第八章微生物代谢组学

第八章微生物代谢组学（Microbialmetabolomics）及代谢产物库（MicrobialMetabolitesLibraries）微生物代谢组学是指全面分析(定性和定量)细胞生长或生产周期某一时刻细胞内和细胞周围的所有低分子量代谢物.从生物量培养、灭活和代谢产物的提取到代谢物的定量分析分析范围(nmol-mmol)、化学功能各异的代谢产物目的：揭示正常状态及内外环境变化后代谢过程动态反应规律。一、微生物代谢组学代谢组学(metabolomics)是一种研究生物样品中所有小分子代谢物的技术，是继基因组学、转录组学和蛋白质组学之后出现的一门新学科，已成为系统生物学的重要组成部分。代谢组学是通过考察生物体系受刺激或扰动后(如将某个特定的基因变异或环境变化后)所有小分子代谢产物随时空的变化情况，来研究生物体系的代谢途径的一种技术。代谢组学与其它组学的研究对象的最大区别是其研究代谢组的变化。代谢组的变化是生物对遗传变异、疾病以及环境影响的最终应答。代谢组学的突破在于将传统的代谢途径扩展为代谢网络的研究代谢组学所解决的问题非常复杂：如大肠杆菌的全部代谢产物仅占细胞干重的3%～5%,但化学结构和生物活性的多样性难以估计,是一般合成化合物和组合化学产物所不能比拟的,其范围从小的无机离子到疏水性的脂质及复杂的天然产物,浓度范围跨越9个数量级(从pmol

到mmol)。研究内容包括代谢组学：定性和定量特定条件下生物样品内的全部代谢物。然而,由于代谢物组成复杂、含量不一，样品制备过程的偏差,以及检测设备的量程及通量等问题，目前还难以分析全部的代谢物。目标代谢物分析(metabolitetargetanalysis)

：利用特定方法研究难分析化合物(difficultanalytes)如植物激素等。代谢谱分析(metaboliteprofiling)：检测胞外代谢物代谢指纹分析(metabolicfingerprinting)：对粗提代谢物进行高通量的定性分析，通过谱型比较将样品进行快速分类，寻找差异峰，揭示生物对疾病或有毒物应答的生物标记物代谢产物组学(metabonomics)：多指以核磁共振(NMR)手段研究与疾病相关的代谢物，是综合地研究某一时间点对细胞内全部代谢物的影响代谢组学的特点：1、能够对各类代谢产物实现高通量分析测定2、上游基因、蛋白层面变化能在下游代谢产物中放大3、代谢产物整体变化可直接反应机体状态（一）、微生物代谢组学是系统生物学的重要组成部分共同译解其全部基因功能，它综合了分析化学、基因组学以及信息科学的最新进展,在功能基因组研究中居于核心地位Catalyst,metabolome,proteome,phenotype

Thesystemsbiologyframeworkrepresentation随着基因组学研究的深入,功能基因组开始研究基因组、转录组以及蛋白组的数据与表型之间的关系；而细胞内的全部代谢物最接近于表型,从而产生了研究全部代谢物的要求,代谢组(metabolome)的概念由此诞生Metabolicfootprintingcanresultinimportantbiologicalinformation.Differentyeaststrains(a),bydirectinjectionmassspectrometry(DIMS)(b).furtheranalysedbystatisticaltechniques(c),suchasprincipalcomponentsanalysis(PCA),Discriminantanalysis(d)canthenbeusedtocreateanewvariablebycombiningtheoriginalvariablesinsuchawaythatthedifferencesbetweenthepredefinedgroupsaremaximized,resultingininformationonbiologicalfunctions(e).Classificationofdifferentapproachesofmetabolomicsinvestigationswithrespecttocomprehensionandmetabolitelocalisation（二）、分析过程代谢组学研究的技术平台一般流程包括样品制备、代谢产物的检测和分析鉴定、数据分析与模型建立Quenched(急剧冷却)Workflowforquantitativemicrobialmetabolomeanalysisusingmultiplecomprehensiveanalyticalmethods.IS,internalstandard.代谢组学研究流程Warehousing(入库)Fig.1Flowdiagramofsamplingprocedure,metabolicactivityquenching,intracellularmetaboliteextraction(endometabolome),extracellularmetabolite(exometabolome)andanalysisproceduresforquantificationsimultaneous(同时发生的)１、样品制备微生物代谢物样品的制备一般分为微生物培养、淬灭和代谢产物的提取生物量培养技术1)特殊生长速率(μ)2)通过固定特殊生产速率，可固定其他通量,如特殊底物摄取速率(Qs)、O2

