荧光定量PCR技术专题课件

荧光定量PCR仪技术内容概要荧光定量PCR的原理荧光定量PCR的标记方法荧光定量PCR解析方法实验方案的选择及SYBR法实验流程荧光定量产品选择指南荧光定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的关系对起始模板进行定量分析与常规PCR技术比较：对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析，无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测荧光定量PCR原理－－定义同一个样品重复96次起点定量与终点定量终点定量起点定量起始DNA量是样本中本来的量，更有意义； 终点DNA量经过PCR“加工”，不是研究所需要的数据起点定量误差小，终点定量误差大

扩增曲线荧光阈值

Ct值荧光定量PCR原理－－常用名词概念Cycle（循环数）Rn（荧光强度）BaselineLg－linerphase平台期荧光基团荧光检测元件荧光定量PCR原理－－扩增曲线Cycle（循环数）Rn（荧光强度）BaselineLg－linerphase

前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline）荧光阈值的缺省设置是3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍手动设置：大于荧光背景值和阴性对照的荧光最高值；进入指数期的最初阶段

真正的信号:荧光信号超过阈值Threshold荧光定量PCR原理－－荧光阈值平台期荧光阈值基线范围阈值标准偏差基线信号的标准偏差x10Ct值的定义：

PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数Cycle（循环数）Rn（荧光强度）Ctvalue荧光定量PCR原理－－Ct值Ct值荧光信号有统计学意义显著增长(即穿过阈值线)时的循环次数从基线到指数增长的拐点所对应的循环次数Ct值半对数图谱Ct值线性图谱横轴：PCR反应循环数纵轴：荧光信号量Ct值的特点：相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定；Ct值极具重现性Ct值的重现性CT值基线阈值基线调整规则如果Ct值>18，不需调整，使用自动分析结果如果Ct值<18，修改基线终点，再分析一次起点：进口试剂取3，国产试剂取6终点：最小的Ct值–4，通常为15长度：大于或等于6个循环基线阈值Ct值实验结束，软件根据默认值的基线(3-15)自动分析，给出结果和图谱如果Ct值>18，使用自动分析结果，出报告如果有Ct值<18，根据[最小的Ct值-4]修改基线终点，重新分析数据手工数据分析方法理想的PCR反应Xn＝X02n*Xn：第n次循环后扩增产物数量X0：起始模板数量n：扩增循环数荧光定量PCR原理－－Ct值定量的数学原理非理想的PCR反应Xn＝X0（1＋En）n*Xn：第n次循环后扩增产物数量X0：起始模板数量n：扩增循环数En：扩增效率荧光定量PCR原理－－Ct值定量的数学原理在扩增产物达到荧光阈值时XCt＝X0（1＋En）Ct＝M（1）*XCt：荧光扩增信号达到阈值时扩增产物的量，在阈值设定以后，它是一个常数，定为M方程式（1）两边同取对数得：Log2M＝Log2X0

*（1＋En）Ct（2）整理方程式（2）：Log2X0＝Log2M－CtLog2（1＋En）荧光定量PCR原理－－Ct值定量的数学原理CyclenumberCk104Ck102SampleLgofDNAconcentration

模板DNA量越多，荧光达到阈值的循环数越少，即Ct值越小。

Log模板起始浓度与Ct值呈线性关系。荧光定量PCR原理－－Ct值与模板起始量的关系Ct值与模板起始量的关系Ct值lg起始DNA浓度CT=-klgX0+b标准曲线方法标准品未知样本PCR方程只在指数期成立Log[DNA]循环数线性增长期平台期y=x(1+e)n指数增长期Ct值和阈值必须位于指数增长阶段内线性关系、扩增效率确认检测灵敏度确认Notemplatecontrol确认标准曲线斜率:-3－-3.535Cycles内可得到好的定量结果如果采用SYBR检测方法，30Cycles内无非特异性产物扩增35Cycles内无引物二聚体产生相关系数（R2）：大于0.98荧光定量PCR反应性的确认PCR扩增效率（E）:0.9-1.2内容概要荧光定量PCR的原理荧光定量PCR的标记方法荧光定量PCR解析方法实验方案的选择及SYBR法实验流程荧光定量产品选择指南非特异性荧光标记

