专题1《基因工程》

专题一基因工程１.基因工程的概念这种技术是在生物体外，通过对DNA分子进行人工“剪切”和“拼接”，对生物的基因进行改造和重新组合，然后导入受体细胞内进行无性繁殖，使重组基因在受体细胞内表达，产生出人类所需要的基因产物。（DNA重组技术）一、基因工程的基本操作工具识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。主要是从原核生物中分离纯化出来的一种酶化学本质：蛋白质。

1、来源：3、作用：4、结果：形成两种末端“分子手术刀”——限制酶黏性末端平末端可用于目的基因和载体的切割2、特性：限制酶是一类酶，而不是一种酶。GAATTCGCTTAAAATTCG限制酶切割ＤＮＡ分子示意图CTTAAG黏性末端黏性末端什么叫平末端？……GAATTC…………CTTAAG…………GAATTC…………CTTAAG……EcoRⅠ……GAATTC…………CTTAAG…………GAATTC…………CTTAAG……不同来源的DNA片段混合将不同种来源的DNA片段连接起来生物A基因片段生物B基因片段……GAATTC…………CTTAAG……酶切……GAATTC…………CTTAAG…………GAATTC…………CTTAAG…………GAATTC…………CTTAAG……同一种用同一种限制性酶处理不同DNA片段，会形成同样的黏性末端，可进行重组。一G↓GATCC一一CCTAGG一一↓GATC一一CTAG一限制酶I限制酶Ⅱ……GAATTC…………CTTAAG……EcoRⅠ同一种DNA片段用不同限制性酶处理，形成的黏性末端一般不相同。黏性末端相同黏性末端不相同基因工程疑难问题的解读：1、限制酶识别序列的方向性：限制酶识别序列是指5ˊ------3ˊ那条链上的碱基序列.2、限制酶特异性的理解：一般情况下，一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，这就是限制酶的特异性。但有些特例，不同的限制酶识别同一种碱基序列且切点相同。如：BamHⅠ、BstⅠ都可识别——GGATCC——序列。不同限制酶切割DNA分子后产生相同粘性末端。如：BamHⅠ识别——GGATCC——序列,切点在G与G之间；BglⅡ识别——AGATCT——，切点在A与G之间；粘性末端均为——ACTAG和GATC——。少数限制酶却可识别不止一种碱基序列。同裂酶（Isoschizomers）有些来源不同的限制酶却识别和切割相同的序列，这类限制酶称为同裂酶。同裂酶产生同样切割，形成同样的末端，酶切后所得到的DNA片段经连接后所形成重组序列，仍可能被原来的限制酶所切割。同裂酶之间的性质有所不同（如对离子强度、反应温度以及对甲基化碱基的敏感性等方面可能有所差别）。同尾酶(Isocaudomers)有些来源不同的限制酶，识别及切割序列各不相同，但却能产生出相同的粘性末端，这类限制酶称为同尾酶。但两种同尾酶切割形成的DNA片段经连接后所形成的重组序列，不能被原来的限制酶所识别和切割。EcoRI

和MunI属于同尾酶。“分子缝合针”—ＤＮＡ连接酶

１.作用：连接磷酸二酯键,而不是氢键。E·coliDNA连接酶：连接黏性末端T4DNA连接酶：连接黏性末端和平末端２.DNA连接酶的种类3.DNA连接酶的作用部位：脱氧核苷酸链上相邻的两个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键DNA连接酶DNA连接酶无特异性，其催化DNA片段末端形成磷酸二脂键。连接情况有两种：一是催化互补的粘性末端连接，二是催化平末端连接。只要是相同的粘性末端、平末端DNA连接酶就能催化连接，而与切割的限制酶无关。DNA连接酶DNA聚合酶连接DNA链连接部位相同点双链单链在两DNA片段之间形成磷酸二酯键将单个脱氧核苷酸加到已存在的核酸片段上，形成磷酸二酯键都能形成磷酸二酯键DNA聚合酶和DNA连接酶有何相同点和不同点？种类项目限制酶DNA连接酶DNA聚合酶解旋酶作用底物DNA分子DNA分子片段脱氧核苷酸DNA分子作用部位磷酸二酯键磷酸二酯键磷酸二酯键碱基对间的氢键作用特点切割目的基因及载体，能专一性识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开了的两个核苷酸之间的磷酸二酯键只能将单个脱氧核苷酸添加到脱氧核苷酸链上将DNA两条链之间的氢键打开作用结果形成黏性末端或平末端形成重组DNA分子形成新的DNA分子形成单链DNA分子

