酶的分离技术

三、酶的分离技术酶活力，也就是酶活性，是指酶催化一定化学反应的能力。（可以根据需要定义）酶促反应速度，单位是：浓度/单位时间酶促反应速度曲线：酶溶液的制备材料预处理与细胞破碎胞外酶：盐析或者单宁沉淀、有机溶剂沉淀，制成酶泥孢内酶：收集菌体，破碎细胞再提取物理破碎法

通过温度、压力、声波等各种物理因素的作用，使组织细胞破碎的方法统称为物理破碎法。该方法多用于微生物细胞的破碎。

机械破碎法高压法爆破性减压阀快速冻融法机械破碎法

通过机械运动所产生的剪切力，使组织细胞破碎的方法称为机械破碎法。机械捣碎法研磨法匀浆法组织捣碎机珠磨式组织研磨器匀浆法化学破碎法

应用各种化学试剂与细胞膜作用，使细胞膜的结构改变或破坏的方法。

1.有机溶剂处理：利用有机溶剂可使细胞膜的磷质结构破坏，从而改变细胞膜的透过性，再经提取可使膜结合酶或胞内酶等释放出胞外。2.表面活性剂处理：表面活性剂可以和细胞膜中的磷脂及脂蛋白相互作用，使细胞膜结构破坏，增加膜的通透性。

3.溶菌酶处理：用溶菌酶专一性的分解菌体细胞壁的多糖分子，使细胞壁破坏，并在低渗透压的溶液中使细胞破裂。4.自溶法：将细胞在一定的pH和适宜的温度条件下保温一段时间，通过细胞本身存在的酶系将细胞破坏，使胞内物质释放出来的方法。2、酶的抽提

在一定的条件下，用适当的溶剂处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂中的过程，也称作酶的抽提。1.盐溶液提取2.酸溶液提取3.碱溶液提取4.有机溶剂提取主要方法2.1酶提取过程中的注意事项

1.温度：0-4℃最佳2.pH：4-6为最佳3.提取液的体积：1-5倍4.添加保护剂：维生素C，蛋白酶抑制剂等温度和pH对酶的活性的影响2.2.1离心分离离心是指借助离心机旋转所产生的离心力，使不同大小和不同密度的物质分离的技术

2.2酶的提取过程中常用的技术离心机的种类及用途1.常速离心机：<8000r/min,<1x104g2.高速离心机：1x104~2.5x104r/min,1x104~1x105g3.超速离心机：2.5x104~8x104r/min,5x105g超速离心是通过改变某些条件，使溶液中某种溶质的溶解度降低，从而从溶液中沉淀出来，达到与其他溶质分离的目的。

2.2.2沉淀分离等电点沉淀（等电点时静电荷为零，相邻蛋白质分子间没有静电斥力而趋于聚集沉淀）盐析与盐溶（中性盐可以增加蛋白质的溶解度，称为盐溶；盐析作用主要是大量中性盐争夺蛋白质疏水表面水分子）有机溶剂分级分离（有机溶剂降低蛋白质表面可解离基团的离子化程度，促进蛋白质的聚集和沉淀）利用溶解度差别的纯化分级沉淀（盐或有机溶剂）蛋白质在高浓度中性盐溶液中会沉淀析出，称为盐析盐析原理：高浓度盐离子与蛋白质分子争夺水，破坏蛋白质分子表面的水膜，同时盐离子也会影响蛋白质分子所带电荷，从而引起蛋白质沉淀，但通常不会引起蛋白质的变性。2.2.3层析分离

什么是层析-chromatography利用混合物中个组分的物理化学性质（分子的大小和形状、分子特性、吸附力、分子亲和力和分配系数等）的不同，使各组分在两相中的分布程度不同而达到分离的目的。March21,1903,MeetingoftheWarsawSocietyofNaturalScientists,MikhailSemenovichTswettpresentedalectureentitled"OnaNewCategoryofAdsorptionPhenomenaanditsApplicationinBiochemicalAnalysis".