SYBRGreenI

SYBRGreenⅡ特异性荧光标记

TaqManProbe常用荧光标记方法荧光染料法——原理

目前常用的荧光染料有SYBRGreenⅠ、SYBRGreenⅡ、SYTO9、HRM等。其共同性质为：（a）结合于双链核酸的小沟处（b）与双链DNA结合后受激产生荧光（c）在变性条件下双链分开，荧光消失SYBRGreenI热变性引物退火延伸反应荧光染料法——作用机理问题点：荧光染料与双链DNA进行结合后散发荧光，因此如果反应体系中有非特异性扩增或引物二聚体的产生，也将同时被检测，从而可能导致检测结果不准确。荧光染料法——问题点与关键点关键点：

设计合适引物，防止非特异性扩增！

使用荧光染料作为荧光基团时，由于荧光染料的特性随着PCR反应的进行，双链PCR产物呈指数增长，SYBRGreenⅠ/Ⅱ与双链PCR产物结合后荧光越来越强，当PCR反应结束时，荧光强度达到最大，此时对PCR产物进行缓慢加热，从50℃一直加热到99℃，在此过程中PCR产物按照TM值的大小双链被依次打开，荧光强度也随着双链的打开依次减弱，如下图：荧光染料法——融解曲线将温度与荧光强度的变化求导(-dI/dT)原始图谱导数图谱荧光染料法——融解曲线融解曲线分析，单一峰无非特异性荧光定量准确融解曲线分析，出现杂峰其他产物出现非特异性荧光，因此定量不准确只有染料法才需要做熔解曲线探针法没有必要双链核酸的熔解曲线分析熔解曲线反映的是一定序列长度的核酸双链，在一定的离子强度下的TM值。核酸双链的TM值由双链核苷酸之间相连接的氢键决定，不同的核酸双链，其TM值也不同，所以通过熔解曲线，能获知双链核酸的均一性、野生型和突变型双链之间的碱基差异等，如果采用高分辨率荧光染料，核酸双链哪怕只有一个碱基的差异，通过熔解曲线也能分析出来。

成本低，不必设计复杂探针

适合初步筛查：先用SYBR筛查，再用探针法精确定量少数关键样品熔解曲线：鉴定PCR有无杂带、引物二聚体优点

无模板特异性：不能分辨主带与杂带，给出的是总信号对引物特异性要求较高不能进行多重定量：每孔只能检测一个目标基因灵敏度相对较低：适合于5000拷贝以上的基因定量缺点荧光染料法——优缺点Taqman探针法——原理

5′端标记有报告基团(Reporter,R)，如FAM、VIC等

3′端标记有荧光淬灭基团(Quencher,Q)

探针完整，R发射的荧光能量被Q基团吸收，无荧光，R与Q分开，发荧光

Taq酶有5′→3′外切核酸酶活性，可水解探针,荧光产生。Taqman探针法——工作机理热变性引物和探针与模板退火延伸反应探针报告基团淬灭基团探针DNA聚合酶引物RRRR1、引物、探针的设计：

探针Tm为68-70℃，<30bp,5’不能有G，G可能会淬灭荧光素，引物尽量靠近探针，扩增片段<400bp，引物Tm为59-60℃2、反应参数的确定：

一般为：94℃，10-20s60℃，30-60s（Taq酶5′→3′外切核酸酶活性在60℃最高），也可通过温度梯度优化退火温度

3、优化引物和探针浓度：获得最小Ct值，最大信号/背景比值引物浓度：100-900nM探针浓度：50-300nM4、其他与常规PCR相同Taqman探针法——PCR体系的建立

