第4章酶的分离纯化

第四章酶的分离与纯化酶的分离纯化策略酶液的制备与初分离酶的分离纯化方法酶纯度的检验酶的提取和分离纯化是指把酶从组织中、细胞内或细胞外液中提取出来并使之达到与使用目的相适应的纯度。酶的分离提纯包括三个基本环节：

一是抽提，即把酶从材料转入溶剂中制成酶溶液；二是纯化，即把杂质从酶溶液中除掉或从酶溶液中把酶分离出来；三是制剂，即将酶制成各种剂型。空间结构的稳定性有活性的酶的空间稳定性有限，不同的酶可能有不同的稳定性保持稳定性的环境因素离子强度适当最适pH低温加入稳定性：甘油、糖类、聚乙二醇等第一节酶的分离纯化策略

一、酶分离纯化基本原则防止变性失活低温进行防止局部的过酸过碱避免剧烈搅拌和泡沫形成重金属离子能引起酶失活，有机溶剂会使酶失活，微生物污染以及蛋白酶的存在会使酶分解破坏，其他因素：水质、辅因子等样品性质对纯化策略的影响温度稳定性迅速，且在低温下操作pH值稳定性对提取及纯化所用缓冲液的选择，对离子交换、亲和色谱或反相色谱条件的选择溶解稳定性对反相色谱条件的选择离子强度对沉淀及疏水亲和色谱的条件的选择蛋白酶敏感性需去除蛋白酶或添加抑制剂金属离子敏感性需在缓冲液中添加乙二胺四乙醇（EDTA）或乙二醇双（2-氨基乙基）醚-N，N，N`，N`-四乙酸（EGTA）氧化敏感性需添加还原剂分子量对凝胶过滤介质的选择表4-2酶蛋白性质及其对纯化策略的影响二、酶的分离纯化策略1、目的明确用途：医疗用途、活体研究等极高纯度＞99%X射线结晶、物理化学性质研究等高纯度95-99%N端测序、生产抗原等一般纯度＜95%2、建立一个可靠、快速的分析方法

目标酶蛋白，蛋白质纯度的检测，总蛋白量的检测，对必须清除的杂质的分析纯化方法的选择--解决纯化倍数和回收率的矛盾建立以下分析通道：快速、可靠的分析目标酶蛋白的方法（酶活力测定方法）蛋白质纯度检测方法总蛋白的检测方法对必须清除的杂质分析方法此外，还需尽量做到纯化过程中不宜重复相同的步骤和条件减少添加剂的使用尽早去除有破坏型的杂质尽早采用高效分离方法，将最昂贵、最费时的分离方法防在最后阶段。3、纯化方法的选择评定好坏的标准：比活力提高倍数总活力的回收率重现性表4-3常用的提纯方法性质方法溶解度电荷等电点分于大小生物亲和性等电点沉淀、盐析、有机溶剂沉淀、萃取离子交换层析、电泳层析聚焦、等电聚焦离心分离、凝胶过滤、透析、超滤亲和层析、免疫吸附层析、亲和萃取比活力提高倍数是纯化后样品的酶比活力与纯化前比活力的比值，较大的倍数表示比活力明显提高，说明操作的有效性。总活力的回收率是指纯化后样品的总活力占前样品总酶活的百分比。这一比值越高说明该操作步骤对酶活的保存率越高。较好的重现性是所有方法可行性的必要条件。酶的分离纯化一般程序可以分为预处理：包括材料的选择、发酵液的预处理和细胞的破碎等。粗分级分离：等电点沉淀、盐析、有机溶剂沉淀、萃取和离心分离。细分级分离：通常用色谱分离成品制作：透析、超滤、结晶和冷冻干燥等。第二节酶液的制备和初分离一、材料的预处理动物材料：除去与实验无关甚至有妨碍的结缔组织，脂肪组织和血污等。植物种子需要除壳微生物材料需将菌体和发酵液成分分开沉淀法酶泥胞外酶用盐析或有机溶剂沉淀胞外酶：释放到细胞外的酶胞内酶：游离在细胞内的酶和牢固与膜或细胞颗粒结合在一起的酶细胞壁的主要组分：细菌：肽聚糖、N-乙酰葡糖胺、N-乙酰胞壁酸真菌和酵母：葡聚糖、甘露聚糖藻类：纤丝状糖类动物细胞无细胞壁，易破碎。细胞破碎的方法机械法物理法：渗透压突变、超声波、冻融、冷冻干燥再抽提化学法：有机溶剂处理、表面活性剂处理生物法（酶法）：糖苷酶、溶菌酶葡聚糖酶、纤维素酶、甘露聚糖酶等表4-4常见的破碎细胞方法分类原理举例机械法珠磨法固体剪切作用植物组织和细菌高压匀浆法液体剪切作用细胞悬浮液超声波液体剪切作用和空穴作用细胞悬浮液X－press法固体剪切作用细胞悬浮液非机械法酶溶法酶对细胞壁的分解作用溶菌酶处理细菌化学渗透法改变细胞膜的渗透性酵母菌的甲苯抽提渗透压法渗透压剧烈变化红细胞冻结融化法反复冻结－融化革兰氏阴性细菌干燥法改变细胞膜的渗透性酵母菌的空气干燥胞内酶？细胞破碎取酶（1）机械破碎法液体剪切：搅拌、匀浆固体剪切：研磨、珠磨、捣碎14573682图4-1珠磨机的结构简图1－细胞悬浮液；2－微珠；3－破碎室；4－冷却剂；5－细胞匀浆器；6－液珠分离器；7－搅拌桨；8－冷却剂

