分子生物学第一章绪 论

绪论一、分子生物学的基本含义分子生物学是从分子水平研究生命本质为目的的一门新兴边缘学科，它以核酸和蛋白质等生物大分子的结构及其在遗传信息和细胞信息传递中的作用为研究对象，是当前生命科学中发展最快并正在与其它学科广泛交叉与渗透的重要前沿领域。所谓在分子水平上研究生命的本质主要是指对遗传、

生殖、生长和发育等生命基本特征的分子机理的阐明，从而为利用和改造生物奠定理论基础和提供新的手段。分子水平指的是那些携带遗传信息的核酸和在遗传信息传递及细胞内、细胞间通讯过程中发挥着重要作用的蛋白质等生物大分子。生物大分子均具有较大的分子量，由简单的小分子核苷酸或氨基酸排列组合以蕴藏各种信息，并且具有复杂的空间结构以形成精确的相互作用系统，由此构成生物的多样化和生物个体精确的生长发育和代谢调节控制系统。阐明这些复杂的结构及结构与功能的关系是分子生物学的主要任务。Mendel的遗传因子阶段摩尔根的基因阶段顺反子阶段现代基因阶段一、基因的发展Mendel的遗传因子阶段Mendel提出：生物的某种性状是由遗传因子负责传递的。是颗粒性的，体细胞内成双存在，生殖细胞内成单存在。遗传因子是决定性状的抽象符号。1866年发表论文，提出分离规律和独立分配规律；1900年Mendel遗传规律被重新发现1909年丹麦遗传学家Yohannsen(1859-1927)发表了“纯系学说”首先提出了“基因”的概念，代替了Mendel“遗传因子”的概念。但没有提出基因的物质概念。Morgan的基因阶段MorganT.H.等提出了基因的连锁遗传规律。说明了基因是在染色体上占有一定空间的实体。基因不再是抽象符号，被赋予物质内涵。顺反子阶段1957年，本泽尔（SeymourBenzer）以T4噬菌体为材料，在DNA分子水平上研究基因内部的精细结构，提出了顺反子（cistron）概念。顺反子是1个遗传功能单位，1个顺反子决定1条多肽链。现代基因阶段操纵子（operon）：结构基因+调控元件+调节基因LacOperon2．跳跃基因

指DNA能在有机体的染色体组内从1个地方跳到另一个地方，它们能从1个位点切除，然后插入同一或不同染色体上的另一个位置。3．断裂基因

1个基因被间隔区分成不连续的若干区段，这种编码序列不连续的间断基因被称为断裂基因。4．假基因

不能合成出功能蛋白质的失活基因

。5．重叠基因

不同基因的核苷酸序列有时是可以共用的即重叠的。

1983年，McClintock由于在50年代提出并发现了可移动遗传因子（jumpinggene或称mobileelement）而获得Nobel奖。BarbraMcClintock1993年，美国科学家Roberts和Sharp因发现断裂基因(introns)而获得Nobel奖Gene的定义“基因”的分子生物学定义是：产生一条多肽链或功能RNA所必需的全部核苷酸序列。Agenecanbedefinedasfollowing:

TheentirenucleicacidsequencethatisnecessaryforthesynthesisofafunctionalpolypeptideorRNAmolecule.分子生物学发展简史19世纪后期到20世纪50年代初，是现代分子生物学诞生的准备和酝酿阶段。在这一阶段产生了两点对生命本质的认识上的重大突破.确定了蛋白质是生命的主要基础物质确定了DNA是生物遗传的物质基础一、准备和酝酿阶段19世纪末Buchner兄弟证明酵母无细胞提取液能使糖发酵产生酒精，第一次提出酶（enzyme）的名称，酶是生物催化剂。20世纪20-40年代提纯和结晶了一些酶（包括尿素酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、黄酶、细胞色素C、肌动蛋白等），证明酶的本质是蛋白质。随后陆续发现生命的许多基本现象（物质代谢、能量代谢、消化、呼吸、运动等）都与酶和蛋白质相联系，可以用提纯的酶或蛋白质在体外实验中重复出来。在此期间对蛋白质结构的认识也有较大的进步。1902年EmilFisher证明蛋白质结构是多肽；40年代末，Sanger创立二硝基氟苯（DNFB）法、Edman发展异硫氰酸苯酯法分析肽链N端氨基酸；1953年Sanger和Thompson完成了第一个多肽分子--胰岛素A链和B链的氨基全序列分析。由于结晶X-线衍射分析技术的发展，1950年Pauling和Corey提出了α-角蛋白的α-螺旋结构模型。所以在这阶段对蛋白质一级结构和空间结构都有了认识。遗传物质是核酸的确定肺炎双球菌的转化实验噬菌体侵染细菌实验烟草花叶病毒的重建实验结论：加热杀死的S型菌有某种转化因子Avery在1944年更精密的实验设计提取可能的转化因子：DNA、RNA、蛋白质、荚膜进行试验分别用降解DNA、RNA、蛋白质的酶作用于S型菌细胞抽提物组分提纯试验结果：DNA组分纯度越高，转化效率越高。结论：使R型菌变为S型菌的物质是S型菌的DNAAvery在1944年的报告中这样写道：当溶液中酒精的体积达到9/10时，有纤维状物质析出；如稍加搅动，这种物质便会像棉线绕在线轴上一样绕在硬棒上，溶液中的其他成分则以颗粒状沉淀留在下面。溶解纤维状物质并重复沉淀数次，可提高其纯度。这一物质具有很强的生物学活性，初步实验证实它很可能就是DNA。T2噬菌体感染试验