高度特异性重复性好灵敏度高可进行多重定量优点

只适合一个特定的目标委托公司标记，价格较高不易找到本底低的探针缺点Taqman探针法——优缺点

标记荧光的发夹探针环与目标序列互补茎由互补配对序列组成环茎荧光素淬灭剂实时荧光定量PCR的分类－－分子信标FRET实时荧光定量PCR的分类－－分子信标高特异性：对目标序列检测SNP最灵敏的试剂之一荧光背景低优点

只能用于一个特定目标设计困难价格比较高缺点实时荧光定量PCR的分类－－分子信标

几种方法的应用比较方法优点缺点适用范围SYBRGreen染料法适用性广灵敏方便便宜引物要求高易出现非特异性带适合科研中对各种目的基因定量分析，基因表达量的研究，转基因重组动植物的研究TaqMan方法特异性高重复性好价格高只适合特定目标病原体检测，疾病耐药基因研究,药物疗效考核遗传疾病的诊断MolecularBeacon法(分子信标)高特异性荧光背景低只适合特定目标设计困难价格高特定基因分析SNP分析

定性分析研究：杂合或纯合子鉴定，（SNPs）分析等

绝对定量研究：病毒和病原菌定量分析，基因拷贝数定量，

GMO定量检测等

相对定量研究：mRNA表达量分析，siRNA效果确认，差异显示结果验证等荧光定量PCR技术的应用内容概要荧光定量PCR的原理荧光定量PCR的标记方法荧光定量PCR解析方法实验方案的选择及SYBR法实验流程荧光定量产品选择指南绝对定量解析方法Sample25绝对定量的定义

Log（起始浓度）与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线,即得到该扩增反应存在的线性关系

根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量一个目的基因

——即需要确定其量值的核酸序列。一组标准样本

——用来生成标准曲线。可以是含有目的基因的质粒、PCR产物、基因组DNA等。重复反应孔

–——建议每个样本使用三个或更多重复反应，以确保统计显著性。标记方法的选择——SYBRGreen法或探针法均可。实验结果显示——扩增曲线；标准曲线；融解曲线（探针法不需要）。绝对定量分析几要素拷贝数的计算：待测样本浓度（ng/ul）＝OD260×40×稀释倍数样本分子量=碱基数×324待测样本拷贝数（copies/ul）=待测样本浓度/样本分子量×6×1014倍比梯度稀释方法：1v原液(标准品i)+9v稀释缓冲液，得标准品ii1v标准品ii+9v稀释缓冲液，得标准品iii1v标准品iii+9v稀释缓冲液，得标准品iv1v标准品iv+9v稀释缓冲液，得标准品v质粒标准品稀释方法与拷贝数计算相对定量解析方法相对定量分析方法比较两个或两个以上样本中某个基因表达量的变化！关注点：基因的相对表达量，而不是基因的绝对量！一个参照样本一个或一个以上的未知样本一个目的基因内参基因——用来校对不同样本之间目的基因的实际表达量重复反应孔

–——建议每个样本使用三个或更多重复反应，以确保统计显著性。标记方法的选择——SYBRGreen法或探针法均可。实验结果显示——扩增曲线；标准曲线（有些分析方法不需要）；融解曲线（探针法不需要）。一组标准样本（有些分析方法不需要）相对定量分析几要素内参基因

实验操作中，由于样品选取时样品的细胞个数不可能完全相同，RNA提取时得率不同、RNA反转录为cDNA的效率不同等客观因素，用于定量分析的初始样品浓度不同，这就造成了比较上的混乱，因此在进行基因表达调控研究中都会用一些内参基因来标准化，以校正因样品初始浓度不同而造成的差异。内参基因是在各种生理条件下表达量恒定的基因，这些基因也常被称为看家基因，该基因表达一般不随外界的变化而变化，所以常被用作内参照，如：GAPDH基因、β-Actin基因，18srRNA基因等。相对定量分析——内参基因筛选筛选方法

根据文献提供通过具体实验筛选geNorm内参分析软件选择相对定量分析——内参基因筛选0123456Sample1Sample2Sample3Sample4实验组实验值β-ActinGAPDHβ-2-microglobulinHPRTP

