第8章 基因工程

《生物技术概论》CorrespondingE-mail:ygwu@第八章基因工程主讲：李继杰CollegeofChemicalEngineering,GuiZhouUniversity

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DNA与遗传物质

DNA与基因

基因工程技术及应用FromDNAtoHuman一.DNA与遗传物质1.DNA的化学本质DNA就是脱氧核糖核酸(长链)核酸：核苷酸通过3’5-磷酸二酯键联在一起;核苷酸：核苷的磷酸酯;核苷：碱基(AGTC四种)与戊糖(DNA在2’位脱氧,RNA不脱氧)通过糖苷键形成。核苷酸☉碱基Nitrogenousbases嘧啶Pyrimidines嘌呤Purines胸腺嘧啶胞嘧啶腺嘌呤鸟嘌呤碱基配对原则：A——TG——CDNA中的碱基类型☉核苷(nucleotide)糖苷键Glycosidicbond嘧啶的1位N原子、嘌呤的9位N原子核糖是戊糖RNA－核糖核苷

DNA－脱氧核糖核苷☉核苷酸(nucleotideacid)核苷的磷酸酯脱氧核糖核苷酸

核糖核苷酸其中α和β、β和γ之间是高能磷酸键Deoxynucleotides91’αβγ2.DNA的结构(1)X-raydiffractiondatashowedthatDNAhastheformofaregularhelix,makingacompleteturnevery34Å(3.4nm),withadiameterof~20Å(2nm).Sincethedistancebetweenadjacentnucleotidesis3.4Å,theremustbe10nucleotidesperturn.

(2)ThedensityofDNAsuggeststhatthehelixmustcontaintwopolynucleotidechains.Theconstantdiameterofthehelixcanbeexplainedifthebasesineachchainfaceinwardandarerestrictedsothatapurineisalwaysoppositeapyrimidine,avoidingpartnershipsofpurine-purine(toothick)orpyrimidine-pyrimidine(toothin).(3)TheproportionofGisalwaysthesameastheproportionofCinDNA,andtheproportionofAisalwaysthesameasthatofT.SothecompositionofanyDNAcanbedescribedbytheproportionofitsbasesthatisG+C.Thisrangesfrom26%to74%fordifferentspecies.WatsonandCrickproposedthatthetwopolynucleotidechainsinthedoublehelixassociatebyhydrogenbonding

betweenthenitrogenousbases.GcanhydrogenbondspecificallyonlywithC,whileAcanbondspecificallyonlywithT.Thesereactionsaredescribedasbasepairing,andthepairedbases(GwithC,orAwithT)aresaidtobecomplementary.Themodelrequiresthetwopolynucleotidechainstoruninoppositedirections(antiparallel).Lookingalongthehelix,therefore,onestrandrunsinthe5’→3’direction,whileitspartnerruns3’→5’.Eachbasepairisrotated~36ºaroundtheaxisofthehelixrelativetothenextbasepair.So~10basepairsmakeacompleteturnof360º.Thetwistingofthetwostrandsaroundoneanotherformsadoublehelixwithanarrowgroove(~12Åacross)andawidegroove(~22Åacross).Thedoublehelixisright-handed;theturnsrunclockwiselookingalongthehelicalaxis.ThesefeaturesrepresenttheacceptedmodelforwhatisknownastheB-formofDNA.DNA染色体3.DNA是遗传物质

(1)贮藏遗传信息的功能

(2)传递遗传信息的功能

(3)表达遗传信息的功能

由此，克里克提出中心法则,确定遗传信息由DNA通过RNA流向蛋白质的普遍规律。DNADNARNA蛋白质中心法则中心法则：遗传信息储存在DNA中，DNA通过转录生成mRNA，mRNA再通过翻译生成蛋白质，从而完成遗传信息的表达过程。二.DNA与基因基因(gene)：是一个遗传信息单位，其对应着一段编码多肽氨基酸顺序的不连续DNA片断。外显子：基因的编码序列。内含子：基因的间隔序列。大多数生物体通常由

一对遗传因子(后来称为两个等位基因)控制同一性状。这样的生物体称为2n个体。



遗传因子可以区分为显性和隐性。

控制不同性状的遗传因子是各自独立的。同源染色体分别带着控制同一性状的两个等位基因显性等位基因纯合子隐性等位基因纯合子杂合子减数分裂时发生：染色体交叉/基因重组。基因重组服从这样的规则：两个基因在染色体离得越远，重组频率越高；两个基因在染色体上离得越近，重组频率越低。重组频率

一个基因一个性状？不一定。例如肤色的控制至少有三个基因参与。

基因决定性状，环境还起不起作用？在基因型确定的基础上,环境常常会影响表型。产生黑色素的酶在较高温度下失活，所以毛色在端点位置体温较低处呈黑色环境影响表型三.基因工程技术及应用1、基因工程技术★★★

基因工程是生物技术的核心部分。基因工程的操作可以简述如下：基因工程的操作流程基因工程的操作包含以下步骤：

获得目的基因

构造重组DNA分子

转化或转染

表达

蛋白质产物的分离纯化基因工程基本技术路线★★★将外源基因(又称目的基因，是一段DNA片断)组合到载体DNA

分子中去，再把它转到受体细胞(亦称寄主细胞)中去，使外源基因在寄主细胞中增殖和表达，从而得到期望的由这个外源基因所编码的蛋白质。基因工程的基本操作：重组DNA技术的操作过程切接转增检(1)获得目的基因到哪里去找目的基因？一般来说，人的基因,要从人体的组织细胞中去找；小鼠的基因要从小鼠的组织细胞中去找。