1234

5

6图4-2高压匀浆器结构简图1－细胞悬浮液；2－阀座；3－碰撞环；4－阀；5－阀杆；6细胞匀浆液JY92-IID超声波细胞粉碎机细胞破碎珠高压细胞破碎机DY89-I型电动玻璃匀浆机（2）化学渗透：将细胞壁溶解作用和渗透压作用相结合，使细胞膜破裂而释放出胞内物质。有机溶剂处理：溶解膜脂、干燥、抽提。表面活性剂处理：改变膜的通透性，使之溶解，再抽提蛋白。SDS、Triton（3）酶溶解：利用溶解细胞壁的酶处理菌体，使细胞壁受到部分或完全破坏后，再利用渗透压冲击而破坏细胞膜。（4）冻结-溶冻法将细胞急剧冻结后在室温缓慢融化，反复操作多次达到破坏细胞壁和细胞膜的作用，适用于较脆弱的菌体。三、抽提酶的提取是指在一定的条件下，用适当的溶剂或溶液处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂或溶液中的过程，也称为酶的抽提。酶提取时首先应根据酶的结构和溶解性质，选择适当的溶剂。一般说来，极性物质易溶于极性溶剂中，非极性物质易溶于非极性的有机溶剂中，酸性物质易溶于碱性溶剂中，碱性物质易溶于酸性溶剂中。酶都能溶解于水，通常可用水或稀酸、稀碱、稀盐溶液等进行提取，有些酶与脂质结合或含有较多的非极性基团，则可用有机溶剂提取。抽提缓冲液可能组成成分pH调节剂离子强度调节剂：盐类构象稳定性：甘油抗氧剂：DTT、巯基乙醇等重金属络合剂：EDTA、柠檬酸蛋白酶抑制剂：PMSF、DFP等增溶剂：TritonX-100等影响酶提取的主要因素（1）pH（2）温度（3）抽提液的用量离心离心转数：每分钟转数（rpm）离心分离强度：g值换算：g=（rpm×2π/60)2/9.8r:粒子距离轴中心的距离低速：≦4000rpm高速：4000-20000rpm超速:＞20000rpm实验室的离心机常温和冷冻超速离心机为冷冻使用冷冻离心机需先降温，预冷离心机头使用超速离心机要抽真空离心的形式角式及外摆式：外摆式一般为低速，角式从低速到超速。