摄取速率(OUR)和CO2转化速率(CER)。3)可以加上一个特殊的生长限制介质组分，如碳源。4)容易完成和再现生理参考稳态条件微生物代谢组学研究要求微生物的生长条件是可以控制和重复的。在一个生物反应器中，需要严格控制温度、pH、培养基组成、溶解氧和二氧化碳等，以明确界定生长条件，建立标准的和可重复的参考培养条件灭活及菌体的获得灭活的目的是让细胞内的酶失活,导致代谢物的轮廓“冻结”。传统的代谢产物活性快速灭活方式：样品温度的瞬间改变至低温(-40℃)或高温(>80℃)，或应用极端pH的高碱(氢氧化钠或氢氧化钾)或高酸(高氯酸、盐酸或三氯乙酸)完成的。液氮灭活法：把样品直接投入液氮，冰上解冻后收集菌体细胞内代谢产物的提取提取步骤应遵循的原则是:以适当的回收率从细胞中提取最大量的代谢产物。2)代谢产物不应该遭遇任何物理和化学修饰,降解应控制在最小范围内;3)防止代谢产物丢失和非破坏性。２、代谢产物的分析鉴定传统的酶法定量胞内外代谢物只能分析一个样品中的一个或几个代谢物，且需要的样品体积大。而胞内代谢物浓度一般很低，在淬灭或提取过程中又会被稀释，所得的样品体积一般很少，这些都将严重影响酶法定量的可靠性代谢组学定量胞内外代谢物的分析方法要求具有高灵敏度、高通量和无偏向性的特点。(GC-MS)、液相色谱与质谱联用(LC-MS)、毛细管电泳与质谱联用（CE-MS）以及核磁共振(NMR)目前，应用最广泛、最有效的技术是气相色谱2质谱(GC-2MS)和液相色谱2质谱(LC-2MS)。这两种技术可以检测包括糖、糖醇、有机酸、氨基酸、脂肪酸以及大量次级代谢物在内的数百种化合物。GC-2MS具有较高的分辨率和灵敏度LC-2MS具有强大的分离能力，广泛应用于难挥发性物质的分析Full-scanGC-MSchromatogramofamicrobialsamplederivatizedbyoximationandsubsequentsylilation(unpublisheddata)３、数据分析与模型建立从检测到的代谢产物信息中进行两类(如基因突变前后的响应)或多类(如不同表型间代谢产物)的判别分类以及生物标记物的发现色谱、质谱、核磁共振技术及它们的联用技术是代谢物组学研究中最重要的研究手段，而且这些技术还在向高通量，高灵敏度，高解析度和高可靠性得到大量的多维的数据，这对它们的分析产生很大的困难，因此需用各种模式识别技术来进行简化数据复杂程度并从中找出显著性因素，进而通过进行代谢网络建模或重建及分析来解释得到的结果，以指导菌种改进、植物育种、药物开发及基因治疗等代谢组学原始数据的解析可分为如下3个基本步骤:(1)提取出色谱分离(如GC2MS)后未能有效分开的代谢物峰并得出其相应浓度(2)根据其保留时间及质谱图等信息鉴别有效峰所代表的化合物(3)根据代谢数据建立代谢网络模型。已经开发出界面友好的公开软件，如Sumner等开发的MSFACTS(metabolomicsspectralformatting,alignmentandconversiontools)，可以输入如GC2MS原始数据，输出代谢物清单。解决该问题应该更多地依赖于一些新的算法进行自动推算，而不是寻找相应的标准参照物。代谢组学应用领域(1)植物功能基因组研究,主要以拟南芥为研究模型,也包括一些转基因作物的研究.(2)疾病诊断,根据代谢物指纹图谱诊断肿瘤、糖尿病等疾病(3)制药业,主要通过高通量比对预测药物的毒性和有效性,通过全面分析来发现新的生物指示剂(4)微生物领域(5)毒理学研究,包括利用代谢组学平台研究环境毒理及药物毒理(6)食品及营养学,即研究食品中进入体内的营养成分及其与体内代谢物的相互作用代谢组学可研究尿液、血样、植物提取物及微生物样品，NovakBJ等采集I型糖尿病患者呼出气体进行分析，找到了与I型糖尿有很强特异性相关联的生物标志物硝酸甲酯可用于诊断在疾病分型、药物毒性评价、植物基因功能和表型的研究等取得了进展（三）代谢组学在微生物领域的应用１、微生物分类,突变体筛选以及功能基因研究某些菌株按照基因型与表型两类方法分类会得出不同的结果代谢谱分析方法(metabolicprofiling)异军突起,逐渐成为一种快速、高通量,全面的表型分类方法。采用代谢组分类时,可以通过检测胞外代谢物来加以鉴别。常用的胞外代谢物检测方法为样品衍生化后进行GC-2MS分析、薄层层析或HPLC-2MS分析,最后通过特征峰比对进行分类Bundy等采用NMR分析代谢谱成功地区分开临床病理来源以及实验室来源的不同杆菌(bacilluscereus)２、发酵工艺的监控和优化发酵工艺的监控和优化需要检测大量的参数,利用代谢组学研究工具可以减少实验数量,提高检测通量,并有助于揭示发酵过程的生化网络机制,从而有利于理性优化工艺过程在接触葡萄糖底物后的15～25s范围内,大肠杆菌体内发生的葡萄糖代谢物变化与经典生化途径相符,但随后的过程则与经典途径不符,推测可能存在新的未知调控步骤。３、环境微生物研究微生物降解是环境中去除污染物的主要途径深入了解污染物在微生物内的代谢途径,将有助于人们优化生物降解的条件,从而实现快速的生物修复根际(rhizosphere)空间在植物-微生物相互作用中发挥着重要的作用。Narasimhan等利用根际代谢物组(rhizosphere