（1952年，Hershey&Chase）

病毒重建试验杂种病毒的感染特征和蛋白质外壳的特性是由其中的RNA决定的，而不是蛋白质决定的结论证明核酸（DNA或RNA）是遗传的物质基础简单的细菌（或病毒）解决复杂而重大的问题微生物与高等生物具有共同的遗传本质二、现代分子生物学的建立和发展阶段1962年，Watson和Crick因为在1953年5月25日的《Nature》提出DNA的反向平行双螺旋模型而与Wilkins共获Noble生理医学奖，后者通过X射线衍射证实了Watson-Crick模型。Watson和Crick所提出的脱氧核糖酸双螺旋模型，为充分揭示遗传信息的传递规律铺平了道路。1、DNA双螺旋模型的提出TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine1962：fortheirdiscoveriesconcerningthemolecularstructureofnucleicacidsanditssignificanceforinformationtransferinlivingmaterial.

Wilkins通过对DNA分子的X射线衍射研究证实了该模型。RosalindE.Franklin1920-1958被遗忘的英格兰玫瑰

RosalindE.Franklin1920-1958在发现DNA双螺旋结构同时，Watson和Crick就提出DNA复制的可能模型。其后在1956年A.Kornbery首先发现DNA聚合酶；1958年Meselson及Stahl用同位素标记和超速离心分离实验为DNA半保留模型提出了证明；1968年Okazaki（冈畸）提出DNA不连续复制模型；1972年证实了DNA复制开始需要RNA作为引物；70年代初获得DNA拓扑异构酶，并对真核DNA聚合酶特性做了分析研究。

完善了对DNA复制机理的认识3、中心法则和操纵子学说的提出以Nireberg等为代表的一批科学家经过艰苦的努力，确定了遗传信息以密码方式传递，每三个核苷酸组成一个密码子，代表一个氨基酸，到1966年，全部破译了64个密码子，并提出了遗传信息传递的“中心法则”。在研究DNA复制将遗传信息传给子代的同时，提出了RNA在遗传信息传到蛋白质过程中起着中介作用的假说。1958年Weiss及Hurwitz等发现依赖于DNA的RNA聚合酶；1961年Hall和Spiegelman用RNA-DNA杂交证明mRNA与DNA序列互补；逐步阐明了RNA转录合成的机理。

1968年，Nirenberg，Holley和Khorana共享诺贝尔生理医学奖Nirenberg：破译DNA遗传密码；Holley：阐明了酵母丙氨酸tRNA的核苷酸序列，并证实了所有tRNA具有结构上的相似性；Khorana：第一个合成了核酸分子，并且人工复制了酵母基因。中心法则

Crick于1954年所提出的遗传信息传递规律1954年首次提出的“中心法则”1970-1980年的“中心法则”21世纪后修正的“中心法则”1961年，法国科学家Jacob和Monod提出并证实了操纵子（operon）作为调节细菌细胞代谢的分子机制。他们还推测存在一种与DNA序列相互补、能将它所编码的遗传信息带到蛋白质合成场所并翻译产生蛋白质的mRNA（信使核糖核酸）。对分子生物学的发展产生了极其重要的指导作用。FrancoisJacob(Left),JacquesMonod(Center)&AndreLwoff(Right),1965分享了诺贝尔生理医学奖三、初步认识生命本质并开始改造生命的深入发展阶段工具酶的发现和应用1970年Smith等分离并纯化了限制性核酸内切酶HindII；1972年，H.W.Boyer等相继发现了EcoRI