“分子运输车”—载体1.载体的必要条件能自我复制，或能进入受体生物细胞并在受体生物细胞内复制并表达；有一个至多个限制酶切割位点，供外源DNA片段插入。具有某些标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。2.载体的种类：质粒、噬菌体和动植物病毒。3.常用的载体：质粒

提醒①一般来说，天然载体往往不能满足人类的所有要求，因此人们根据不同的目的和需要，对某些天然的载体进行人工改造。

②常见的标记基因有抗生素抗性基因、产生特定颜色的表达产物基因、发光基因等。

③作为载体必须具有一个至多个限制酶切点，而且每种酶的切点最好只有一个。因为某种限制酶只能识别单一切点，若载体上有一个以上的酶切点，则切割重组后可能丢失某些片段，若丢失的片段含复制起点区，则进入受体细胞后便不能自主复制。一个载体若只有某种限制酶的一个切点，则酶切后既能把环打开接纳外源DNA片段，又不会丢失自己的片段。

④注意与细胞膜上载体的区别，两者的化学本质和作用都不相同。

⑤质粒能自我复制，既可在自身细胞、受体细胞内，也可在体外。1、下列关于限制酶的说法正确的是（）A、限制酶广泛存在于各种生物中，但微生物中很少B、一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列C、不同的限制酶切割DNA后都会形成黏性末端D、限制酶的作用部位是特定核苷酸形成的氢键B2.不属于质粒被选为基因运载体的理由是（）

A、能复制B、有多个限制酶切点

C、具有标记基因D、它是环状DNAD3.右图为DNA分子结构示意图，对该图的正确描述是A．④的名称是胞嘧啶脱氧核苷酸B．解旋酶作用的部位是⑨C．某限制性核酸内切酶可选择⑨处作为切点D．DNA连接酶可连接⑩处断裂的化学键BD4．下图为DNA分子在不同酶的作用下所发生的变化，图中依次表示限制性核酸内切酶、DNA聚合酶、DNA连接酶、解旋酶作用的正确顺序是

(

)

A．①②③④

B．①②④③C．①④②③

D．①④③②C5．可以用于重组DNA技术的酶是(多选) A．DNA聚合酶B．限制性核酸C．DNA连接酶D．反转录酶解析：DNA重组技术会用DNA聚合酶(实现目的基因的扩增，如PCR)、限制性核酸内切酶(目的基因的切割和运载体的切割)、DNA连接酶(目的基因与运载体的连接)、反转录酶(目的基因的获取)。ABCD6．下列有关限制性内切酶识别的叙述，不正确的是: A．从反应类型来看，限制性内切酶催化的是一种水解反应

B．限制性内切酶的活性受温度、pH的影响

C．一种限制性内切酶只能识别双链DNA中某种特定的脱氧核苷酸序列

D．限制性内切酶识别序列越短，则该序列在DNA中出现的几率就越小D解析：染色体由DNA和蛋白质构成；原核生物没有染色体；质粒可以做为基因工程的载体，而染色体不行。7．(2010·南京三模)下列关于染色体和质粒的叙述，正确的是 (