metabolomics)方法,阐释了植物分泌物对根际微生物降解多氯代酚(PCB)的作用机制。二、微生物代谢产物库（MicrobialMetabolitesLibraries）微生物是活性天然产物的重要来源,微生物代谢物具有极大的化学结构多样性和复杂性建立微生物代谢物库对药物高通量筛选、发现先导化合物有极其重要意义代谢产物库是进行高通量筛选的先决条件,包括数据库管理系统、主要从微生物样品中提取的活性部位或单体化合物和少量合成化合物1、预分离代谢物库将800种菌株的培养液过滤,得到培养液的滤液和菌丝体两部分滤液部分经不同吸附性色谱柱处理得到800种强极性组分和6400种中等极性的组分菌丝体部分用有机溶剂提取得到800种菌丝体提取物采用半制备高效液相对以上3部分组分进一步细分得到至少80000种纯度大于85%的天然化合物最后,对化合物库中活性成分进行液相质谱、核磁共振分析,排除重复性物质。采用该方法从发现苗头化合物到完成结构鉴定所需时间短菌种来源多样性的地域如深地层、深海及极端温度、盐度及pH值的地点往往可分离得到新的微生物,为发现新的化合物提供了可能Mincer

报道由一种新型放线菌属Salinospora

可分离得到强抗癌活性物质SalinosporamideA培养基成分微生物产生次级代谢物的种类和产量受到培养基成分和生长条件影响。如:改变培养基中的氮源可使真菌抑制剂Cancidas

的天然前体Pneumocandins

产量提高10～20倍。因此改变微生物生长条件来提高菌种代谢产率成为许多制药公司经常使用的策略代谢物分离和检测方法2、纯天然产物库AnalyticonDiscovery和AventisPharmaAG两公司合作在18个月内建成一个纯度大于80%、包含2242种微生物来源化合物及1758种植物来源化合物的无重复结构纯天然产物库3、合成及半合成天然产物库随着高通量有机合成在药物发现过程中的应用,多种设计方法被用于化合物库的构建,其中包括:通过全合成获得天然产物衍生物库、天然产物类似物库,及由天然产物而来的化合物库等思考题或讨论：1、微生物代谢产物组学与基因组学、转录组和蛋白质组学之间的联系与区别？2、微生物代谢组学的研究方法有哪些？3、如何建立微生物代谢产物库？4、建立代谢产物库有何意义？参考文献ValeriaMapelli1,2,LisbethOl