1.吸附层析

2.凝胶层析

3.离子交换层析

4.亲和层析

常用的层析方式1.凝胶层析又称分子筛层析，凝胶过滤或分子排阻层析，是以各种多孔凝胶为固定相，利用溶液中个组分的相对分子质量不同而进行分离的技术。2.亲和层析是利用生物分子对之间所具有的专一性而又可逆的亲和力使生物分子分离纯化的技术。载体配基：底物、竞争性抑制剂、辅酶酶3.离子交换层析利用离子交换剂上的可解离基团对各种离子的亲和力不同，而使不同物质分离的方法。离子交换层析原理离子交换剂的选择阴离子交换剂阳离子交换剂离子交换剂的处理离子交换剂的操作过程装柱上柱洗脱收集再生层析系统实验室用层析柱工业用层析柱0.5-5cm5-100cm2.2.4萃取分离混合液中各组分在两相中的溶解度不同而使其分离的技术。1.有机溶剂萃取

2.双水相萃取

3.超临界萃取

4.反胶束萃取有机溶剂萃取利用溶质在水和有机溶剂中的溶解度不同而达到分离萃取的目的水相有机相

双水相萃取利用溶质在两个互不相溶的水相中的溶解度不同而达到分离萃取的目的水相水相1.1%右旋糖酐溶液

0.36%甲基纤维素溶液0.39%右旋糖酐溶液

0.65%甲基纤维素溶液

超临界萃取

超临界流萃取，是利用欲分离物质与杂质在超临界流体中的溶解度不同而达到分离的一种萃取技术

知识链接——超临界流体（SupercriticalFluid，SF）是处于临界温度（Tc）和临界压力（Pc）以上，介于气体和液体之间的流体。超临界流体具有气体和液体的双重特性。

SF的密度和液体相近，粘度与气体相近，但扩散系数约比液体大100倍。由于溶解过程包含分子间的相互作用和扩散作用，因而SF对许多物质有很强的溶解能力。这些特性使得超临界流体成为一种好的萃取剂。

带电粒子在电场中向着与其本身所带电荷相反的电极移动的过程称为电泳。

2.2.5电泳分离

蛋白质常用电泳技术聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS）等电聚焦电泳（Isoelectricfocusing-IEF）双向电泳（TwoDimensionalElectrophoresis

）PAGE聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(acrylamide，简称Acr)和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(N,N-methylene-bisacylamide,简称Bis)在加速剂N,N,N,N-四甲基乙二胺(N,N,N,N-tetram-ethylethylenediamine，简称TEMED)和催化剂过硫酸铵(ammoniumpersulfate(NH4)2S2O3，简称AP)或核黄素(ribofavin即vitaminB2,C17H2O6N4)的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamidegelelectrophoresis，简称PAGE)。三种物理效应

样品浓缩效应分子筛效应电荷效应聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）管状电泳图谱平板PAGE图谱PAGE

非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳山梨糖脱氢酶的PAGE活性染色导致：1、由于SDS是阴离子，使多肽表面覆盖的负电荷远远超过蛋白质分子原有的电荷量，消除了原来的电荷差异。2、改变了蛋白质单体分子的构象，不同蛋白质的SDS复合物的短轴长度都相同，长轴长度随其分子量的大小成正比变化SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳电泳法测定未知蛋白的分子量SDS

变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，分为还原型和非还原型，区别在于是否含有还原剂。

SDS分析scFv-507的表达形式

M：低分子量标准1：诱导前的全菌体；2：诱导后的全菌体；

3：菌体超声破碎后上清；4：菌体超声破碎后沉淀。

等电聚焦电泳（Isoelectricfocusing—IEF）等电聚焦电泳蛋白质是带有电荷的两性生物大分子，其正负电荷的数量随所处环境酸碱度的变化而变化。在电场存在下的一定pH溶液中，带正电的蛋白分子将向负极移动而带负电的蛋白分子将向正极移动，在某一pH时，蛋白分子在电场中不再移动，此时的pH值即为该蛋白质的等电点。等电聚焦(IEF）电泳就是在凝胶中加入两性电解质从而构成从正极到负极pH逐渐增加的pH梯度，处在其中的蛋白分子在电场的作用下运动，最后各自停留在其等电点的位置上，测出蛋白分子聚焦位置的pH值，便可以得到它的等电点。等电聚焦电泳蛋白质在具有pH梯度的介质中电泳等电聚焦电泳双向电泳第一向在高压电场下对蛋白质进行等电聚焦(IEF)在第一向垂直方向上进行第二向第二向SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS)。

特点：可分离10～100kD分子量的蛋白质高灵敏度和高分辨率便于计算机进行图像分析处理与质谱分析匹配等电聚焦(IEF)SDS双向电泳技术是蛋白质组学研究中蛋白质多肽链分离纯化和鉴定的主要实验技术之一。TwoDimensionalElectrophoresisofE.coliProteins