角式离心头要配套，低温使用预冷，操作注意稳、盖、胶圈、旋紧。离心机：落地式、台式小台式离心机超速离心机离心机管

材质：玻璃、塑料

强度和离心机转速配备

大小：和转子相配备高速和超速管要加盖离心机操作平衡、定温、定速、定时、定刹车四、浓缩（1）蒸发工业上应用较多的是薄膜蒸发浓缩，即将待浓缩的酶在高真空度的条件下变成极薄的液膜，并使之与大面积热空气接触，让其中的水分瞬时蒸发达到浓缩的目的。（2）超滤在加压情况下，将待浓缩溶液通过一层只允许水分子和小分子选择性透过的微孔超滤膜，而将酶等大分子滞留，从而达到浓缩的目的。（3）凝胶过滤：利用葡聚糖凝胶G-25或G-50等能吸水膨胀，而酶等大分子排阻于胶外的原理进行的一种浓缩。（4）沉淀法利用盐析法或有机溶剂沉淀法将蛋白质进行沉淀，再将沉淀溶解在小体积的样品溶液中。（5）渗透浓缩法将蛋白质溶液放入透析袋中，然后在封闭容器中缓慢减压，水及无机盐流向膜外。第三节酶的分离纯化方法（1）根据溶解度大小分离的方法、如盐析法、有机溶剂沉淀法、共沉淀法、选择性沉淀法、等电点沉淀法等。（2）根据分子大小的差别。如离心分离法、筛膜分离法、凝胶过滤法等。（3）根据电学、解离性质差别，有吸附法、离子交换色谱法、电泳法以及聚焦色谱法。（4）基于酶和底物、辅助因子以及抑制剂具有专一的亲和作用特性而建立的各种亲和分离法。（5）利用稳定性差异而建立的选择性热变性、酸碱变性和表面变性法等。一、根据溶解度不同而建立的纯化方法酶的性质：水溶性基于物理、化学规律，酶分子的疏水基团一般位于分子内部，带电和强极性基团位于分子表面，形成极性表面。进而水分子被结合在极性表面形成水化层，使酶分子具有一个很亲水的表面而易溶于水。调节酶溶解性的方法

1、盐析法在低浓度盐溶液中，其溶解度随盐离子强度升高而加大，表现出盐溶现象。原因：盐离子与蛋白质分子中的极性基团或离子基团作用，降低蛋白质分子的活度系数而使其溶解度增加。当盐浓度继续升高达到某一上限值时，其溶解度又会以不同速度下降。分别沉淀析出，这种现象称为盐析。S：为溶解度

S0：离子强度为0时溶解度

Ks：盐析常数

I：离子强度不同蛋白质分子量、表面电荷不同，在不同盐浓度下沉淀。浓盐中蛋白质的溶解度遵循Cohn方程：盐析影响因素pH值：等电点处最易沉淀温度：浓盐溶液中，温度升高溶解度下降盐种类：高价盐效果好，常用硫酸铵，一般用氨水调pH。浓度经常用饱和度（换算表）蛋白质浓度：过稀回收困难，过浓易沉淀。饱和度：溶液中饱和硫酸铵的体积与溶液总体积之比。当蛋白质溶液体积不大，要达到的盐浓度不高，可加入饱和硫酸铵溶液，100m1硫酸铵溶液，由饱和度S1变为S2，应向其中加入的饱和硫酸铵溶液的ml数(V)为：

