荧光分析法(2010)课件

《仪器分析实验》实验5荧光光度法测定维生素B2含量一、分子荧光分析法简介(对光的吸收)发生激发态反应分子内的激发和衰变过程1.1荧光的产生激发态能量的跃迁与转化的形式和速率：A1,A2吸收:10-15sVR振动松弛：10-12sic内转化：10-11sisc系间窜越：

10-6

~10-2sF荧光：10-9~10-6sP磷光：10-6~100s激发光谱发射光谱1.2荧光光谱

任何荧光化合物，都具有两种特征的光谱：激发光谱(Excitation)和发射光(Emission)谱。组成、结构与衍化信息☆物质的化学结构☆环境与介质条件☆与其它溶质的相互作用☆反应动力学

任何荧光化合物，都具有两种特征的光谱：激发光谱和发射光谱。激发光谱：固定发射波长扫描激发波长发射光谱：固定激发波长扫描发射波长激发光谱与发射光谱的镜像关系ex=290nm(MAX)固定em=620nm(MAX)固定ex=290nm(MAX)em=620nm(MAX)激发光谱与发射光谱的镜像关系S04321S143211→

41→

31→

21→11

→41

→41

→21

→1ex=290nm(MAX)ex=290nm(MAX)ex=290nm(MAX)ex=290nm(MAX)ex=290nm(MAX)ex=290nm(MAX)ex=290nm(MAX)ex=290nm(MAX)ex=290nm(MAX)1.3荧光定量IF----荧光强度F-----荧光量子产率（☆注意：在一定浓度范围内适用）b--吸收光程--摩尔吸光系数C--荧光物质浓度εIF=2.30kφFI0εbcIF=KC?问题：1）影响相对荧光强度的因素有哪些？2）试比较荧光法与紫外-可见分光光度法的分析性能。1.4荧光仪的基本构造？问题：荧光光度计与紫外-可见分光光度计在光路设置上有什么不同？为什么？光源1.光源的要求：发射强度足够且稳定的连续光谱光辐射强度随波长的变化小有足够长的使用寿命2.氙灯光源常用气体放电灯类型：

氙灯光源高压汞光源波长范围：200~1000nm工作压力：5~20atm启动电压：20~40KV使用寿命：1000~2000h最广泛应用的连续光源：发射波长范围宽发射光强度大单色器平面衍射光栅检测器光电倍增管放大倍数：2n~5n;n=10,103~107，最大108~109样品池：液池、荧光池1.样品池的材料：与紫外-可见分光光度计的吸收池一样2.吸收池的形状：紫外-可见分光光度计的吸收池两面透光荧光分光光度计的样品池四面透光波长范围3.使用注意事项容易破碎问题：紫外-可见分光光度计的吸收池与荧光分光光度计的样品池有什么区别？沾污问题紫外-可见分光光度计:光源样品池单色器检测器数据处理仪器控制荧光(磷光)分光光度计:光源样品池激发单色器检测器数据处理仪器控制发射单色器紫外-可见分光光度计

测量池(吸收池)荧光分光光度计样品池I0ItI0ItIF,p1.5分子荧光分析法的应用简介★常规分析应用：

☆定性分析：φf；λex；λem；峰形等☆定量检测：F=K﹒I0﹒φf﹒C☆其它（略）★高端生化研究：

☆分子相互作用研究；☆代谢动力学跟踪；☆显微成像（物理迁移与化学衍化的原位“显迹”）维生素B2含量的荧光光度法测定标准曲线法将已知量的标准物经过和样品同样处理后，配制一系列的标准溶液，测其荧光强度，以荧光强度对荧光物质含量绘制标准曲线。测定样品溶液的荧光强度后即可由标准曲线求出样品溶液中荧光物质的含量。荧光分析的灵敏度比紫外－可见分光光度法高103～104.FCsFxCx实验原理维生素B2的化学结构C17H20N4O6★在近中性的水溶液中有较强的荧光发射:（535nm附近）

★在碱性介质中不稳定且荧光消失（pH=11）★易发生光降解，对热稳定实验步骤１、试液配制：配制系列标准溶液取VB2标准溶液(5ug/ml)1.00ml,2.00ml,3.00ml,4.00ml,5.00ml于25ml比色管中,稀释至刻度.2、样品药片的处理及未知液的配制取2片药片置于洗净的小烧杯中,加20-30ml去离子水中,水浴中加热30min,冷至室温后,转移到250ml容量瓶中,稀释至刻度.过滤,弃取初滤液,取0.5ml到25ml比色管中,稀释至刻度.3、VB2的荧光光谱的绘制扫描激发波长和发射波长,找出最大激发波长和发射波长.4、标准工作曲线的制作及样品测定固定激发波长和发射波长,测定每管标准溶液和样品的荧光强度.2.3注意事项：☆试液的移取与稀释☆系列标液的测定顺序☆即放即测，防光降解☆荧光仪的开关机顺序2.4数据处理从荧光光谱图上读出最大激发（λex）和发射波长（λem）用标准工作曲线法算出所配实测试液的浓度计算药片中维生素B2的含量，并计算测定量占标示量的百分数日立F-2500型荧光光度计的使用“波长扫描”操作步骤

Start↓Methodsetting↓Samplename↓Pre-scan↓Measurement↓Dataprocessing↓Print↓EndMethod键的使用General→Measurement→WavelengthscanOperator→姓名(1)Instrument→Scanmode→Excitation(做激发)Datamode→FluorescenceEMWL→523nmEXStartWL→300nmEXEndWL→500nmScanspeed→3000nm/minEXSlit→5.0nmEMSlit→5.0nmPMTVoltage→700V(2)Instrument→Scanmode→Emission(做发射)Datamode→FluorescencEXWL→354nmEMStartWL→360nmEMEndWL→700nmScanspeed→3000nm/minEXSlit→5.0nmEMSlit→5.0nmPMTVoltage→700VSamples→输入样品数→Updata→okPre-scan→按Pre-scan键Measurement→按Measurement键→Yes→okDataprocessing→显示最大强度值Print→打印波长扫描图↓“定量分析”操作步骤Method键的使用Start↓Methodsetting↓Samplename↓Measurement↓Print↓EndGeneral→saveas→存放文件地址Measurement→PhotometryOperator→姓名Quantitation→Quantitationtype→WavelengthCalibrationtype→1storderInstrument→Datamode→fluorescenceWavelengthmode→BothWLFixed

EX→370nmEM→523nmEX