-morethan2,000proteinswerevisualized2.2.5酶的结晶

酶以晶体的形式从溶液中析出。

1.一定的纯度

2.一定的浓度

3.温度

4.pH

5.离子强度条件：1.盐析结晶法

2.有机溶剂结晶法

3.渗透平衡结晶法

4.等电点结晶法方法：2.2.6酶的浓缩与干燥

酶的浓缩：从低浓度酶液中除去部分的水或其他溶剂而成为高浓度溶液的过程。

1.离心

2.过滤

3.膜分离

4.沉淀

5.层析

6.蒸发

7.吸水剂及干燥剂的应用2.2.7酶的浓缩与干燥

酶的干燥：将固体、半固体或浓缩液中的水分（或其他溶剂）除去一部分，以获得含水分较少的固体的过程。

1.真空干燥

2.冷冻干燥

3.喷雾干燥

4.气流干燥

5.吸附干燥GuidelinesforProteinPurification减少每步操作时间toavoidlengthyprocedureswhichrisklosingactivity/reducingrecovery减少添加物additivesmayneedtoberemovedinanextrapurificationstepormayinterferewithactivityassays早期除去降解物forexample,proteases每步使用不同的纯化方法totakeadvantageofsamplecharacteristicswhichcanbeusedforseparation(size,charge,hydrophobicity,ligandspecificity)KEEPITSIMPLE!三、酶与细胞固定化主要内容为什么要固定化什么叫做固定化如何固定固定化的酶活力测量固定化酶的特征固定化酶的应用1、稳定性差2、回收困难，一次使用3、产物的分离纯化困难(一)为什么要对酶进行固定化？(二)什么是固定化酶固定化酶（Immobilizedenzyme）：固定在一定载体上，在一定空间范围内起催化作用的酶。水溶性酶水不溶性载体水不溶性酶（固定化酶）固定化技术必须注意维持酶的催化活性及专一性固定化应该有利于生产自动化、连续化固定化酶应该有最小的空间位阻酶与载体必须结合牢固固定化酶应有最大的稳定性固定化酶成本要低(三)固定化酶的制备原则优点固定化酶可以重复，使用效率高，成本低极易将固定化酶与底物、产物分开；在大多数情况下，能提高酶的稳定性；具有一定的机械强度可以在较长时间内进行反复分批反应和装柱连续反应；酶反应过程能够加以控制；产物溶液中没有酶的残留，简化了提纯工艺；较游离酶更适合多酶反应；可以增加产物的收率，提高产物的质量；酶的使用效率提高，成本降低。(四)固定化酶的优缺点缺点固定化时，酶活力有损失；工厂初始投资大；只能用于可溶性底物；胞内酶必须经过酶的分离。吸附法、包埋法、结合法、交联法、热处理法(五)如何进行酶固定化固定化酶的模式图定义；利用各种固体吸附剂将酶或含酶细胞吸附在其表面上而使酶固定的方法称为物理吸附法，简称吸附法。常用的吸附剂：活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅胶、羟基磷灰石等。优点：操作简便、条件温和、不易变性失活、载体廉价、可反复使用。缺点：酶与载体结合不牢固，易脱落；最适吸附酶量无规律可循。1、吸附法定义：将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中，使酶固定化的方法称为包埋法。根据包埋的材料和包埋方法的不同，可分为：凝胶包埋法和半透膜包埋法两类。2、包埋法将酶分子包埋在凝胶格子里。凝胶包埋法用得最多、最有效，但不适用于底物或产物分子很大的酶类的固定化。2.1凝胶包埋法条件温和，操作简便，对酶活影响小，但强度差。天然凝胶：合成凝胶：琼脂凝胶、海藻酸钙凝胶、角叉菜胶、明胶等；聚丙烯酰胺凝胶、光敏交联树脂等强度高，对温度、pH值变化耐受性强，需要特定的聚合条件，酶易变性。包埋材料将酶包埋在有各种高分子聚合物制成的小囊中，制成固定化酶。半透膜：聚酰胺膜、火棉胶膜等。适用于底物和产物都是小分子的酶的固定化。2.2半透膜包埋法（微囊化法）3.1离子键结合法通过离子键使酶与载体结合的固定化方法。载体：DEAE-纤维素、TEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶、CM-纤维素。

优点缺点酶与载体结合不牢固，使用时需严格控制好pH值、离子强度、温度等操作条件。3、结合法条件温和、操作简便、活力损失少。★通过共价键使酶与载体结合的固定化方法。载体主要有：纤维素、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、甲壳质、氨基酸共聚物、甲基丙烯醇共聚物等。※载体→活化→活化载体基团＋酶分子基团