V＝Vo(S2—S1)/(1—S2)当蛋白质原有体积较大，要达到的盐浓度又较高，此时加入固体硫酸铵为宜。在0℃、25℃下，硫酸铵浓度由饱和度Sl增至S2．应向1L溶液中添加的固体硫酸铵的克数，可以直接查表:盐析法注意方面盐析法适宜的pH是接近分离酶的PI值.可控制pH＜5或pH＞6，使目的酶与杂蛋白带相同电荷而减少与它们的结合从酶的稳定性和溶解度来看，盐析温度应控制在0℃左右为宜。蛋白质浓度应在1mg/ml以上。经盐折后,沉淀通过离心或压滤与母液分开，收集后的沉淀再溶于一定的缓冲液心除去不溶物,酶溶液又得到一次纯化。盐析操作低饱和度：饱和溶液滴加法。易于迅速混合均匀，一般终饱和度不超过40%。加量估算：假定混合总体积不变。高饱和度：加固体盐添加法，不会大量增加溶液体积。温和搅拌添加，加毕后继续搅拌10分钟以上，以充分沉淀。沉淀后要高速离心分离，还需除盐。2、有机溶剂沉淀法（1）原理：利用酶等蛋白质在有机溶剂中的溶解度不同而使之分离的方法。与水相容的有机溶剂（甲醇、乙醇和丙酮等）能使蛋白质在水中的溶解度显著降低。有机溶解的主要作用是降低溶液的介电常数，因为分子中的静电引力和溶剂的介电常数成反比，加入有机溶剂，蛋白质分子间的引力增加，互相吸引凝聚，使其溶解度降低。另一作用引起蛋白质脱水而沉淀。注意事项一般在进行有机溶剂法时，溶液pH尽可能靠近待纯化酶的PI值。加入适当的中性盐，如5％一10％硫酸铵往往有助于提高分离效率。但其浓度不得越过0.05mol/L。此法分辨率较高、溶剂易除去，但易引起酶的变性失活。3、等电点沉淀法利用两性电解质在等电点时溶解度最低，以及不同的两性电解质具有不同的等电点这一特性，通过调节溶液的pH值，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离的方法称为等电点沉淀。4、有机聚合物沉淀法在酶液中加入某些高分子物质，使其与酶形成聚合物而沉淀下来，从而使酶与杂质分离的方法称为有机物聚合法。SDSPEG丙烯酰胺5、萃取分离萃取分离：利用溶质在互不相溶的两相间分配系数不同而使溶质得到纯化或浓缩的方法。（1）双水相萃取将两种不同水溶性聚合物的水溶液混合，当聚合物达到一定浓度时，体系自然分成互不相溶的两相，从而构成双水相体系。原理：利用酶和杂质蛋白等在不混溶的两个水相系统中分配系数不同而达到分离的目的的方法。双水相的形成主要是由于高聚物之间的不相溶性，即高聚物分子的空间阻碍作用，互相无法渗透，形成不了均一相，从而具有分离倾向，在一定条件下分成两相。聚合物/聚合物：聚乙二醇/葡聚糖、聚丙二醇/聚乙二醇聚合物/盐：聚乙二醇/(硫酸盐或磷酸盐）双水相适合进行的酶萃取两相中含有70%以上的水设备简单操作方便、快捷

细胞匀浆加入PEG、盐∕葡聚糖第一步双水相萃取静止分层细胞碎片上相：蛋白质第二步双水相萃取静止分层下相：杂蛋白、核酸、多糖上相：蛋白质加入盐第三步双水相萃取静止分层下相：目的酶、杂蛋白、色素加入盐

图4-4三步双水相萃取法分离酶的流程（2）超临界流体萃取

超临界流体萃取是将超临界流体（supercriticalfluid）作为萃取溶剂，利用欲分离物质与杂质在超临界流体中溶解度不同而达到分离的一种萃取技术。超临界流体：物质状态超过气液共存时的最高压力和最高温度下物质特有的点—临界点后的流体。临界点图4-5超临界系统相超临界流体

P∕PaT／℃三相点

液态

气态

固态超临界流体的物理特性和传质通常介于液体和气体之间，超临界流体的黏度大大低于液体的黏度，接近气体的黏度，有利于物质扩散。其扩散系数接近于气体。由于溶质在超临界流体中的溶解度随温度和压力的变化很大，超临界流体对于物质的萃取具有选择性。常用的超临界流体是二氧化碳。（3）反胶团萃取

反胶团（reversedmicelles）：两性表面活性剂在非极性有机溶剂中亲水基团自发地向内聚集而成的微小胶团。表面活性剂的存在是构成反胶团的必要条件阴离子型表面活性剂阳离子型表面活性剂非离子型表面活性剂酶水烃反胶团＋＋＋＋＋＋图4-6反胶团萃取的原理示意图反胶团的形成使有机相内形成了分散的亲水微环境，使生物分子在有机相（萃取相）内存在于反胶团的亲水微环境中，消除了蛋白质难溶于有机相中或在有机相中发生不可逆变性现象。通过控制pH值、离子强度、有机溶剂的种类及表面活性剂的种类和浓度，可以改变蛋白质在两相间的分配系数，不同蛋白质表面电荷与相对尺寸的不同使得它们在两相中的分配系数不同，从而达到分离的目的。二、根据不同分子大小而建立的纯化方法1、凝胶过滤凝胶过滤(GelfitrationChromatography，GFC)也称凝胶色谱，是利用凝胶的网状结构根据分子大小进行分离的一种方法。凝胶性质得水值Wr：胶体内部含水量—1g干凝胶吸水克数排阻限度：不能渗透到凝胶内部的最低分子量。分离范围：上限为排阻限度。颗粒形状：理想形状为球状。颗粒大小：颗粒越小，分辨力越强，流速越低。选择性曲线颗粒大小对分辨率大小流速对分辨率的影响常用凝胶1、交联葡聚糖凝胶SephadexSephadexG-10至200，型号/10=得水值细度um，粗100-300，中50-100