)A．染色体和质粒的化学本质都是DNAB．染色体和质粒都只存在于原核细胞中C．染色体和质粒都与生物的遗传有关D．染色体和质粒都可作为基因工程的常用载体C9、限制酶是一种核酸切割酶，可辨识并切割DNA分子上特定的核苷酸碱基序列。下图为四种限制酶BamHI，EcoRI，HindⅢ以及BglⅡ的辨识序列。箭头表示每一种限制酶的特定切割部位，其中哪两种限制酶所切割出来的DNA片段末端可以互补黏合？其正确的末端互补序列为何？

A.BamHI和EcoRI；末端互补序列—AATT—B.BamHI和HindⅢ；末端互补序列—GATC—C.

EcoRI和HindⅢ；末端互补序列—AATT—D.BamHI和BglII；末端互补序列—GATC—D10、用DNA连接酶把被限制酶Ⅰ（识别序列和切点是---↓GATC---）切割后的质粒和被限制酶Ⅱ（识别序列和切点是---G↓GATCC---）切割过的目的基因连接起来形成重组质粒，该重组质粒能够被限制酶Ⅱ完全切割开的概率是（）

A.1/4B.1/16C.7/16D.3/4C11、用限制酶E将长度为5.0kbp（千碱基对）的质粒的一处切断；接着用限制酶E切割某一DNA分子得长度为1.5kbp的目的基因；再用DNA连接酶连接成重组质粒，扩增。现用限制酶B、E、H对克隆的重组质粒进行切割，电泳分离的结果如图。则用限制酶B和限制酶H共同完成切割一个重组质粒，预计产生的片段长度（kbp）可能是（多选）A.2.0、3.0、1.0和0.5B.2.0、3.0、0.5、0.5和0.5C.3.0、和3.5D.2.5和4.0EB+EH+EDNA片段长度5.05.03.02.00.51.01.51.5CD二、基因工程的基本操作程序基因工程基本操作的四个步骤1、目的基因的获取2、基因表达载体的构建3、将目的基因导入受体细胞4、目的基因的检测与鉴定一.目的基因的概念主要是指编码蛋白质基因，也可以是一些具有调控作用的因子。例如：与生物抗逆性相关的基因，与生物优良品质相关的基因，药物和保健品相关的基因，与毒物降解相关的基因，以及与工业所需要酶相关的基因。

目前被广泛提取使用的目的基因有：苏云金杆菌抗虫基因、植物抗病基因（抗病毒、抗细菌)、人胰岛素基因等。1.基因的结构（1）原核生物基因结构编码区非编码区非编码区编码区上游编码区下游编码蛋白质调控遗传信息的表达（调控程序）…A‥………ATGTGCACGTAGTTA………‥G……T‥………TACACGTGCATCAAT………‥C…启动子终止子编码区非编码区非编码区启动子终止子ATGTGCACGTAGTTATACACGTGCATCAATRNA聚合酶AUGUGCACGUAGUUA

启动子：位于基因首端一段能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列。没有启动子，基因就不能转录。

RNA聚合酶:能够识别启动子上的结合位点并与其结合的一种蛋白质.

终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，它能阻碍RNA聚合酶的移动，并使其从DNA模板链上脱离下来，使转录终止。编码区非编码区非编码区（能编码蛋白质）启动子终止子（2）真核与原核生物基因结构的比较外显子内含子编码蛋白质（不能编码蛋白质）①相同点：都是由能够编码蛋白质的编码区和具有调控作用的非编码区。②不同点：原核细胞基因的编码区是连续的；真核细胞的编码区是间隔的，不连续的。真核生物基因结构外显子：真核细胞基因DNA中的编码序列，这些序列被转录成RNA并进而翻译为蛋白质。内含子

：真核细胞基因DNA中的间插序列，这些序列被转录成RNA，但随即被剪除而不翻译。从基因文库中寻找聚合酶链式反应（PCR）扩增化学合成法目的基因的核苷酸序列未知目的基因的核苷酸序列已知（一）、获取目的基因的常用方法有哪些?初始目的基因的来源1.从生物中直接获取2.人工合成注意：要保持基因的完整性1、从基因文库中获取目的基因

