第五章病原微生物检验

第五章常见病原微生物的检验第一节禽流感病毒第二节口蹄疫病毒第三节炭疽杆菌第四节布鲁氏杆菌第五节结核分支杆菌第一节禽流感病毒

(Avianinfluenzavirus，AIV)一、生物学特性二、抗原性三、病毒的致病性四、诊断1878年Perroncito首次报道意大利鸡群暴发禽流感.禽流感呈广泛性传播和全球性分布。高致病性禽流感（HPAI）近几年连续爆发，对世界范围内养鸡业及人类健康造成极大危害。禽流感具有爆发突然、蔓延迅速、波及面广等特点，人类、猪、家禽、野禽、水禽等均是受害对象。一、生物学特性

正粘病毒科/甲型流感病毒属

☆病毒粒子一般为球形，直径为80~120nm；★外有囊膜，囊膜表面有许多放射状排列的纤突（Spikes）;★纤突分两类，一类是棒状，由血凝素（HA）分子的三聚体构成；另一类是蘑菇状，由神经氨酸酶（NA）分子的四聚体构成。两种结构在囊膜上的比例约为HA:NA＝75:20。核酸型为单股负股RNA，分8节；8个独立的RNA片段，分别编码PB1，PB2，PA，HA，NP，NA，M1，M2，NS1，NS2等10种蛋白。透射电镜下呈圆形，其表面有纤突（×60000）H5N1正在攻击健康的细胞：蓝色部分是禽流感病毒，下面的红色部分则是健康人体细胞培养特性易在鸡胚以及鸡和猴的肾组织培养中生长；有些毒株也能在家兔、公牛和人的细胞中生长。在组织培养中能引起血球吸附，并常产生病变。大多数毒株能在鸡胚成纤维细胞培养中产生蚀斑。有些毒株在鸡、鸽或人的细胞培养中培养之后，对鸡的毒力减弱。禽流感病毒对外界因素的抵抗力较弱。56℃30min、60℃10min、65-70℃数分钟即可灭活病毒。在直射阳光下４０至４８小时即可失去活性。对低温抵抗力较强，4℃可存活1个多月，在有甘油保护的情况下可保持活力１年以上。抵抗力一）血清型根据流感病毒的核蛋白（NP）和膜蛋白（MS）抗原性的不同，将其分为A、B、C三个血清型三型之间的差异可通过琼脂扩散试验或补体结合试验等进行测定。二、抗原性二）HA和NA是病毒表面的主要糖蛋白；具有种(亚型)的特异性和多变性，根据病毒HA和NA抗原性的差异，可将其分为不同的亚型。HA和NA在病毒感染过程中起着重要作用。

－HA决定病毒的致病性，能诱发感染宿主产生具有保护作用的中和抗体，

－NA诱发的抗体无中和作用,但可减少病毒增殖和改变病程。二、抗原性迄今已知有16种HA和10种NA据报道现已发现的流感病毒亚型至少有80多种；其中绝大多数属非致病性或低致病性；高致病性亚型主要是含H5和H7的毒株基因极易发生变异HA的基因的突变率最高其次为NA基因AIV基因组极易发生变异1、基因突变导致流感病毒发生抗原漂移（antigenicdrift）。因为流感病毒的RNA复制酶缺乏校正阅读能力，导致不同毒力毒株出现。

如1983-1984（美国）H5N2，6个月后成为高致病性，禽类病死率达90%；1999-2001（意大利）H7N1，9个月后成为高致病性。2、基因重组是流感病毒发生抗原转变（antigenicshift）的主要原因。目前，多数人认为抗原转变是以前流行于人和动物流感病毒基因片段重组的结果。（鸭-猪-人-禽）（新亚型出现）禽流感病毒变异三、致病性引起各种类型的禽流感（Avianinfluenza，AI）高致病性禽流感（Highlypathogenicavianinfluenza,HPAI）又称：真性鸡瘟、欧洲鸡瘟OIEA类传染病，严重危害养禽业受禽流感病毒感染后的症状：