3.2共价键结合法适用于含有苯氨基的不溶性载体载体先在稀HCl和亚硝酸钠中进行重氮反应，然后再在温和条件下和酶分子上相应的基团如酚羟基或咪唑基进行偶联。（1）重氮法Tyr含量高的木瓜蛋白酶、脲酶、葡萄糖氧化酶、碱性磷酸酶、β-葡萄糖苷酶可与多种重氮化载体连接。（2）叠氮法

含有酰肼基团的载体可用亚硝酸活化，生成叠氮化合物。活泼的叠氮基团可与酶分子中的-NH2形成肽键，此外叠氮基团还可与酶分子中的-OH、-SH等反应。使酶固定化。如：对于带-OH的载体如葡萄糖、纤维素、琼脂糖来说是最常用的反应。在碱性条件下载体-OH和BrCN反应生成极活泼的亚氨基碳酸酯衍生物，它们在碱性条件下可与酶的氨基进行共价偶联反应。（3）溴化氰法碱性氨基甲酸衍生物亚氨碳酸酯衍生物+ENZ异脲型亚氨碳酸酯型氨基甲酸酯型（4）烷基化法含羟基的载体可用三氯-均三嗪、溴乙酸溴等多卤代物活化。活化载体上的卤素基团可与酶分子上的氨基、巯基、羟基等发生烷基化反应，制备固定化酶。R-OH+NNNClClCle.g.R-ONNNClClR-ONNNNH-EClE-NH2利用双功能试剂，在酶分子间或酶与载体间，或酶与惰性蛋白间进行交联反应，以制备固定化酶的方法。交联试剂：戊二醛、己二胺、顺丁烯二酸酐、双偶氮苯等。4、交联法酶分子之间共价交联和与水不溶性载体共价偶联酶分子；（a）酶分子之间用双功能基团的化学交联试剂相互交联成水不溶性的固定化酶；（b）酶分子被偶联到水不溶性载体上形成水不溶性的固定化酶交联反应条件激烈，酶的多个基团被交联，致使酶的活力损失大。制备的固定化酶颗粒较小，不便于使用。优点缺点结合牢固，酶不会脱落，可长时间使用。双重固定化5、热处理法如：将培养好的含葡萄糖异构酶的链霉菌在60~65℃温度下处理15min，可以使葡萄糖异构酶固定在菌体内。将含酶细胞在一定温度下热处理一段时间，使酶固定在菌体内。只适用于热稳定性较好的酶的固定化。方法优点缺点吸附法制作条件温和、简便、成本低、载体再生、可反复使用结合力弱，对pH、离子强度、温度等因素敏感，酶易脱落，酶的装载容量较小共价法载体与偶联方法可选择性大；酶的结合力强，非常稳定偶联条件激烈，易引起酶失活；成本高，某些偶联试剂有一定毒性交联法可用的交联试剂多，技术简易，酶的结合力强，稳定性高交联条件激烈，机械性能差包埋法包埋材料、包埋方法可选余地大，固定化酶的使用面广，包埋条件温和仅可用于低分子量的底物，不适用于柱系统，常有扩散限制问题各种酶固定化方法的比较影响固定化酶（细胞）性质的因素

酶经过固定化后引起的性质改变，不外乎两种原因：一是酶本身的变化，二是受固定化载体的物理或化学性质的影响。就载体物化性质和固定化过程影响而言，主要存在以下三种影响效应：.

分配效应

空间障碍效应扩散限制效应固定化后的特征Chapter5ModificationofEnzymeMolecule第五章酶的分子修饰Contentsofchapter5酶分子修饰种类为什么要进行酶分子修饰酶分子修饰部位及专一性分类酶修饰后的性质变化GoGoGoGo酶的定向进化Go什么是酶分子修饰？通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变，从而改变酶的某些特性和功能的技术过程称为酶分子修饰。即：在体外将酶分子通过人工的方法与一些化学基团（物质），特别是具有生物相容性的物质，进行共价连接，从而改变酶的结构和性质。第一节为什么要进行酶修饰限制酶大规模应用的原因：1)细胞外稳定性差；2)酶活性不够高；3)具有抗原性。酶化学修饰的意义(1).研究酶的结构与功能的关系。（50年代末）(2).人为改变天然酶的某些性质，扩大酶的应用范围。（70年代末之后）1）提高酶的生物活性（酶活力）。2）增强酶的稳定性（热稳定性、体内半衰期）。3）消除抗原性（针对特异性反应降低生物识别能力）。4）产生新的催化能力。1）提高酶的生物活性（酶活力）