将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库.基因文库

基因组文库部分基因文库（如:cDNA文库）基因文库如何从基因文库中得到所需要的基因？依据：目的基因的有关信息如：根据基因的核苷酸序列基因的功能基因在染色体上的位置基因的转录产物mRNA

基因翻译产物蛋白质等特性。是否一定要构建基因文库？未知目的基因序列时①概念：PCR全称为_______________，是一项在生物____复制___________的核酸合成技术③条件：___________、_______________、___________、

___________

.

②原理：__________聚合酶链式反应体外特定DNA片段DNA复制模板DNA四种脱氧核苷酸DNA引物热稳定DNA聚合酶2.利用PCR扩增目的基因已知目的基因序列时④方式：以_____方式扩增，即____（n为扩增循环的次数）⑤结果：使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增④过程a、变性（90℃-95℃）：双链DNA模板在热作用下，_____断裂，形成___________b、复性（复性55℃-60℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，合成与模板互补的________。氢键单链DNA双链DNA链3.人工合成——根据已知的氨基酸序列合成DNA蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列推测推测目的基因化学合成已知核苷酸序列的较小基因可以化学合成，不需要模板。质粒目的基因限制酶处理一个切口两个黏性末端两个切口获得目的基因DNA连接酶表达载体同一种1.过程二、基因表达载体的构建——核心限制酶切割位点的选择必须保证目的基因，标记基因的完整性，以便于检测和表达。a、使目的基因在受体细胞中稳定存在并遗传给子代b、同时使目的基因能表达和发挥作用思考：作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？2、基因表达载体的作用3.基因表达载体的组成：它们有什么作用？a、目的基因b、启动子c、终止子d、标记基因位于基因的首端,是mRNA结合位点位于基因的末端,终止转录检测目的基因是否导入受体细胞基因表达载体1、组成：目的基因+启动子终止子标记基因+++复制原点2、目的基因、启动子、终止子不是质粒上固有的，标记基因、复制原点是质粒上固有的。3、如果目的基因是从基因组文库中获取的，因为目的基因本身已含有启动子、终止子，在构建表达载体时，就不需要在加启动子、终止子。如果目的基因是从部分基因文库中获取的，因为目的基因本身不含有启动子、终止子，在构建表达载体时，就需要在加启动子、终止子。4、单切酶法与双切酶法单切酶法就是用同一种限制酶切割含目的基因的DNA片段和载体，形成相同的黏性末端，可用DNA连接酶连接重组DNA。由于单切酶切割后目的基因的前后各有一个互补的黏性末端，这两个互补的黏性末端会发生碱基互补配对使目的基因前后相连，形成自身连接，自我环化。同理质粒在DNA连接酶的作用下也会出现前后相连，形成自身连接。双切酶法就是用两种不同的限制酶切割含目的基因的DNA片段和载体，使它产生两个不同的黏性末端，此时目的基因、载体就不会发生自我环化。而且在DNA连接酶的作用下，载体只能与目的基因的相应末端互补连接成重组质粒。常用的受体细胞：