轻度的呼吸道症状、消化道症状，死亡率较低较重的全身性、出血性、败血性症状，死亡率较高四、AIV的检验一）病毒的分离与鉴定采取病鸡的呼吸道或窦内渗出物或器官组织,制成悬液，离心沉淀或过滤以去除组织碎屑；无菌悬液0.1~0.2ml尿囊腔接种10~11日龄鸡胚,在35℃中培养48h。取鸡胚的尿囊液,作HA试验和HI试验，以鉴定病毒。一）病毒的分离与鉴定二）血清学试验可用来证实抗体的存在－－在感染后7d便可被检测出来。常用的血清学检查方法有：①HI试验——检测抗HA抗体。②双向免疫扩散试验(AGP)——检测抗NP抗体。③病毒中和试验④神经氨酸酶抑制试验⑤ELISA(酶联免疫吸附试验)

其他诊断方法：ELISA，PCR等四、AIV的检验AvianinfluenzainbirdsAvianinfluenzaisaninfectioncausedbyavian(bird)influenza(flu)viruses.Theseinfluenzavirusesoccurnaturallyamongbirds.Wildbirdsworldwidecarrythevirusesintheirintestines,butusuallydonotgetsickfromthem.However,avianinfluenzaisverycontagiousamongbirdsandcanmakesomedomesticatedbirds,includingchickens,ducks,andturkeys,verysickandkillthem.TypeAofAIVTherearemanydifferentsubtypesoftypeAinfluenzaviruses.ThesesubtypesdifferbecauseofchangesincertainproteinsonthesurfaceoftheinfluenzaAvirus(hemagglutinin[HA]andneuraminidase[NA]proteins).Thereare16knownHAsubtypesand9knownNAsubtypesofinfluenzaAviruses.ManydifferentcombinationsofHAandNAproteinsarepossible.Eachcombinationrepresentsadifferentsubtype.AllknownsubtypesofinfluenzaAvirusescanbefoundinbirds.AvianInfluenzaA(H5N1)InfluenzaA(H5N1)virus–alsocalled“H5N1virus”–isaninfluenzaAvirussubtypethatoccursmainlyinbirds,ishighlycontagiousamongbirds,andcanbedeadlytothem.H5N1virusdoesnotusuallyinfectpeople,butinfectionswiththeseviruseshaveoccurredinhumans.MostofthesecaseshaveresultedfrompeoplehavingdirectorclosecontactwithH5N1-infectedpoultryorH5N1-contaminatedsurfaces.第二节口蹄疫病毒检验

Foot-and-mouthdiseasevirus，FMDV一、生物学特性二、抵抗力三、抗原性四、培养特性五、致病性六、微生物学诊断口蹄疫病毒（Foodandmouthdiseasevirus，FMDV）是牛、猪、羊等偶蹄动物口蹄疫的病原。

FMD：OIEA类传染病之一，是全球性最重要的动物健康问题之一。马除外最初发现：1898年，德国科学家Loeffler与Frosch，口蹄疫病畜病料通过滤器除菌后，仍能使健康动物发病。属于微RNA病毒科（Picornaviridae）口蹄疫病毒属（Aphthovirus），该属内只有口蹄疫病毒1个种。二十面体对称，直径20～25nm，无囊膜，病毒基因组为单股正链RNA，在RNA芯髓外对称衣壳上有32个壳粒。病毒子在宿主细胞浆内可形成晶格状排列。一、生物学特性本病毒是动物病毒中发现最早的一种。对酸敏感，病毒在pH为6.5的缓冲液中、4℃条件下14h灭活90％，在pH5.5时1min灭活90％，在pH5.0时每秒钟灭活90％，pH3.0时瞬间灭活;病毒在pH7.0～7.5时十分稳定。口蹄疫病毒对碱也很敏感。对消毒剂的抵抗力较强。病毒在低温下能长期保存。病毒的灭活温度为85℃1min，70℃10min，60℃15min，但裸露的RNA对热较稳定。二、抵抗力

根据病毒的血清学特征，目前已知口蹄疫病毒有七个主型：A、O、C、南非Ⅰ、南非Ⅱ、南非Ⅲ和亚洲Ⅰ型（SAT1、SAT2、SAT3、Asia1

）。各型之间没有交互免疫作用。本病毒有较大的变异性。有时流行初期与末期毒型不一致，几乎每年都有新的亚型出现。本病毒已发现85个以上的亚型。

三、抗原性1．组织培养利用犊牛、幼猪的肾脏或豚鼠、牛胚胎上皮组织制成细胞单层来培养病毒，病毒繁殖后，使细胞发生病变。2．鸡胚培养本病毒不易在鸡胚上生长，必须反复交替通过牛与鸡胚或在添有牛舌上皮的鸡胚组织培养继代后，才可能适应于鸡胚或鸡胚组织培养。在感染了口蹄疫病毒的细胞培养液中，有大小不同的4种粒子：最大的粒子为完整病毒；第二种为不含RNA的空衣壳；第三种为衣壳蛋白亚单位；第四种是病毒感染相关抗原。四、培养特性在自然条件下，主要发生于偶蹄兽，其中以奶牛和黄牛最易感，其次是水牛，牦牛、猪，再次为羊和骆驼等。野生偶蹄兽也能发生。从流行病学的观点来看，绵羊是本病的“储存器”，猪是“扩大器”，牛是“指示器”。