蛋白一级结构通过内部氨基酸侧链基团的相互作用,按热力学最稳定方式形成了特有的高级结构.(即一级结构的氨基酸顺序决定了高级结构),而高级结构决定了功能.一级结构修饰后发生改变很多情况下会引起高级结构发生改变,从而改变蛋白功能(包括酶活力)热稳定性修饰剂分子存在多个反应基团，可与酶内部基团形成多点交联。使酶的天然构象产生“刚性”结构。对抑制剂稳定性大分子修饰剂与酶结合后，产生的空间障碍或静电斥力阻挡抑制剂，“遮盖”了酶的活性部位。对水解酶的稳定性A大分子修饰剂产生空间障碍阻挡蛋白水解酶接近酶分子。“遮盖”酶分子上敏感键免遭破坏。B酶分子上许多敏感基团交联上修饰剂后，减少了受蛋白水解酶破坏的可能性。2）增强酶的稳定性

酶蛋白氨基酸组成的抗原决定簇，与修饰剂形成了共价键。破坏了抗原决定簇——抗原性降低乃至消除

“遮盖”了抗原决定簇——阻碍抗原、抗体结合3)消除抗原性4)其它大分子修饰剂本身是多聚电荷体，能在酶分子表面形成“缓冲外壳”，抵御外界环境的极性变化，维持酶活性部位微环境相对稳定酶蛋白化学修饰的局限性1.某种修饰剂对某一氨基酸侧链的化学修饰专一性是相对的，很少有对某一氨基酸侧链绝对专一的化学修饰剂。2.酶的化学修饰只能在具有极性的氨基酸残基侧链上进行，目前还不能用化学修饰的方法研究非极性氨基酸残基在酶结构与功能关系中的作用。3.酶化学修饰的结果对于研究酶结构与功能的关系能提供一些信息，如某一氨基酸残基被修饰后，酶活力完全丧失，说明该残基是酶活性所“必需”的，为什么是必需的，还得用X射线和其他方法来确定。因此化学修饰法研究酶结构与功能关系尚缺乏准确性和系统性。第二节酶分子修饰部位及专一性分类酶蛋白结构部位分类修饰专一性分类酶分子非必需基团必需基团活性中心必需基团活性中心外必需基团结合基团催化基团非活性中心活性中心一酶蛋白结构部位分类活性中心的共性(1)活性部位只占酶分子很小的一部分（1-2%）。(2)活性部位是一个三维实体。(3)活性中心位于酶分子表面的疏水性裂缝中。(4)活性中心构象不是固定不变的（诱导契合）。(5)酶与底物通过盐键、氢键、范德华力和疏水作用等次级键结合。活性中心的重要化学基团

7种氨基酸出现的频率最高

LysAspGluCysHisTyrSer

（兰天果拌猪肉丝）某些功能基团,如（氨基、羧基、巯基、羟基和咪唑基）是酶的必需基团。赖氨酸的氨基天冬氨酸和谷氨酸的羧基半胱氨酸的巯基组氨酸的咪唑基酪氨酸和丝氨酸的羟基1)非专一性化学修饰用非专一性的修饰试剂与氨基酸侧链基团作用。若某基团被修饰后：酶活性不变——该基团可能不是酶的必需基团酶活性降低或丧失——该基团可能是酶的必需基团二修饰专一性分类2)专一性化学修饰（基团专一性修饰）用专一性化学修饰剂修饰酶活性中心的某一氨基酸残基的侧链基团。3)亲和标记（位点专一性修饰）采用的修饰试剂是根据底物的化学结构设计合成的含有活泼反应基团的底物类似物。利用酶对底物的特殊亲和力将酶加以修饰标记。化学修饰的专一性第三节酶分子的修饰方法金属离子置换修饰大分子结合修饰(共价/非共价;多结合水不溶分子)侧链基团修饰(多结合水溶解性小分子)肽链有限水解修饰氨基酸置换修饰酶分子的物理修饰

(1)酶的金属离子置换修饰把酶分子中的金属离子换成另一种金属离子，使酶的特性和功能发生改变的修饰方法称为金属离子置换修饰。α-淀粉酶中的钙离子（Ca2+），谷氨酸脱氢酶中的锌离子(Zn2+)，过氧化氢酶分子中的铁离子(Fe2+)，酰基氨基酸酶分子中的锌离子（Zn2+）,超氧化物歧化酶分子中的铜、锌离子(Cu2+,Zn2+)若从酶分子中除去其所含的金属离子，酶往往会丧失其催化活性。如果重新加入原有的金属离子，酶的催化活性可以恢复或者部分恢复。若用另一种金属离子进行置换，则可使酶呈现出不同的特性。有的可以使酶的活性降低甚至丧失，有的却可以使酶的活力提高或者增加酶的稳定性。金属离子置换修饰的过程