一类重要的限制性内切酶。1967年，世界上有五个实验室几乎同时发现DNA连接酶，特别是1970年H.G.Khorana等发现的T4DNA连接酶具有更高的连接活性。1970年，Baltimore等和Temin等在RNA肿瘤病毒中各自发现了反转录酶，完善了中心法则，用于构建cDNA

文库。1.重组DNA技术的建立和发展1970年Smith等分离并纯化了限制性核酸内切酶HindII；1972年，H.W.Boyer等相继发现了EcoRI

一类重要的限制性内切酶。1967年，世界上有五个实验室几乎同时发现DNA连接酶，特别是1970年H.G.Khorana等发现的T4DNA连接酶具有更高的连接活性。1970年，Baltimore等和Temin等在RNA肿瘤病毒中各自发现了反转录酶。载体的发现及其应用载体主要是小分子量的复制子如：病毒、噬菌体、质粒。1972年，美国Stanford大学的P.Berg等首次成功地实现了DNA的体外重组；pSC101质粒载体，ColE1质粒载体，pBR322质粒载体，pUC质粒载体，pGEM-3Z质粒，穿梭质粒载体，pBluescript噬菌粒载体etc.在多克隆位点区（MCS）的两侧，存在一对T3和T7噬菌体的启动子，用以定向指导插入在多克隆位点上的外源基因的转录活动；具有单链噬菌体M13或f1的复制起点和一个来自ColE1质粒的复制起点，保证pBluescript噬菌粒载体在有或无辅助噬菌体共感染的不同情况下，按照不同的复制形式分别合成出单链或双链DNA；编码有一个氨苄青霉素抗性基因，作为转化子克隆的选择标记；含有一个lacZ基因，可以按照X-gal-IPTG组织化学显色法筛选噬菌粒载体的重组子。

LacZ编码β-半乳糖苷酶氨基端146个氨基酸的α-肽，IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）诱导该基因表达，合成的β-半乳糖苷酶α-肽能与宿主细胞所编码的缺陷型β-半乳糖苷酶相互补，产生有活性的β-半乳糖苷酶，能水解外源加入培养基中的X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷），生成蓝色的溴氯吲哚，使生长于含X-gal培养基中的转化菌落呈蓝色。重组子导入受体细胞技术1944年，肺炎链球菌被成功转化。1970年，大肠杆菌才被成功转化，得益于CaCl2的应用转化定义：同源或异源的游离DNA分子(质粒和染色体DNA)被自然或人工感受态细胞摄取，并得到表达的基因转移过程。感受态细胞：具有摄取外源DNA能力的细胞。自然遗传转化1928年，Griffith发现肺炎链球菌（S.pneumoniae）的转化现象。目前已知有二十多个种的细菌具有自然转化的能力:枯草芽孢杆菌：20%细胞出现感受态，持续几小时；肺炎链球菌：培养后100%细胞为感受态；、大肠杆菌不能出现自然的感受态状态。必备条件：1.建立了感受态的受体细胞；2.外源游离DNA分子。人工转化在自然转化的基础上发展和建立的一项细菌基因重组手段，是基因工程的奠基石和基础技术。不是由细菌自身的基因所控制；用多种不同的技术处理受体细胞，使其人为地处于一种可以摄取外源DNA的“人工感受态”质粒的转化效率高，因为质粒的转化多数情况下不涉及重组过程。2、基因组研究的发展分子生物学已经从研究单个基因发展到研究生物整个基因组的结构与功能。1977年Sanger测定了ΦX174-DNA全部5375个核苷酸的序列；1978年Fiers等测出SV-40DNA全部5224对碱基序列；80年代λ噬菌体DNA全部48,502碱基对的序列全部测出；一些小的病毒包括乙型肝炎病毒、艾滋病毒等基因组的全序列也陆续被测定；1996年底许多科学家共同努力测出了大肠杆菌基因组DNA的全序列长4x106碱基对。.1990年人类基因组计划（HumanGenomeProject）开始实施分子生物学与其他学科的关系分子生物学是由生物化学、生物物理学、遗传学、微生物学、细胞学、以至信息科学等多学科相互渗透、综合融会而产生并发展起来的，凝聚了不同学科专长的科学家的共同努力。它虽产生于上述各个学科，但已形成它独特的理论体系和研究手段，成为一个独立的学科。生物化学与分子生物学关系最为密切。两者同在我国教委和科委颁布的一个二级学科中，称为“生物化学与分子生物学”，但两者还是有区别的。生物化学是从化学角度研究生命现象的科学，它着重研究生物体内各种生物分子的结构、转变与新陈代谢。传统生物化学的中心内容是代谢，包括