有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。将目的基因导入受体细胞的原理借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。三、将目的基因导入受体细胞—转化1、将目的基因导入植物细胞①农杆菌转化法②基因枪法③花粉管通道法2、将目的基因导入动物细胞显微注射技术：将基因表达载体提纯，用显微仪注射到受精卵中3、导入微生物细胞①原核生物特点：繁殖快、单细胞、遗传物质少用Ca2+处理细胞感受态细胞表达载体与感受态细胞混合感受态细胞吸收DNA分子②方法：受体细胞受体细胞的种类：动物，植物细胞，微生物。基因工程的目的不同，可选择的受体细胞不同。若生产基因工程药品，受体细胞一般选用微生物，利用微生物繁殖速度快的特点，可在短期内获得大量产品。若培养转基因动物，则选用受精卵。受体细胞的选择：四、目的基因的检测与鉴定检测①导入检测：目的基因是否导入受体细胞方法——DNA分子杂交②表达检测转录检测——分子杂交翻译检测——抗原抗体杂交分子检测法鉴定抗虫鉴定抗病鉴定活性鉴定等个体水平的鉴定1．下列有关基因工程技术的正确叙述是（）A．重组DNA技术所用的工具酶是限制酶、连接酶和载体B．所有的限制酶都只能识别同一种特定的核苷酸序列C．选用细菌作为重组质粒的受体细胞是因为细菌繁殖快D．只要目的基因进入了受体细胞就能成功实现表达C

2.科学家运用基因工程技术将人胰岛素基因与大肠杆菌的质粒DNA分子重组，并且在大肠杆菌体内获得成功表达。图示a处为胰岛素基因与大肠杆菌质粒DNA结合的位置，它们彼此能结合的依据是（）A．基因自由组合定律B．半保留复制原则C．基因分离定律 D．碱基互补配对原则D

3.在基因工程中，把选出的目的基因（共1000个脱氧核苷酸对，其中腺嘌呤脱氧核苷酸460个），放入DNA扩增仪中扩增4代，那么，在扩增仪中应放入胞嘧啶脱氧核苷酸的个数是A．540个B．7560个C．8100个 D．17280个C540×（24－1）=81004．下图表示一项重要的生物技术，对图中物质a、b、c、d的描述，正确的是

A．a的基本骨架是磷酸和核糖交替连接而成的结构B．要获得相同的黏性末端，可以用不同种b切割a和dC．c连接双链间的A和T，使黏性末端处碱基互补配对D．若要获得未知序列d，可到基因文库中寻找解析：从图示看，a中含有胸腺嘧啶，故其基本骨架是磷酸和脱氧核糖交替连接而成；DNA连接酶缝合目的基因和载体质粒之间的缝隙，使两者之间形成磷酸二酯键；若要获得未知序列的目的基因，可从基因文库中寻找；若要获得相同的黏性末端，可以用不同种的限制性核酸内切酶处理，如识别↓GATC的限制性核酸内切酶和识别G↓GATCC的限制性核酸内切酶处理目的基因和载体质粒就可以形成相同的黏性末端。B解析：质粒在某些真核细胞中也有，如酵母菌；将目的基因连接到质粒上，不但要用到DNA连接酶，在连接之前要用同一种限制酶处理以得到相同的黏性末端；植物的体细胞都具有全能性，因此都可以作为受体细胞；由于重组质粒只结合在某条染色体上，因此有的配子就没有目的基因。5．科学家在某种植物中找到了抗枯萎的基因，并以质粒为载体，采用转基因方法培育出了抗枯萎病的金茶花新品种，下列有关说法正确的是(

)A．质粒是最常用的载体之一，它仅存在于原核细胞中B．将抗枯萎基因连接到质粒上，用到的工具酶仅是DNA连接酶C．用叶肉细胞作为受体细胞培育出的植株不能表现出抗枯萎性状D．通过该方法获得的抗枯萎病金茶花，产生的配子不一定含抗枯萎病基因D6.下列获取目的基因的方法中，需要模板的是（）A.从基因文库中获取目的基因B.利用PCR扩增目的基因C.构建cDNA文库D.通过DNA合成仪利用化学方法人工合成目的基因BC7．下图是获得抗虫棉的技术流程示意图。卡那霉素抗性基因(kanr)常作为标记基因，只有含卡那霉素抗性基因的细胞才能在卡那霉素培养基上生长。下列叙述正确的是