P

P

O

根据实验的实际情况，不同组织、不同细胞、细胞的不同生理时期、不同的理化条件刺激等，查阅相关资料，选取三、四合适的内参基因，做荧光定量PCR，先以CT值最小的那条基因作为内参，其他几条内参基因与其相比，分析所得的比值，找出比值稳定的几条基因，比值稳定说明该基因表达稳定，适合作为理想的内参。双标准曲线法

2-△△Ct法

相对定量分析——两种常用的分析方法双标准曲线法就是对每个样品的内参基因和目的基因都做绝对定量，求出每个样品中内参基因和目的基因的绝对数量，然后根据相对定量的基本公式来求出目的基因的差异表达。相对值=校正值=目的基因定量结果内参基因定量结果待测样品的校正值对照样品的校正值相对定量分析——双标准曲线法公式：优点：分析简单，实验优化相对简单缺点：对每一个基因，每一轮实验都必需对目的基因和内参基因做标准曲线应用：该方法适合样品量大，但是所分析目的基因较少的实验。相对定量分析——双标准曲线法检测样品内参基因H目的基因X定量结果定量结果校正值相对量对照样品6391.5343.40.05371.000待测样品18589.717.30.00200.037待测样品27432.91946.10.26184.874实验数据公式：F=2－相对定量分析——2－△△Ct法

前提条件：目的基因和内参基因的扩增效率相同且都为1，在试验开始前必须分别对目的基因和内参基因作标准曲线，看两者扩增效率的差别，假如两者扩增效率之间的差异小于0.1，就可以用该方法分析。而且在接下来的实验中，无需再做标准品。应用：特别适合于样品量不大，但是检测的基因种类很多的情况。待测组目的基因平均Ct值待测组内参基因平均Ct值对照组目的基因平均Ct值对照组内参基因平均Ct值－－－内容概要荧光定量PCR的原理荧光定量PCR的标记方法荧光定量PCR解析方法实验方案的选择及SYBR法实验流程荧光定量产品选择指南一、实验方案的选择荧光定量PCR实验方案荧光染料法Taqman探针法双标准曲线法2--△△Ct法双标准曲线法2--△△Ct法

荧光定量PCR实验方案的选择（1）染料法适合于基因含量及基因表达变化的粗略分析或初筛；在分析的基因种类很多，但是样品量很少时，尤其适用。（2）探针法适合常被用作基因含量的精确检测(精确度可达几十个拷贝)及基因表达变化的精确分析（精确度可达0.1倍的变化）。（3）双标准曲线法适合样品量大、检测的基因种类相对较少、精度要求较高的实验。（4）2-△△Ct法适合检测精度要求一般，样品量相对较少，检测的基因种类相对较多的实验。根据实验的实际情况，如检测的精度要求、样品数量、基因数量、经费情况等来选择合适的实验方案。二、SYBR法实验流程及注意事项样品制备定量体系配备引物设计反应条件优化浓度确定技能要求环境要求误差控制数据分析仪器介绍RT上机反应体系优化试剂选择分析方法样品制备环境要求定量体系配备数据分析RT上机浓度确定SYBR法实验流程及注意事项无RNase环境使用无RNase耗材专用RNase-free工具纯度高、完整性好的RNA分光光度计检测电泳检测RT反应体系优化试剂选择样品制备定量体系配备数据分析上机AMVM-MLVQuant下游反应数确定反转录体积引物的选择高效、全长的cDNASYBR法实验流程及注意事项定量体系配备引物设计浓度确定环境要求误差控制RT样品制备数据分析上机核酸制备区反应液制备区制作标准曲线设定浓度区间使用mix降低系统误差设置重复（≥3次）设置空白和阴性对照均一的反应液和模板混合物GC％：50－60％Tm：50－65℃单个碱基重复＜4个无二级结构扩增长度：100－200bp反应体系优化上机反应条件优化RT样品制备模板准备数据分析退火温度优化：梯度PCR延伸时间：产物长度决定反应体积＞5ul，推荐20－50ul引物浓度优化，模板量优化Mg2＋调节，酶活调节扩增效率：90％－110