细20-80

超细10-40号越高排阻限度和分离范围越高，溶胀时间越长，最大流体静压力越小，操作压力超限会破坏多孔结构。化学稳定，不溶所有溶液，pH2-12名称基质制造商SephadexG-10～SephadexG-200Sepharose2B、Sepharose4B、Sepharose6BSepharoseCL4B、SepharoseCL6BSephacrylS系列Sephadex系列Sepharose系列Bio-BeadsS～Bio-BeadsX系列Bio-GelP系列Bio-GelA系列TSKgelSW系列TSWgeltoyopearlHW系列TSKgelPW系列TSKgelCW-35Cellulofine交联葡聚糖琼脂糖交联琼脂糖聚丙烯酰胺-葡聚糖高交联琼脂糖-葡聚糖高交联琼脂糖（二次交联）苯乙烯-二乙烯苯聚丙烯酰胺琼脂糖硅胶亲水性聚乙烯醇亲水性聚乙烯纤维素纤维素PharmaciaPharmaciaPharmaciaPharmaciaPharmaciaPharmaciaBio-RadBio-RadBio-RadToyoSodaToyoSodaToyoSodaToyoSodaChisso表4-6常用的商品化凝胶过滤介质凝胶的选择琼脂糖凝胶刚性相对较高，能得到较高的流速，但葡聚糖凝胶的分辨率较高。葡聚糖凝胶的稳定范围最宽，特别是碱稳定性好（2-12），聚丙烯酰胺凝胶酸稳定性好（1-10），琼脂糖凝胶凝胶稳定性范围最小。不必须高流速和强酸的情况下，一般多选用葡聚糖凝胶。用凝胶过滤去除小分子分离酶蛋白和溶液中的小分子，如抑制剂、盐、底物、保护剂等，传统的技术是透析，但透析一般用时较多，不适合快速操作，此时凝胶过滤是最好的选择。加压法：有规格化产品供选用。离心柱法：装小塑料柱—平衡—离心—加样—再离心—收集选胶：排阻限度在酶分子量之下，而在小分子量之上越多越好，大承压。用凝胶过滤测分子量

利用凝胶过滤中按分子量大小出峰位置不同，可以测定蛋白质的分子量。2、膜分离膜分离即过滤分离法，利用微孔超滤膜仅能选择性透过一定大小的分子而达到分离目的的一类方法。膜分离加压膜分离微滤超滤反渗透电场膜分离电渗析离子交换膜电渗析扩散膜分离透析根据膜材料和不同进料液的特性，商品应用的膜产品通常采取如下几种结构形式：管式；中空纤维；卷式；平板式。中空纤维膜超滤膜是由数百至数百万根中空纤维膜固定在圆筒形容器内构成。外压型内压型3、依据电学解离性质不同建立的纯化方法1、离子交换色谱

离子交换色谱是利用离子交换剂上的可解离基团对各种离子的作用力不同而达到分离目的的一种色谱方法。基本原理离子交换树脂共价键有可解离基团，可人为选择性使其带上电荷，带正电荷的为阴离子交换树脂，带负电荷的为阳离子交换树脂。生物大分子表面带有电荷，通过静电作用结合在相应的树脂上，亲和力的大小取决于静电键的数目及排布有关。不同的大分子有不同的亲和力。改变环境的离子强度或pH值使表面电荷发生变化，会改变相应的亲和力，从而改变大分子在树脂上的吸附状态，达到分离的目的。一般由—高分子支持物和—功能基团(又叫离子交换基)两部分组成。离子交换剂根据支持介质的不同有离子交换树脂、离子交换纤维素、离于交换凝胶等。高分子支持物功能基团离子交换剂阳离子交换剂：带负电荷，吸附带阳离子的基团，与阳离子发生交换，其活性基团为酸性。常用羧甲基