1.传播途径呼吸道、消化道(被污染的饲料、饮水）创伤、皮肤、粘膜2.流行特点：有一定的季节性（以冬、春季节发病较多）传播迅速,一般沿交通线进行传播

五、致病性（一）豚鼠接种试验选择500g以上的健康豚鼠4～6只，剪去后肢足掌部被毛，用湿棉花球洗净，再用70％酒精棉消毒。将足掌部皮肤或口腔粘膜划破，把感染性病料涂擦于划破处。第二天如局部有水疱，即可确诊。六、微生物学诊断(二)乳鼠接种试验

选2～7日龄乳鼠5只，4只做检样，1只做对照，每只颈背部皮下接种0.1ml，观察1周，如有死鼠,及时取出，制备1:3检样，传代。如无死鼠取活鼠冻死传代，传2-3代不死亡为阴性。FMDV接种乳鼠：呼吸急促，四肢和全身麻痹（2）乳鼠接种实验双份血清ELISAIFA补体试验中和试验血清学检查：病毒分离检查：细胞培养PCR法口蹄疫病毒FMDV致细胞病变正常IB-RS-2单层细胞口蹄疫病毒FMDV致细胞病变FDMV感染的IB-RS-2细胞，细胞变圆收缩，细胞间隙增大FDMV感染的IB-RS-2细胞，细胞变圆口蹄疫病毒FootandMouthDiseaseVirus(FMDV)FMDVisamemberofthefamilyPicornaviridae,genusAphthovirus.Sevenimmunologicallydistinctserotypeshavebeenidentified:A,O,C,SAT1,SAT2,SAT3,andAsia1.Infectionwithoneserotypedoesnotconferimmunityagainstanother.Virionsappearsmoothandroundinoutline,arenon-enveloped,27nmindiameter,andhaveicosahedralsymmetry.ThegenomeisasinglelinearmoleculeofssRNAandisabout7.2-8.4kbinsize.GenomicRNAisinfectious.FootandMouthDisease(FMD)FMDisoneofthemostcontagiousanimaldiseases,withimportanteconomiclosses.SpeciesofthefamilyBovidae,aswellassheep,goats,swine,allwildruminantsandSuidaearenaturalhostsofFMDV.SpeciesoffamilyCamelidaehavelowsusceptibility.TypicalcasesofFMDarecharacterisedbyavesicularconditionofthefeet,buccalmucosaand,infemales,themammaryglands.Clinicalsignscanvaryfrommildtosevereandfatalitiesmayoccur,especiallyinyounganimals.FMDisclassifiedasanOIEListAdisease.第三节炭疽杆菌检验

Bacillusanthracis

一、炭疽杆菌与炭疽病二、生物学特性三、检验炭疽杆菌（Bacillusanthracis）：人类最早认识和注意的重要病原菌之一，是炭疽病的病原体。炭疽病（Anthrax）是一种人兽共患的急性、热性、败血性烈性传染病，呈世界性分布。一年四季均可发生，以夏、秋季节较高。其易感动物之多，仅次于狂犬病。家畜中以牛和绵羊最易感，常呈超急性、急性经过，表现为突然倒地，呼吸困难，全身痉挛，高热，可视黏膜发绀，天然孔出血，血凝不良，尸僵不全；山羊、马、驴、骡、水牛、骆驼次之；猪有较强抵抗力，常呈慢性经过，表现为咽唊炎型、肠型和肺型。一、炭疽杆菌与炭疽病Anthrax：bison炭疽：血液呈煤焦油状人类常因食用带有该菌的食物、饮水或与患炭疽死亡的动物及其畜产品接触而通过消化道、呼吸道或皮肤粘膜而感染，表现为皮肤、肺、纵隔及肠道的急性感染，有时伴有炭疽杆菌败血症。肠型炭疽和肺型炭疽常表现为急性败血症经过，病死率很高。1923~1940年前苏联爆发6次肠型炭疽，其中最严重的一次是由病畜肉制成的腊肠引起的，27例病人无一幸存。一、炭疽杆菌与炭疽病本菌可通过患病动物血液、分泌物、排泄物，或死亡病畜的尸体、组织、脏器、体液、骨骼、皮毛等污染土壤、空气、江河、池塘甚至食物和饮水，尤其是病畜的血液，可以成为感染人类、污染环境的重要来源。炭疽杆菌繁殖体的抵抗力不强，但其所形成的芽孢对外界环境的抵抗力极为强大，可长期存活。自然环境一旦被芽孢污染，则成为长久的疫源地而不易清除，长期危害人类和动物。因此，采取有效措施防止本菌的污染和传播，在人兽共患病防治和食品卫生学方面具有重要意义。一、炭疽杆菌与炭疽病Cutaneousanthraxvesicledevelopment.Day4:Blackeschar,rednessremains.