从组织细胞中可以分离得到人/小鼠的全套基因,称为基因文库。文库中基因总数就人来说约有3万个基因。如何从中把需要的基因找出来？

采取“钓”的办法。这个办法通常称为印迹法。Southern印迹杂交(southernblot)★★★

Southernblot是研究DNA图谱的基本技术，在遗传诊断DNA图谱分析及PCR产物分析等方面有重要价值。Southern印迹杂交基本方法是将DNA标本用限制性内切酶消化后，经琼脂糖凝胶电泳分离各酶解片段，然后经碱变性(NaOH)，Tris缓冲液中和，高盐下通过毛吸作用将DNA从凝胶中转印至硝酸纤维素滤膜上，烘干(80℃烤4~6h)固定后即可用于杂交。凝胶中DNA片段的相对位置在DNA片段转移到滤膜的过程中继续保持着。附着在滤膜上的DNA与32P标记的探针杂交(杂交一般在高盐浓度和68℃下进行数小时或十几小时)，利用放射自显影术确定探针互补的每条DNA带的位置，从而可以确定在众多酶解产物中含某一特定序列的DNA片段的位置和大小。由英国分子生物学家E.M.Southern发明Southernblottingprocess内切酶切开DNA电泳分离DNA片段印迹转移与放射性探针杂交放射自显影样品(血液)中的DNA分子将变性DNA片段转移到硝酸纤维素膜上探针可以是DNA，也可以是RNA；可以用放射性同位素标记，也可以用生物素或荧光素标记。(1)基因文库－DNA用限制性内切酶处理。

(2)DNA片断混合物通过电泳分离。

(3)电泳后，通过印迹技术转到酯酰纤维薄膜上，以便操作。

(4)用已知小片断DNA作为探针，互补结合需要找的基因片断。

(5)探针DNA片断已用放射性元素标记，使胶片感光后可看出。印迹法的主要步骤：印迹法的关键是“分子杂交”：利用碱基配对的原则，用一段小的已知的DNA片断去寻找(“钓”)大的未知的基因片断。

探针DNA片断从何而来？根据目的蛋白的氨基酸序列，只要其中N－端15～20个氨基酸序列，按三联密码转为40～60核苷酸序列，人工合成，即为探针DNA片断。Northern印迹杂交和Western印迹法应用类似的方法也可用于分析RNA。即将RNA变性后转移到硝酸纤维素膜上再进行杂交。这种方法称为Northern印迹杂交。用类似的方法，根据抗原与抗体可以结合的原理，也可以分析蛋白质，这种方法称为Western印迹法。(2)目的基因的扩增用上面的方法“钓”出的目的基因，数量极少，所以，接下来必须经过扩增，亦称为基因克隆。获得相当数量的目的基因后，才能继续下一步操作。——把寻找目的基因和扩增目的基因两步操作并成一步。PCR技术★★★聚合酶链反应(PolymeraseChainReaction,PCR

)又称为PCR扩增技术，是一种高效、快速、特异性的体外DNA聚合程序。1985年，美国PE-cetus公司人类遗传研究室的Kary

mullis发明了具有划时代意义的PCR技术；1993年，Kary

mullis因发明PCR技术获得诺贝尔化学奖。PCR操作流程90

0C500C700C第一步

——90℃高温下，使混合物的DNA片断因变性而成单链。

第二步

——50℃

温度下，引物DNA结合在适于配对的DNA片断上。

第三步

——70℃温度下，由合成酶(DNA高温聚合酶)催化，从引物开始合成目的基因DNA。PCR反应分三步完成：PCR的三个步骤为一次循环，约需5～10分钟。每经一次循环，所找到的目的基因扩充一倍。经过20次循环，即可扩增

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倍，总共只需几个小时。(3)构造重组DNA分子首先要有载体。

载体有好几种，常用的有：

质粒——环状双链小分子DNA，适于做小片断基因的载体。

噬菌体DNA——线状双链DNA，适于做大片断基因的载体。用质粒构建重组DNA分子用噬菌体DNA构建重组DNA分子其次要把目的基因“装”到载体中去。“安装”的过程，需要的关键酶叫限制性内切酶。

此酶识别一定碱基序列，有的还可切出“粘性”末端，使得目的基因和载体的连接非常容易。限制性内切酶识别特定的碱基序列限制性内切酶造成粘性末端有利于重组DNA分子的构建把构造好的重组DNA分子送进寄主细胞，亦需要适当的技术方法。若受体细胞是细菌，通常称转化；若受体细胞是动/植物细胞，通常称转染。(4)转化/转染细菌的接合转化(5)目的基因表达及蛋白质分离进入到寄主细胞的目的基因还要能表达产生有活性的目的蛋白，这些目的蛋白可以是某种蛋白质药物，也可以表达某种抗性性状(如植物的抗病性和抗旱性)。蛋白质的分离纯化——生物分离技术重组DNA分子进入寄主细胞后，其中的目的基因能否表达，表达效率高低，还有很大差别。表达通常是指目的基因编码的蛋白质合成。基因工程的最后一步，是把所获得的蛋白质分离纯化，得到蛋白质产品。基因工程菌基因工程反应器2.基因工程应用(1)在医学上的应用基因工程被用于大量生产过去难以得到或几乎不可能得到的蛋白质——肽类药物。胰岛素1000磅牛胰10克胰岛素200升发酵液10克胰岛素干扰素1200升人血2－3万美元/病人

1升发酵液200－300美元/病人(2)提高奶酪产量生产奶酪的凝乳酶传统上来自哺乳小牛