磺丙基②阴离子交换剂：带正电荷，与阴离子发生交换，其活性基团为碱性。常用二乙胺基乙基、二乙胺基乙基-2-羧丙基解离基团为强电离基团的称为强离子交换剂。如碘酸基。带有弱解离基团的为弱离子交换剂。如羧甲基。吸附状态紧密吸附：静电荷键多紧密吸附，吸附后解吸几率极低，将被吸附于柱顶不下移。有限吸附：静电荷键不多，吸附与解吸附处于某程度平衡，随溶液在柱中下移，大分子多次吸附与解吸附，形成一定的下移速度，此状态可以达到较高的分辨率。不吸附：静电键少，不能吸附，与溶液同步下移，形成“穿越峰”。离子交换纤维素树脂的前处理酸碱处理：0.5mol/LHCl和NaOH。阳离子交换树脂：酸-碱-酸处理，最后挂上阳离子H+。阴离子交换树脂：碱-酸-碱处理，最后挂上阴离子OH-。处理时间：20-30min。每步处理后用蒸馏水洗掉浮酸（碱），终处理的树脂还要用缓冲液洗至基本平衡的酸碱度和离子强度，以换上缓冲液离子。离子交换葡聚糖以SephadexG-25和G50为骨架，接入离子交换基团，由于胶表面和胶孔内可连接交换基团，吸附容量大，且流速大。DEAE（QAE），SephadexA-25，A-50，CM（SP），SephadexC-25，C-50阳离子交换树脂离子交换葡聚糖需在酸性（阳离子交换树脂）或碱性（阴离子交换树脂）缓冲液中溶胀。柱色谱操作步骤：加样洗涤洗脱：恒定溶液洗脱，逐次洗脱和梯度洗脱。洗脱方法增加缓冲液离子强度：即增大离子在树脂上的竞争，同时减少大分子表面电荷，降低吸附力，从而使大分子从树脂上解吸。（氯化钠）改变pH值：减少蛋白质分子表面基团的解离度，降低吸附力，从而使大分子解吸，但改变过多可能使蛋白质变性。有时两种方法结合使用。洗脱方式梯度洗脱洗脱液中离子强度或pH连续改变，使混合物中各个蛋白质先后进入有限吸附至不吸附状态而被洗脱。注意：总体积要足够大，使各分离峰不要太拥挤，梯度上限要足够高，使各物质都能解吸，梯度斜度适当，如过大各峰不易分开，过小，峰形过宽和拖尾。逐次洗脱（阶段洗脱）用不同离子强度或pH洗脱液按洗脱能力由小到大相继进行洗脱。优点：洗脱峰集中，体积小浓度高，所需洗脱液总量少，时间短，设备和操作简单缺点：如洗脱条件不准确纯度可能不够高；洗脱峰经常拖尾，变一次洗脱液会出现一个峰，有时造成假象。2、电泳带电颗粒在电场的作用下，向着与其电性相反的电极方向移动，这种现象称之为电泳(electrophoresis，简称EP)。1937年由瑞典科学家TiseliusA首先提出来的，并设计出世界上第一台自由电泳仪，建立了“移界电泳”分离模式。首先证明了血清是由白蛋白、α1、α2、β和γ球蛋白组成的，1948年被授予诺贝尔奖。颗粒在电场中的移动速度主要决定于其本身所带的净电荷量，同时受颗粒形状和颗粒大小的影响。此外，还受到电场强度、溶液pH值、离子强度及支持体的特性等外界条件的影响。