Cutaneousanthraxvesicledevelopment.Day4:Noticetheedemaandtypicallesions.

WhatisAnthrax?Anthraxisanacuteinfectiousdiseasecausedbythespore-formingbacteriumBacillusanthracis.Anthraxmostcommonlyoccursinwildanddomesticlowervertebrates(cattle,sheep,goats,camels,antelopes,andotherherbivores),butitcanalsooccurinhumanswhentheyareexposedtoinfectedanimalsortissuesfrominfectedanimals.Whereisanthraxusuallyfound?Anthraxcanbefoundglobally.Itismorecommonindevelopingcountriesorcountrieswithoutveterinarypublichealthprograms.Certainregionsoftheworld(SouthandCentralAmerica,SouthernandEasternEurope,Asia,Africa,theCaribbean,andtheMiddleEast)reportmoreanthraxinanimalsthanothers.BacillusanthracisBacillusanthracisisanencapsulatedgram-positive,nonmotile,aerobic,spore-formingbacterialrodwithasporesizeofapproximately1µmx2µm.ThethreevirulencefactorsofB.anthracisareedematoxin,lethaltoxin,andanantiphagocyticcapsule.Thetoxinsareresponsiblefortheprimaryclinicalmanifestationsofhemorrhage,edema,andnecrosis.二、生物学特性（一）形态染色特性革兰氏阳性粗大杆菌，大小为1.0~1.2µm3~5µm。无鞭毛，不能运动。在人和动物体内常呈单个散在或呈短链状，菌体两端平截，周围形成粘液样肥厚荚膜，似竹节状。在血液、血清琼脂平板上或加有碳酸氢钠的琼脂平板上，于10%~20%CO2环境中培养，也可形成荚膜。荚膜比菌体更耐腐败，因此在腐败组织中往往不见菌体而只见“菌影”（荚膜的轮廓）。在人工培养物内和自然界中，一般不形成荚膜，常呈长链状。能形成卵圆形芽孢，芽孢位于菌体中央。形成芽孢的条件：氧气充足、温度适宜(25℃~30℃)。Gram’sstainofBacillusanthracisB.anthracis

：Gram-positive,encapsulated,spore-forming,zoonotic,rodprokaryote.

Anthrax.Toluidineblue（甲苯胺蓝）stain.Bacillusanthracisinabovinespleen.Anthraxbacilliintissueseeninshortchainssurroundedbyacommoncapsule.Colouredscanning,electronmicrograph(SEM)ofanthraxbacteria(Bacillusanthracis),thecauseofthediseaseanthraxinhumansandlivestock.Colouredscanningelectronmicrograph(SEM)ofBacillusanthracisspores.