a.酶的分离纯化：首先将欲进行修饰的酶经过分离纯化，除去杂质，获得具有一定纯度的酶液。

b.除去原有的金属离子：在经过纯化的酶液中加入一定量的金属螯合剂，如乙二胺四乙酸（EDTA）等，使酶分子中的金属离子与EDTA等形成螯合物。通过透析、超滤、分子筛层析等方法，将EDTA-金属螯合物从酶液中除去。此时，酶往往成为无活性状态。

c.加入置换离子：于去离子的酶液中加入一定量的另一种金属离子，酶蛋白与新加入的金属离子结合，除去多余的置换离子，就可以得到经过金属离子置换后的酶。金属离子置换修饰只适用于那些在分子结构中本来含有金属离子的酶。用于金属离子置换修饰的金属离子，一般都是二价金属离子。

(2)酶的大分子修饰使用一些能与酶非共价地相互作用而又能有效地保护酶的一些添加物，如聚乙二醇、右旋糖苷等，它们既能通过氢键固定在酶分子表面，也能通过氢键有效地与外部水相连，从而保护酶的活力。一些添加物，如多元醇、多糖、多聚氨基酸、多胺等能通过调节酶的微环境来保护酶的活力。另一类添加物就是蛋白质。蛋白质分子之间相互作用时，其表面区域内排除了水分子，因而增加了相互作用力，其稳定性也就增加了。非共价修饰用可溶性大分子，如聚乙二醇、右旋糖苷、肝素等，通过共价键连接于酶分子的表面，形成一层覆盖层。例如：用聚乙二醇修饰超氧物歧化酶，不仅可以降低或消除酶的抗原性，而且提高了抗蛋白酶的能力，延长了酶在体内的半衰期从而提高了酶药效。每分子核糖核酸酶与6.5分子的右旋糖酐结合，可以使酶活力提高到原有酶活力的2.25倍；每分子胰凝乳蛋白酶与11分子右旋糖酐结合，酶活力达到原有酶活力的5.1倍共价修饰大分子修饰(共价)的过程修饰剂的选择：大分子结合修饰采用的修饰剂是水溶性大分子。例如，聚乙二醇（PEG）、右旋糖酐、蔗糖聚合物（Ficoll）、葡聚糖、环状糊精、肝素、羧甲基纤维素、聚氨基酸等。要根据酶分子的结构和修饰剂的特性选择适宜的水溶性大分子。(均相反应,无毒害)修饰剂的活化：作为修饰剂中含有的基团往往不能直接与酶分子的基团进行反应而结合在一起。在使用之前一般需要经过活化，然后才可以与酶分子的某侧链基团进行反应。修饰：将带有活化基团的大分子修饰剂与经过分离纯化的酶液，以一定的比例混合，在一定的温度、pH值等条件下反应一段时间，使修饰剂的活化基团与酶分子的某侧链基团以共价键结合，对酶分子进行修饰。分离：需要通过凝胶层析等方法进行分离，将具有不同修饰度的酶分子分开，从中获得具有较好修饰效果的修饰酶。聚乙二醇是线性分子具有良好的生物相容性和水溶性，在体内无毒性、无残留、无免疫原性，并可消除酶的抗原性，使其末端活化后可以与酶产生交联，因而，它被广泛用于酶的修饰。酶半衰期相对稳定性天然SOD

6min

1右旋糖酐-SOD

7h

70

Ficoll(低分子量)–SOD

14h

140

Ficoll(高分子量)–SOD

24h

240

聚乙二醇-SOD

35h

350(3)酶分子的侧链基团修饰采用一定的方法（一般为化学法）使酶蛋白的侧链基团发生改变，从而改变酶分子的特性和功能的修饰方法。可以用于研究各种基团在酶分子中的作用及其对酶的结构、特性和功能的影响。在研究酶的活性中心中的必需基团时经常采用。酶蛋白的侧链基团是指组成蛋白质的氨基酸残基上的功能团。主要包括氨基、羧基、巯基、胍基、酚基等。这些基团可以形成各种副键，对酶蛋白空间结构的形成和稳定有重要作用。侧链基团一旦改变将引起酶蛋白空间构象的改变，从而改变酶的特性和功能。(一级结构是基础)催化活性/非催化活性基团的修饰对非催化基团修饰可改变酶的动力学性质，改变酶对特殊底物的束缚能力。

