实验二动物细胞培养液的配制与灭菌1

细胞生物学与细胞工程实验的总体安排

（10-18周）实验一显微镜的技术参数及特殊光镜的演示实验实验二动物细胞培养液的配制与灭菌实验三动物细胞的组织块培养法实验四动物组织的消化及细胞冻存实验五细胞复苏及活力测定实验六细胞骨架的光镜观察实验七小鼠骨髓细胞染色体玻片标本的制作实验八细胞融合实验九血涂片的制备及细胞大小的测量实验二

动物细胞培养液的配制与灭菌

实验类型：验证型

一、实验目的与要求了解动物细胞培养对条件设施的要求；掌握动物细胞培养用液的种类及作用；学习各种动物细胞培养用液的配制方法及灭菌方法。二、实验原理无污染环境（无毒、无菌）：无菌培养室（更衣间、缓冲间、操作间）、新洁尔灭擦拭地面、超净工作台温度适宜；溶解氧、pH和气体环境各类营养成分：糖（能量）、氨基酸（合成蛋白质的原料）、维生素（细胞内酶的辅酶或辅基）、生长因子（激素类等促进细胞增殖）渗透压附着物（贴壁生长）等1、细胞培养的基本条件：气体环境温度和pH细胞培养的条件营养无菌无毒环境无机盐、微量元素、葡萄糖、氨基酸、促生长因子等

温度：36～37

pH:7.2~7.4

95%空气和5%CO2

(维持培养液pH)

培养基中加入抗生素

超净台2、常用细胞培养用液：水培养基：天然培养基、合成培养基、无血清培养基生理盐液：PBS消化用液：胰蛋白酶抗生素液：青链霉素3、常用的灭菌方式：紫外线消毒:紫外线是一种低能量的电磁辐射，可杀死多种微生物。紫外线的直接作用是通过破坏微生物的核酸及蛋白质等而使其灭活，间接作用是通过紫外线照射分解空气中的氧气形成臭氧杀死微生物。蒸汽湿热灭菌法：是目前最常用的一种灭菌方法。它利用高压蒸汽以及在蒸汽环境中存在的潜热作用和良好的穿透力，使菌体蛋白质凝固变性而使微生物死亡。湿热灭菌法一般采用121℃，灭菌20-30min。高温干热灭菌法：恒温干燥箱，120ºC～150ºC的高热。果蝇培养瓶、玻璃试剂瓶等。过滤除菌：是将液体或气体通过有微孔的滤膜过滤，使大于滤膜孔径的细菌等微生物颗粒阻留，从而达到除菌的方法。培养基等的灭菌。化学消毒法：仅限于表面的消毒。用于不能用物理方法进行消毒的物品、空气、工作面、操作者皮肤以及某些实验器皿等。酒精甲醛高锰酸钾抗生素：用于培养液，是培养过程中预防微生物污染的重要手段以及作为微生物污染不严重时的“急救”措施三、实验仪器与材料仪器：玻璃杯，玻璃棒，电子天平，量筒，

PH试纸，试剂瓶等试剂：NaCl,KCl,Na2HPO4·12H2O，KH2PO4，HCl,NaOH，NaHCO3，DMEM，

蒸馏水，双蒸水四、实验内容1、配制PBS（1）烧杯中加适量的蒸馏水或去离子水;（2）准确称量药品，依次放入烧杯;（3）人工搅拌或磁力搅拌器搅拌使药品充分溶解;（4）调节PH值使之约为7.2;（5）定容；（6）高压灭菌,120℃15分钟；（7）分装保存。2、

配制100mlDMEM培养基（1）烧杯中加适量的蒸馏水或去离子水;（2）准确称量药品DMEM1.17g，（3）准确称量药品NaHCO30.37g;（4）准确称量药品谷胺酰胺0.003g；（5）准确称量药品HEPES（乙基哌嗪乙硫磺酸）0.5958g,

依次放入烧杯;加入青霉素100IU/ml、链霉素100ug/ml.（6）人工搅拌或磁力搅拌器搅拌使药品充分溶解;（7）调节PH值使之约为7.2;（8）定容；（9）过滤灭菌；（10）分装保存。3、PBS的高压灭菌高压灭菌锅，120℃，15分钟2013-2014-1遗传学实验14、DMEM培养基滤器灭菌（1）将塑料环放在上盖与下底之间，锁紧。用双层牛皮纸包好高压蒸汽灭菌。

（2）选一个适当的容器，如锥形瓶﹑试管﹑窄口瓶等亦高压蒸汽灭菌。

（3）将微孔滤膜用平头镊子夹住，放在微孔滤膜装置中一起高压蒸汽灭菌。

（4）将需要灭菌的实验器材溶液配置好。

（5）将无菌的微孔滤膜装置由下底口套在无菌的容器上。用塑料注射筒吸取要灭菌的溶液。

（6）注射筒口插入微孔滤膜过滤装置之上盖口。

挤压注射筒的推管，使溶液流经微孔滤膜流入无菌容器中。（7）移去微孔滤膜，将容器口通过酒精灯火焰，盖上盖子标上溶液名称及日期。

（8）拆开微孔滤膜装置，将微孔滤膜丢掉（或灭菌后丢弃），其它装置清洗干净。

本次实验的任务每组配制1LPBS生理盐液，并包好瓶口；每组仔细清洗5-6个培养皿和细胞培养瓶（保证每人一个），分别一起包好；注意事项1、注意高压灭菌锅的安全使用。2、注意滤器灭菌时