二、生物学特性（二）培养特性本菌对营养要求不严格，在一般培养基上即可生长。生长温度范围14℃~44℃，最适温度30℃~37℃。pH范围6.0~8.5，最适pH7.2~7.6。普通琼脂：强毒株18~24h形成扁平、粗糙、表面干燥、灰白色、不透明、边缘不整齐的火焰状菌落，在低倍显微镜下，可见菌落边缘呈卷发状，用接种针探触，有粘滞感，挑之，可拉起丝。弱毒株或无毒株形成光滑菌落，菌落稍小而隆起，边缘较整齐。二、生物学特性（二）培养特性普通肉汤：管底有絮状沉淀物，整个培养液澄清，如轻轻摇动试管，可见沉淀物卷绕成团，往上升起。不形成菌膜或菌环。血琼脂平板：菌落周围无明显的溶血环，但培养较久后可出现轻度溶血，菌落周围不透明。菌落有粘性，用接种针钓取可拉成丝，称为“拉丝”现象。明胶穿刺：只沿穿刺线生长，培养2~3d后明胶呈漏斗状液化，上部向外扩展呈白色的倒立松树状。ColonyofBacillusanthracisbacteria炭疽杆菌在血平板上的菌落（三）生化特性本菌能分解葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、菊糖、蕈糖和果糖，产酸不产气；不分解乳糖、阿拉伯糖、木糖、鼠李糖、半乳糖、甘露醇、乳糖、甘露醇、山梨醇和卫茅醇；有些菌株可迟缓发酵甘油和水杨苷。不能利用枸橼酸盐；不分解尿素；能水解淀粉和乳蛋白；通常可还原硝酸盐为亚硝酸盐；不产生靛基质和硫化氢，V-P试验不定；苯丙氨酸脱氨酶和磷酸酯酶阴性，接触酶阳性；牛乳经2~4d凝固，然后慢慢胨化。二、生物学特性AnthraxisanacuteinfectiousdiseasecausedbythebacteriumBacillusanthracis.Anthraxisprimarilyadiseaseofdomesticatedandwildanimals,particularlyherbivoressuchascattle,sheep,horses,mulesandgoats.B.anthraciswassocalledaftertheGreekwordforblackcoal('anthracis'),duetotheblacknecroticulcerscharacteristicofcutaneousanthraxinfection.Thebacteriumproducessporeswhichcansurvivedormantinthesoilformanyyearsandalthoughhumananthraxisfairlyrare,infectionoccursincidentallythroughcontactwithdiseasedanimalsorbyinhalinganthraxsporesfromcontaminatedanimalproductssuchasflesh,bones,hides,hairandexcrement.（三）血清学特性目前已知有4种抗原成分：保护性抗原、荚膜抗原、菌体抗原和芽孢抗原。1、保护性抗原：是炭疽杆菌生活过程中产生的一种细胞外蛋白质，为炭疽杆菌毒素的组成部分，有免疫原性，其相应的抗体能使动物抵抗本菌的感染作用。2、荚膜抗原：由D-谷氨酰多肽组成，是一种半抗原，与毒力有关，仅见于有毒菌株；该抗原产生的抗体对动物无保护作用，但具有较特异的抗原性，由此建立起用于鉴定菌种的荚膜肿胀试验和测定患者血清荚膜抗体的免疫荧光法等，均能获得较好的效果。二、生物学特性（三）血清学特性1、保护性抗原：2、荚膜抗原：3、菌体抗原：有2种。一种为多糖半抗原，存在于细菌细胞壁和菌体内，耐热，比较稳定，与毒力无关；常用的炭疽沉淀反应（Ascoli反应）就是通过检测此抗原而判定炭疽污染的；有种的特异性，但特异性不高，能与其它需氧芽孢杆菌等发生交叉反应。另一种是菌体蛋白质抗原，具有对细菌自身的保护作用。4、芽孢抗原：位于芽孢的外膜，具有免疫原性和血清学诊断价值。二、生物学特性三、检验（一）检验程序见《动物性食品检验学》第六章。（二）细菌学检查1.显微镜检查：2.分离培养3.鉴别试验（三）其它检验方法三、检验（二）细菌学检查1.显微镜检查：取待检材料制成涂片，用荚膜染色法及革兰氏染色法染色后镜检。革兰氏染色可见G+粗大杆菌。荚膜染色法菌体呈深紫色，荚膜淡紫色；碱性美兰染色可将菌体染成蓝色，荚膜为淡粉红色。2.分离培养：一般分离培养采用血琼脂平板。污染严重的标本，可在处理后接种于炭疽杆菌选择性琼脂平板，如戊烷脒血琼脂平板。经37℃10h~24h培养后，进行菌落检查和鉴别试验。在戊烷脒血琼脂平板上，多数其它芽孢杆菌受到抑制，而炭疽杆菌仍可生长，但也受到轻度抑制。菌落生长较慢较小，不溶血，呈卷发状。三、检验（二）细菌学检查3.鉴别试验（1）明胶穿刺：沿穿刺线形成白色的倒立松树状生长，可证实为炭疽杆菌。（2）串珠试验：在适当浓度的青霉素（0.05~0.5IU/mL）作用下，炭疽杆菌细胞壁粘肽的合成被抑制，使菌体膨大，形成大而均匀的圆球状，类似串珠。这种现象为炭疽杆菌所特有，可与其它需氧芽孢菌鉴别，且与常规检查符合率高达80%~90%。常用方法有肉汤法和琼脂薄片法。（3）串珠荧光抗体染色法：本法结合了串珠试验和荧光抗体染色法的特点，具有双重特异性，有助于与其它需氧菌的区别。三、检验（三）其它检验方法