(改变对底物亲和能力)对催化活性基团可以通过选择性修饰侧链成分来实现氨基酸的取代。(改变催化性质)经常被修饰的残基是： 亲核的Ser、Cys、Met、Thr、Lys、His 亲电的Tyr、Trp氨基酸侧链基团修饰剂Lys氨基三硝基苯磺酸，2，4－二硝基氟苯、碘乙酸、碘乙酰胺、丹磺酰氯、亚硝酸Asp、Glu羧基水溶性碳化二亚胺Arg胍基苯乙二醛，1,2－环己二酮、丁二酮Cys巯基碘乙酸、碘乙酰胺、N-乙基马来酰亚胺二硫键巯基乙醇、DTTHis咪唑基焦碳酸二乙酯、碘乙酸Tyr酚羟基碘、四硝基甲烷Trp吲哚基N-溴代琥珀酰亚胺各种氨基酸侧链的修饰剂常见基团的化学修饰反应：羧基常见基团的化学修饰反应：氨基常见基团的化学修饰反应：巯基常见基团的化学修饰反应：咪唑基常见基团的化学修饰反应：酚羟基常见基团的化学修饰反应：胍基常见基团的化学修饰反应：色氨酸吲哚基(4)酶蛋白主链修饰(肽链有限水解修饰)利用酶分子主链的切断和连接，使酶分子的化学结构及其空间结构发生某些改变，从而改变酶的特性和功能的方法。酶蛋白主链修饰主要是靠酶切/酶原激活法。a、胃蛋白酶原的激活b、胰蛋白酶原（trypsinogen）的激活

c、胰凝乳蛋白酶原（chymotrypsinogen）的激活

有限水解意味着水解酶量和时间相对少同时由于水解部位氨基酸”埋”在蛋白位置差异,氨基酸周围肽段引起的氨基酸pK值和电性变化,使同样氨基酸部位水解程度也可能不同酶蛋白的肽链被水解后，可能出现以下三种情况中的一种：1引起酶活性中心的破坏，酶失去催化功能。2仍维持活性中心的完整构象，保持酶活力。3有利于活性中心与底物结合并形成准确的催化部位，酶活力提高。

氨基酸或核苷酸的置换修饰可以采用化学修饰方法，例如，Bender等成功地利用化学修饰法将枯草杆菌蛋白酶活性中心的丝氨酸转换为半胱氨酸，修饰后，该酶失去对蛋白质和多肽的水解能力，却出现了催化硝基苯酯等底物水解的活性。但是化学修饰法难度大，成本高，专一性差，而且要对酶分子逐个进行修饰，操作复杂，难以工业化生产。(保护位点多,可修饰位点多;蛋白容易失去活力)

现在常用的氨基酸置换修饰的方法是定点突变技术。定点突变（sitedirectedmutagenesis）是20世纪80年代发展起来的一种基因操作技术。是指在DNA序列中的某一特定位点上进行碱基的改变从而获得突变基因的操作技术。是蛋白质工程（ProteinEngineering）和酶分子组成单位置换修饰中常用的技术。定点突变技术，为氨基酸或核苷酸的置换修饰提供了先进、可靠、行之有效的手段。(5)氨基酸置换修饰酶分子的定点突变1、基因序列分析2、蛋白质结构分析3、酶活性中心分析4、引物设计进行基因定点突变5、酶基因克隆表达6、变异特性分析(6)酶分子的物理修饰通过物理修饰，可以了解不同物理条件下，特别是在极端条件下（高温、高压、高盐、极端pH值等）由于酶分子空间构象的改变而引起酶的特性和功能的变化情况。特点在于不改变酶的组成单位及其基团，(与前五种方法区别)酶分子中的共价键不发生改变，只是在物理因素的作用下，副键发生某些变化和重排。第四节酶修饰后的性质变化热稳定性：一般来说，热稳定性有较大的提高。半衰期：一般在体内的半衰期得到有效延长。由于酶分子经修饰后，增强对热、蛋白酶、抑制剂等的稳定性，从而延长了在体内的半衰期。抗原性：比较公认的是PEG和人血清白蛋白在消除酶的抗原性上效果比较明显。各类失活因子的抵抗力：修饰酶对蛋白酶、抑制剂均有一定的抵抗能力，从而提高其稳定性。最适pH：大部分酶经化学修饰后，酶的最适pH发生了变化，这种变化在应用研究上有时具有重要意义。修饰酶最适pH更接近于生理环境，在临床应用上有较大意义。Km的变化：大多数酶经修饰后，Vm没有明显变化，但有些酶经修饰后，Km值变大。第五节酶的定向进化酶分子的合理设计(rationaldesign)