（1）聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamidegelelectrophoresisPAGE）以聚丙烯酰胺作为支持载体。聚丙烯酰胺有单体丙烯酰胺和亚甲基双丙烯酰胺聚合而成。（2）等电聚焦电泳等电聚焦电泳（isoelectricfocusing)是利用蛋白质等两性电解质具有等电点，在等电点的pH值下呈电中性，从而不发生泳动的特点而进行的电泳分析。在电泳设备中首先需调配连续的pH梯度，然后使蛋白质在电场作用下泳动到与各自等电点相同的pH值区域而不再继续泳动，从而形成具有不同等电点的蛋白质区带。等电聚焦电泳法测定蛋白质pI（3）连续凝胶电泳连续凝胶电泳实质上是聚丙烯凝胶垂直平板电泳的发展，实现在批次内连续将各个电泳区带分离回收，并可进行多批次分离操作。在电场作用下，电泳形成的区带一次连续走出凝胶并进行洗脱、收集，达到将各组分分离回收的目的。图4-12连续流动电泳原理示意图不同迁移液流样品注入+－（4）连续流动电泳连续流动电泳是在纸电泳的基础上发展起来的。以滤纸为载体，可以减少分离组分在流动的缓冲液中的自由扩散。将滤纸的上端插入电泳液槽中，依靠毛细管虹吸作用和重力作用，电泳液沿着纸面向下均匀流动，在垂直于电泳缓冲液流动方向施加电场，即在滤纸的两个侧边上与电极解触，将欲分离的样品以定点方式流加在滤纸上，加样点的位置需根据各组分的电泳行为确定。在电场作用下，带有不同电荷的组分随着电泳缓冲液向前流动的同时而向不同电极方向迁移。（5）无载体连续流动电泳与连续流动载体类似，只是不使用载体，而是使用两张塑料板，在她们之间形成0.5～0.8mm的间隙作为电泳槽，使电泳缓冲液从下到上平行流过电泳槽，依靠表面张力减少液体内部的流动性，待分离样品从下端某一点连续加入，在垂直于电泳缓冲液流动方向上的电场作用下，带有不同电荷的各个组分分别向不同的电极方向迁移，在电泳槽的末端，将流出的电泳缓冲液分割，再分别检测、收集，即可获得分离的各个组分。多孔膜连续自由流动电泳利用多孔膜将电泳槽分成多个小池，在电场作用下，电泳分离的物质可透过膜在小池间迁移，而多孔膜可起到稳定液流、防止扩散的作用，在各个小池流动的电泳缓冲液不仅可起到带走电泳产生的热量的作用，同时也可以收集电泳产生的不同区带，从而达到分离的目的。图4-13多孔膜自由流动电泳示意图3、聚焦色谱原理：当用特种的缓冲液滴定和淋洗填装在色谱柱中的特种多缓冲液交换剂时，随着这种缓冲液的扩展，会在色谱柱中自上而下地建立起连续的pH梯度，将待纯化样品加入色谱柱，其中的蛋白质组分将随着多缓冲液的扩展按各自的等电点聚焦与相应的pH值区段并随扩展过程中pH梯度的逐渐下降，最后分别从色谱柱先后流出，从而达到分离纯化的目的。四、利用亲和作用进行纯化的方法生物物质，特别是酶和抗体等蛋白质，具有识别特点物质并与该物质的分子相结合的能力，这种识别并结合的能力具有专一性、排他性，即生物分子能够区分结构和性质非常接近的其他分子，选择性地与其中某一种分子相结合，这种特异性地相互结合作用称为生物亲和作用（bioaffinity）。利用生物分子间的这种特异性结合作用而进行的分离纯化技术称为亲和纯化技术。1、亲和色谱亲和色谱是利用生物分子与配基之间所具有的专一而又可逆的亲和力，而使生物分子分离纯化的技术。酶与底物,酶与竞争性抑制剂,酶与辅助因子,抗原与抗体，酶RNA与互补的RNA分子或片段,RNA与互补的DNA分子或片段等之间，都是具有专一而又可逆亲和力的生物分子对。故此,亲和色谱在酶的分离纯化中有重要应用。亲和色谱(1)亲和色谱法的固定相为一固相担体，上有专一性亲和基团(A)，流动相为溶离缓冲液。(2)当样本通过管柱时，与亲和基团有专一性的分子(B)结合到固定相上，非专一性分子(X)则随流动相洗出管柱。(3)留在定相上的分子(B)，可用酸或碱溶离，或用专一性游离分子溶离。

亲和树脂的制备1.载体载体是亲和交换树脂的骨架，理想载体：均一、结实多孔的网状结构，有较大的表面和良好的流动性。亲水的多孔结构，无非特异性吸附。有可活化基团，以偶联配基化学稳定：温度、pH、溶剂、变性剂常用亲和交换载体最常用的为琼脂糖Sepharose1B到10B，为含琼脂糖1%-10%，号越大分离范围越小，1B为1000000-15000000,10B为10000-500000。2、配基条件：能与载体专一性共价结合，又不产生新的产物：如竞争性抑制剂，底物，抗体、辅酶等。3、手臂酶和配基需要足够的空间，为克服空间障碍，引入“手臂”。4、载体的活化-偶联用溴化氢活化，再偶联配基。需要手臂活化时先接手臂再活化手臂，最后加配基实现偶联。层析操作分离前：1）树脂的预处理：凝胶溶胀、按种类、型号选择合适条件：pH、温度、时间、离子强度等。2）装柱：均匀、密度合适、密封。常压和逐步加压的方法。3）平衡：一般用样品缓冲液，平衡至pH、离子强度稳定。分离中上样：保证pH、离子强度不超标的情况下体积尽可能的小。注意不要超过树脂的吸附容量。洗涤：一般用一个空柱体积的样品缓冲液洗涤掉不吸附的杂蛋白。洗脱：梯度洗脱和阶段洗脱。分步收集和手工收集，监测和检测。注意流速控制，随时观察，保持溶液。分离后：再生、平衡、保存。层析装置梯度混合器蠕动泵层析柱监测仪记录仪收集器记录仪低温层析柱2、亲和膜