1.荚膜荧光抗体染色法

2.荚膜肿胀试验

3.Ascoli’s反应（环状沉淀试验）1902年Ascoli首次提出，一直被广泛应用。适用于疑似炭疽死亡动物的病料、干的皮张、陈旧及污染严重的炭疽病料等。特异性和敏感性较差，因此其应用有一定局限性。4.乳胶凝集试验5.青霉素抑制试验每1mL培养基中含青霉素10IU时，可抑制炭疽杆菌的生长，而其它需氧芽孢杆菌生长不受影响。6.噬菌体裂解试验

第四节布鲁菌检验

Examinationof

Brucella一、布鲁菌与布鲁菌病二、布鲁菌的生物学特性三、检验布鲁菌（Brucella）是人兽共患的布鲁氏菌病病原体，牛、羊、猪等动物最易感染。我国流行的主要是羊、牛（马耳他）、猪三种布鲁氏菌，其中以羊布鲁氏菌病最为多见。该细菌主要感染怀孕动物，侵入生殖器官和网状内皮系统，并感染胚胎和胎儿，多导致胎儿死亡并流产；公畜主要表现为睾丸炎。人患病主要是由畜传染，人与人之间传染机会极少，感染途径主要是通过皮肤、消化道、呼吸道、眼结膜和生殖器官。人感染后潜伏期2~3周，由于本菌具有荚膜，能抵抗吞噬细胞的吞噬，并能在该细胞内增殖，反复出现菌血症，病人出现发热、无力等症状，且呈波浪式发热，故在临床上称为波浪热。一、布鲁菌与布鲁菌病人类接触带菌动物或食用病畜及其乳制品，均可被感染。布鲁菌病最危险之点是患畜几乎不表现症状，但能通过分泌物和排泄物(乳、精子、阴道分泌物、粪、尿)不断向外排菌，待别是随流产胎儿、胎衣和羊水排出大量病原菌，成为最危险的传染源。本菌在自然界中抵抗力较强，在病畜脏器和分泌物中，一般能存活4个月左右，在食品中约能生存2个月。在水、土、粪、尿中存活3个月，在皮毛上存活1~4个月，在冻肉中存活2~7周，在乳中存活10天至1年。对低温的抵抗力也强，对热和消毒剂抵抗力弱。对链霉素、氯霉素和四环素等均敏感。一、布鲁菌与布鲁菌病Brucella

isnamedafterSirDavidBrucewho,in1886,firstisolatedtheorganismfromthespleenofasoldieratpost-mortem（尸检）withwhatwasthencalledMaltafever.ThegenusBrucella

currently

containssixspecies:B.melitensis,B.abortus,B.canis,B.ovis,B.suisandB.neotomae,whichvaryintheirabilitytoinfecthostanimals.Brucellosis,Hygromas（水囊瘤）onthekneejoints.ThisconditionmaybeasequeltoBrucellaabortusinfection.一、布鲁菌与布鲁菌病布鲁菌病引起的流产一、布鲁菌与布鲁菌病（一）形态染色特性布鲁菌初分离时为微小球杆菌，继代后，牛和猪布鲁菌可逐渐变为杆状，羊布鲁菌仍为小球杆状。平均大小为0.6~1.5μm×0.5~0.7μm。不形成芽孢，无鞭毛，无动力。常单个存在。光滑型菌有荚膜。革兰氏染色阴性。可被所有碱性染料着色，不呈两极浓染。柯氏染色法（沙黄与孔雀绿对染）染色，本菌为鲜红色，其它杂菌被染成绿色。二、生物学特性布鲁菌（Gram’sstain）二、生物学特性ScanningElectronMicrographofBrucellaabortus：causesbrucellosisfever(alsoknownasundulantorMaltafever).

SEMofBrucellamelitensis

－Gram-negative,aerobic,coccobacillusprokaryote;Magnification:x3,600.

