（micro-wellchip）Ciphergen公司：

ProtenChip®

蛋白质芯片Clontech™抗体芯片AbMicroarray380AbMicroarray芯片上的抗体包含针对信号传导、癌症、细胞周期调控、细胞结构、凋亡和神经生物学等广泛的生物功能的相关蛋白，跨度大、适用范围广,在毒性实验、疾病研究和药物开发上有广泛的应用前景。液体蛋白芯片系统：传统芯片技术分子间固相-液相相互作用LIQUIDCHIP分子间在液相中相互作用(分子间相互作用的最有效方式)

LiquichipSystem是在xMAP技术的基础上建立起来的蛋白质分析平台。反应在悬浮于液体中的球形基质上进行，提供了在一次样品分析中同时进行多达100种不同的分析的可能性。使用LiquichipSystem可以完成蛋白组学研究和药物研发中的许多种蛋白质分析。整个系统包括仪器，软件，球形反应基质和检测试剂。TheLiquichipTMProtein

SuspensionArraySystem液体蛋白芯片系统LiquichipSystem的应用免疫分析(e.g.,ELISA)酶分析受体-配基分析蛋白质-蛋白质蛋白质-核酸十二、免役共沉淀技术

检测蛋白质-蛋白质间物理作用的方法。使用抗体时即为免役共沉淀。

基本方法：利用蛋白质间特异亲和的原理。细胞裂解在非变形条件下制备总蛋白，以一种蛋白的抗体特异地免疫沉淀这种蛋白，然后用第二种蛋白或更多种蛋白的抗体做免疫印迹，检测它们是否被第一种蛋白共沉淀，以对照检测相互作用的特异性。1、检测蛋白质的存在

Westernblot检测参与免役共沉淀的蛋白质的表达或存在。2、制备总蛋白提取物3、相互作用特异性对照实验4、免役共沉淀技术的其他分析灵敏度高、能反映体内的相互作用情况，可与Y2H结合使用。

两个方向分别共沉淀：以蛋白A的抗体免役共沉淀，以蛋白B的抗体免疫检测；同时以蛋白B的抗体免役共沉淀，以蛋白A的抗体免疫检测。十三、细胞共定位技术

1、荧光蛋白融合技术

Gre