定点突变技术属于合理设计,这个技术需要对酶蛋白结构和功能间对应关系要有了解.通过设计酶结构而得到一些功能.酶分子的定向进化(directedevolution)

包括易错PCR技术,无须对蛋白结构和功能间对应关系有了解,先突变大量酶,再根据具体功能需要选择合适的酶,再了解酶结构.两种方法在酶结构和关系间建立联系,不段推动对酶蛋白结构和功能了解.两者联合设计新酶可取得不错效果酶的合理设计定向进化的原理定向进化的基本规则是“获取你所筛选的突变体”。定向进化=随机突变+选择。前者是人为引发的，后者虽相当于环境，但只作用于突变后的分子群，起着选择某一方向的进化而排除其他方向突变的作用，整个进化过程完全是在人为控制下进行的定向进化产生突变库手段-易错PCR在待进化酶基因的PCR扩增反应中，利用TaqDNA聚合酶不具有3’->5’校对功能的性质，(或则不含镁离子含锰离子的聚合酶)配合适当条件，向目的基因中随机引入突变，构建突变库，凭借定向的选择方法，选出所需性质的优化酶(或蛋白质)，从而排除其他突变体。相对于自然条件下聚合酶十万分之一到百万分之一的复制出错几率,可以大量产生突变体。DNA改组（DNAshuffling）又称有性PCR(sexualPCR)，原理。该策略的目的是创造将亲本基因群中的突变尽可能组合的机会，导致更大的变异，最终获取最佳突变组合的酶。通过DNA改组,不仅可加速积累有益突变，而且可使酶的2个或更多的已优化性质合为一体。外显子改组（exonshuffling）类似于DNA改组，两者都是在各自含突变的片段间进行交换，前者尤其适用于真核生物。在自然界中，不同分子的内含子间发生同源重组，导致不同外显子的结合，是产生新蛋白质的有效途径之一。与DNA改组不同，外显子改组是靠同一种分子间内含子的同源性带动，而DNA改组不受任何限制，发生在整个基因片段上。定向进化产生突变库手段-DNA改组和外显子改组DNA改组原理定向进化的选择策略1)、定向进化中，突变具有随机性，但通过选择特定方向的突变限定了进化趋势，加之控制实验条件，限定突变种类，降低突变率，缩小突变库的容量，这不仅减少了工作量，更重要的是加快了酶在某一方向的进化速度。2)、通常,筛选方法必须灵敏,至少与目的性质相关。另有一些其他的筛选方法，如加入能产生可见光信号的底物或利用绿色荧光蛋白的荧光性质等。

高通量的筛选体系(检测量低,并行化,自动化)-96孔板体外定向进化的意义理论上，蛋白质分子蕴藏着很大的进化潜力，很多功能有待于开发，这是酶的体外定向进化的基本先决条件。所谓酶的体外定向进化，又称实验分子进化，属于蛋白质的非合理设计，它不需事先了解酶的空间结构和催化机制，通过人为地创造特殊的条件，模拟自然进化机制(随机突变、重组和自然选择)，在体外改造酶基因，并定向选择出所需性质的突变酶。酶的体外定向进化技术极大地拓展了蛋白质工程学的研究和应用范围，特别是能够解决合理设计所不能解决的问题，为酶的结构与功能研究开辟了崭新的途径，并且正在工业、农业和医药等领域逐渐显示其生命力。酶性质突变方法枯草杆菌蛋白酶E有机相活性/稳定性易错PCRβ-内酰胺酶总活力/底物专一性DNA改组枯草杆菌蛋白酶BPN′稳定性盒式诱变对硝基苯酯酶底物专一性/有机相活性易错PCR/DNA改组胸腺嘧啶核苷激酶底物专一性盒式诱变β-半乳糖苷酶底物专一性DNA改组绿色荧光蛋白荧光DNA改组核酶底物专一性易错PCR/DNA改组天冬氨酸酶活性与稳定性随机/定位诱变药物和疫苗活性/专一性/最佳表达DNA改组酶的体外定向进化应用实例第一节酶在轻工、食品方面的应用一、酶在食品方面的应用1.酶法生产葡萄糖30-40%淀粉浆糊精α-淀粉酶pH6.0~6.585~90℃CaCl2,NaCl葡萄糖糖化酶pH4.5~5.055~60℃45min48hpH至2.0~2.5,室温,除去葡萄糖苷转移酶DE=15~202.酶法生产果葡糖浆40～45%葡萄糖果葡糖浆葡萄糖异构化酶pH6.5~7.0

60~70℃MgSO445min预先经层析脱钙处理