亲和膜（affinitymembrane）：利用亲和配给修饰的微滤膜为亲和吸附介质，而进行亲和纯化目标酶，是固定床亲和色谱的变形。五、利用稳定性差别建立的纯化方法1、选择性热变性在严格控制的条件下，将酶溶液迅速升温到某一温度并保温一定时间（通过时间确定）而后迅速冷却，这样，大量不耐热的杂蛋白就将变形析出，通过离心可除去，而酶的总活力损失很少，同时比活力大大上升。为了使选择性热变性法有更大的适用范围，可以在酶溶液进行热处理前，加入该酶的底物、辅酶、竞争性抑制剂、保持巯基的还原剂等。同时控制溶液pH。2、选择性酸碱变性在一定温度下，目标酶表现出较强的耐酸性或耐碱性，而这一条件对大多数蛋白质是不稳定的，那么可以将溶液的pH严格控制在一定范围内并处理一定时间。3、表面变性法利用酶溶液和惰性液体（三氯甲烷）混合振荡，造成选择性表面变性在制备过氧化氢酶、醇脱氢酶和α-淀粉酶等。振荡后混合液分为三层：上层为未变性的蛋白质，中间为乳浊液变性蛋白质，下层为三氯甲烷。提纯程序提纯方法的选择酶的分离提纯一般是多步骤完成的，可用的方法和材料可能有多种，可根据制备的规模、纯度的要求、分离时间、实验室条件等进行选择。

方法衔接上，一般次序为分步沉淀–凝胶吸附–离子交换层析，凝胶过滤—亲和层析。六、酶的结晶与干燥浓缩是从低浓度酶液中除去部分的水或其他溶剂而使之成为高浓度溶液的过程。1、结晶结晶是溶质以晶体形式从溶液中析出的过程。（1）盐析结晶盐析结晶是指在适当的温度和pH值等条件下，于接近饱和的酶液中缓慢加入某种中性盐，使酶的溶解度缓慢降低，达到稍微过饱和状态，析出酶晶体的过程。盐析结晶一般是把饱和盐溶液慢慢滴加到浓酶液中，在稍微呈浑浊时，让其在一定温度下放置一段时间，慢慢析出结晶。在缓慢而又均匀地补加饱和盐溶液，直至结晶完全。（2）有机溶剂结晶法有机溶剂结晶是在接近饱和的酶液中缓慢加入某种有机溶剂，使酶的溶解度降低，而析出酶晶体的过程。过程：首先要将经过纯化的酶溶液浓缩至接近饱和的状态，将酶的pH值调节到酶稳定性好的范围，用冰浴降温至0℃左右。然后一边搅拌一般慢慢加入有机溶剂，当酶液稍微出现浑浊时，将其在冰箱中放置1～2h，离心除去沉淀，再将上清液至于冰箱中，让其慢慢析出结晶。（3）透析平衡结晶法

透析平衡结晶是将酶液装进透析袋，用一定浓度的盐溶液进行透析，使酶液逐步达到过饱和状态而析出结晶的过程。（4）等电点结晶法

等电点结晶法在改变浓酶液的pH值时一定要缓慢而均匀，以免引起局部过酸或过碱。平衡透析等电点结晶：将浓酶液装在透析袋中，用一定pH值的缓冲液进行透析，使酶液的pH值逐渐接近酶的等电点，从而使酶液析出。气相扩散等电点结晶是将酶液装在容器中，与装有挥发性酸（乙酸、干冰等）或挥发性碱（如氨水）的容器一同置于一个较大的密闭容器中，酸或碱先挥发到气相中，再逐渐溶解到酶液中，使酶的pH值慢慢接近酶的等电点而结晶析出。2、干燥

冷冻干燥：首先将酶液在较低温度下（-50～-10℃）冻结成固态，然后在高度真空条件下，将其中固态的水分