Magnification:x3,900.（二）培养特性专性需氧，但许多菌株初次分离时需5%~10%的CO2环境。适宜温度为35~38℃，适宜pH为6.6~7.4。布鲁氏菌的培养特点是生长缓慢，尤其是新分离株初次分离时在48h前罕见菌落形成，往往需要5~10d甚至20~30d。传代适应后48h可见生长。对营养要求严格，需某些氨基酸、血清、血液或组织浸液。血清葡萄糖肉汤和血清葡萄糖琼脂可支持所有种和大多数菌株生长。二、生物学特性在血清肝汤琼脂上2~3d后形成湿润、闪光、无色、圆形、表面隆起、边缘整齐的小菌落。在血液肝汤琼脂上菌落灰白，不溶血。在高层血清琼脂培养3~6d后，牛型及绵羊型于琼脂表面0.5cm处呈带状生长。而在马铃薯斜面上本菌生长良好，2~3d后长出微棕黄色菌苔，色素溶于基质。在肉肝汤中一般需2~3d才可见生长。肉汤轻微浑浊，无菌膜。1周后产生灰白色粘稠沉淀物。老龄培养物中有时可见菌环。二、生物学特性BrucellamelitensisonSBA,48hrs（三）生化特性多数菌株可分解葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖等，但分解能力低，产酸少，很难检测。本菌不液化明胶；不产生靛基质；不凝固牛乳；能还原硝酸盐为亚硝酸盐；接触酶阳性；MR试验和V-P试验阴性；H2S试验不定。

二、生物学特性WeakureareactionofB.melitensis

at24honChristensens’sagar（四）血清学特性本菌抗原结构非常复杂，就目前所知，布鲁氏菌有表面抗原（A、M、R）、亚表面抗原和深部抗原3类。1.A、M抗原光滑型菌株的表面抗原主要是A（流产型）和M（马耳他型）抗原，为细胞壁脂多糖的大分子复合物，既是这些细菌的凝集原，也是种和型鉴定的重要依据。流产布鲁氏菌A﹕M为20﹕1，马耳他布鲁氏菌为1﹕20，猪布鲁氏菌为4﹕1。2.R抗原非光滑型菌株除A、M抗原外，均还具有R抗原，为细胞壁上低蛋白含量的脂多糖复合物。绝大多数非光滑型菌株的R抗原是相同的，其抗血清可与羊布鲁氏菌和犬布鲁氏菌发生凝集，而不与光滑型布鲁氏菌凝集。

二、生物学特性1）B.abortusprimarilyinfectscattlebutistransmittedtobuffaloes,camels,deer,dogs,horses,sheepandman.2）B.melitensiscausesahighlycontagiousdiseaseinsheepandgoatsalthoughcattlecanbeinfected.Itisthemostimportantspeciesinhumaninfection.3）B.suiscoversawiderhostrangethanmostotherBrucella

species.Thisspecieshas5biovars.Allbiovarscanbetransmittedtomanwiththepossibleexceptionofbiovar2.sixspeciesofBrucellaB.abortus

B.melitensis

B.suis4）B.caniscausesepididymo-orchitisinthemaledogandabortionandmetritisinthebitch.Ithasnotbeenreportedinotheranimalspeciesexceptman.5）B.ovisisresponsibleforepididymitisinramsandoccasionallyabortioninewes,butdoesnotinfectotheranimalsorman.6）B.neotomaeisonlyknowntoinfectthedesertwoodrat（沙林鼠）undernaturalconditions,andnoothercaseshavebeenreported.sixspeciesofBrucella三、检验一）检验程序

见《动物性食品检验学》第六章。二）细菌的分离培养与鉴定

首先要注意安全，防止人员感染和环境污染，其次要特别注意满足布鲁氏菌的营养要求。1.细菌的分离培养：SDA（血清葡萄糖琼脂），对污染样品则接种在选择培养基（加有抗生素的SDA）上。也可将检样接种于含2%（W/V）柠檬酸钠和抗生素的SDB中，经37℃培养2~3d（必要时补充5~10%的CO2）后再于SDA上分离培养约6d，直到出现可见菌落。