A．构建重组质粒过程中需要限制性核酸内切酶和DNA连接酶B．愈伤组织的分化产生了不同基因型的植株C．卡那霉素抗性基因(kanr)中有该过程所利用的限制性核酸内切酶的识别位点D．抗虫棉有性生殖后代能保持抗虫性状的稳定遗传解析：质粒与目的基因结合时需要用同一种限制性核酸内切酶切割，用DNA连接酶连接；愈伤组织由相同细胞分裂形成，分化后产生相同基因型的植株；卡那霉素抗性基因作为标记基因不能有限制性核酸内切酶的切割位点；抗虫棉有性生殖后代可能会发生性状分离，抗虫性状不一定能稳定遗传。A8.一对等位基因经限制酶切割后形成的DNA片段长度存在差异，用凝胶电泳的方法分离酶切后的DNA片段，并与DNA探针杂交后可显示出不同的带谱（如图一所示）。可将这些DNA片段定位在基因组的某一位置上。现有一对夫妇生了四个孩子，其中1号性状表现特殊（如图二所示）。以下推论正确的是：A.1号为纯合子，基因在性染色体上B.2号为杂合子，基因在性染色体上C.3号为纯合子，基因在常染色体上D.4号为纯合子或杂合子，基因在常染色体上纯合子纯合子杂合子图一1234图二C一般女性一般男性特殊女性基因工程的应用抗病

抗逆

生长速度品质药物器官移植

将

基因与

等调控组件重组在一起，通过

等方法，导入哺乳动物的

中，将其送入母体，使其发育成转基因动物。转基因动物进入泌乳期后，可以通过分泌乳汁生产所需要的药品，称为乳腺生物反应器或乳房生物反应器。乳腺生物反应器乳腺生物反应器的优点：①产量高；②质量好；③成本低；④易提取。

药物蛋白乳腺蛋白基因的启动子显微注射受精卵1、基因治疗概念：基因治疗把正常基因导入病人体内，使该基因的表达产物发挥功能，从而达到治疗疾病的目的，是治疗遗传病的最有效的手段。（把特定的外源基因导入有基因缺陷的细胞中，从而达到治疗疾病的目的）2、实例：将腺苷酸脱氨酶基因转入取自患者的淋巴细胞中，再将这种淋巴细胞转入患者体内。对严重复合型免疫缺陷症的治疗3、原理病人细胞中既含有缺陷基因，又含有通过基因工程导入的正常基因，在病人体内两种基因都存在且都能表达，正常基因的表达产物掩盖了缺陷基因的表达产物，从而治愈了有基因缺陷的疾病。4、基因治疗的类型体外基因治疗：先从病人体内获得某种细胞，进行培养，然后在体外完成基因转移，再筛选成功转移的细胞扩增培养，最后重新输入患者体内。体内基因治疗：直接向人体组织细胞中转移的治病方法。（如将治疗囊性纤维病的正常基因转入患者肺组织）5、基因治疗的发展现状：处于初期的临床试验阶段基因诊断1、概念用放射性同位素或荧光分子等标记的DNA分子做探针，利用DNA分子杂交原理，鉴定被测标本上的遗传信息，达到检测疾病的目的。1.切取某动物合成生长激素的基因，用某种方法将此基因转移到鲇鱼的受精卵中，从而鲇鱼比同类个体大3～4倍，此项研究遵循的原理是（）A．基因突变，DNA→RNA→蛋白质B．基因工程，DNA→tRNA→蛋白质C．细胞工程，DNA→RNA→蛋白质D．基因重组，DNA→RNA→蛋白质D

2.下列关于基因工程应用的叙述，正确的是（）A．基因治疗就是把缺陷基因诱变成正常基因B．基因诊断的基本原理是DNA分子杂交C．一种基因探针能检测水体中的各种病毒D．原核基因不能用来进行真核生物的遗传改良B蛋白质工程的崛起

一、蛋白质工程的崛起的缘由基因工程产物基因工程在原则上只能生产自然界已存在的蛋白质。这