三、检验二）细菌的分离培养与鉴定

1.细菌的分离培养：2.布鲁菌的鉴定分型：在必要时进行布鲁菌的鉴定分型。常规方法有：

CO2需求的检查，

H2S产生量的测定，染料抑菌试验，

A、M、R血清凝集试验，

Tb噬菌体裂解试验。三、检验三）血清学检验用血清学试验诊断人、畜布鲁菌病仍是当前主要手段。常用的方法有10多种，其中用于人布病诊断的主要有试管凝集试验、二巯基乙醇试管凝集试验、抗球蛋白试验和补体结合反应，用于动物诊断的主要方法是试管凝集试验、平板凝集试验、虎红平板凝集试验和琼脂扩散试验等。（1）平板凝集试验(Plateagglutinationtest,PAT)（2）虎红平板凝集试验(RBPT)（3）试管凝集试验(SAT)：（4）抗人免疫球蛋白试验(Coomb’s反应)（5）补体结合试验(Complimentfixationtest,CFT)第五节结核分支杆菌检验

Mycobacteriumtuberculosis一、结核分支杆菌与结核病结核分支杆菌（Mycobacteriumtuberculosis）俗称结核杆菌，可引起人和牛（主要是奶牛）、猪、禽类的结核病。该菌是一类细长略弯曲的微生物，有时有分枝或出现丝状体。目前在分类学上已将分枝杆菌属归纳于放线菌中。主要有人型、牛型、禽型、

鼠型和冷血动物型及非洲型。已知人型、牛型和非洲型对人有致病性。禽型可能也对人致病。一、结核分支杆菌与结核病牛，特别是奶牛对结核杆菌最易感。牛常见的结核病是肺、乳房、淋巴结结核，有时可见肠、生殖器、浆膜结核及全身性结核。猪主要表现为淋巴结核，最常患病的部位是颌下、咽、颈及肠系膜淋巴结。禽类主要对禽型结核杆菌敏感，主要侵害肝、脾等。人的结核以肺结核最为常见，此外有淋巴结核、肠结核、骨结核等。据WHO报道，每年约有800万新病例发生，至少有300万人死于该病。一、结核分支杆菌与结核病人感染结核病，除通过呼吸道途径外，还可通过动物性食品尤其是污染的牛乳经消化道而感染，病畜肉对人也有一定威胁。因此，牛乳或肉食品中的结核杆菌污染以及奶牛等畜禽的结核病在食品卫生方面具有重要意义，是预防人类结核病的重要环节。一、结核分支杆菌与结核病In1882,afewyearsafterhediscoveredthebacillusresponsibleforanthrax,GermanphysicianRobertKoch(1843-1910)publishedhisstudiesrevealingtheorganismbehindTB,Mycobacteriumtuberculosis.Suddenly,contaminatedrawmilk,andit'sroleininfantmortality,becamealotclearer.二、生物学特性（一）形态与染色特性

结核分枝杆菌为细长略带弯曲、两端钝圆的杆菌，长1~4μm，宽0.2~0.5μm。牛分枝杆菌则比较粗短。无芽孢，无动力。在陈旧培养物或干酪化的淋巴结中可看到分枝状。分枝杆菌属的细菌细胞壁脂质含量较高，约占干重的60%，特别是有大量分枝菌酸(mycolicacid)包围在肽聚糖层的外面，可影响染料的穿入，若经加温或延长染色时间而着色后能抵抗强脱色剂盐酸乙醇的脱色，故又称抗酸杆菌(acid-fastbacilli)。二、生物学特性（一）形态与染色特性

分枝杆菌一般用齐尼（Ziehl-Neelsen)抗酸染色法，以5%石炭酸复红加温染色后可以染上，但用3%盐酸乙醇不易脱色。若再加用美蓝复染，则分枝杆菌呈红色，而其他细菌和背景中的物质为蓝色。近年发现结核分枝杆菌在细胞壁外尚有一层荚膜。一般因制片时遭受破坏而不易看到。若在制备电镜标本固定前用明胶处理，可防止荚膜脱水收缩，在电镜下可看到菌体外有一层较厚的透明区，即荚膜。荚膜对结核分枝杆菌有一定的保护作用。

（二）培养特性专性需氧。最适温度为37℃，低于30℃不生长。对营养要求较高，必须在含有血清或卵黄、某些无机盐和碳源的特殊培养基上才能生长。即使在最适条件下生长仍很缓慢，需10~20d才能在固体培养基上出现可见菌落。常用的有罗氏（Lowenstein-Jensen）固体培养基。菌落为浅黄色，小而干燥，不透明，表面粗糙、皱缩，形似菜花心。在液体培养基中一般1～2周即可生长，可形成菌膜，加入吐温-80（Tween-80）等表面活性剂，则可提高细菌生长率，并使其均匀生长。二、生物学特性（三）生化特性各型结