第三章酶的分离纯化

2023/2/3第三章酶的分离纯化第四章酶的分离纯化及产品成型重点（2）酶的分离纯化：沉淀、离心、膜过滤、层析分离、电泳分离（4）酶纯化过程的纯度监测本章知识点：（1）细胞的破碎、酶的提取（3）酶液的浓缩、结晶、干燥、成型一、生物下游加工技术下游加工过程包括目标产物的提取、浓缩、纯化及成品化等过程。

大多数酶的回收纯化过程成本约占70%；

医用酶的生产回收过程的成本高达85%；

基因工程表达产物的回收纯化过程成本一般占85-90%以上；

青霉素回收过程成本约占50%；

乙醇的回收过程成本仅占14%。二、分离纯化的一般流程发酵液细胞分离（离心、过滤）

细胞清液细胞破碎碎片分离粗分离纯化成品化线路2线路1（胞内酶）（胞外酶）预处理发酵液预处理细胞分离细胞破碎细胞碎片分离初步分离纯化成品加工（胞外酶）

人干扰素是一种重要蛋白类生物药品，具有抗癌和治疗肝炎等作用。Yonehara等人：醋酸锌盐析离子交换层析硫酸铵盐析铜螯合层析疏水层析凝胶电泳staehelin等人：硫酸铵盐析免疫亲和层析阳离子交换层析（83.0%）（62.7%）（96.2%）（46.0%）（78.3%）（88.9%）共六步，总收率仅为16%仅三步，总收率达81.0%首先，应对被纯化的酶的理化性质有一个比较全面的了解;其次，判断采用的方法和条件是否得当，始终以活力回收率和纯化倍数为指标；再者，在纯化工作中，往往不宜重复采用相同的步骤和条件；最后，要严格控制操作条件。在实践工作中选择方法时:酶分离纯化方法离心分离、凝胶过滤、膜分离盐析沉淀、有机溶剂沉淀、共沉淀、等电点沉淀离子交换层析、电泳分离、等电聚焦选择性热变性法、选择性酸碱变性法、选择性表面变性法亲和层析、免疫电泳、免疫沉淀分离依据的性质分离方法分大小、轻重溶解度大小稳定性差异电荷性质亲和作用二、细胞破碎—只对胞内酶（1）机械破碎法（2）物理破碎法（3）化学破碎法（4）酶促破碎法超声波细胞破碎机细胞破碎珠高压细胞破碎机电动玻璃匀浆机利用机械力的搅拌，剪切或研碎细胞。组织捣碎机，细胞研磨器，匀浆器等。（一）机械破碎法1.捣碎法利用捣碎机的高速旋转叶片所产生的剪切力将组织细胞破碎。10000r/min此法在实验室和生产规模均可采用。2.研磨法利用研钵、石磨、球磨(不锈钢或玻璃珠直径0.2-1.0mm)、细菌磨等研磨器械所产生的剪切力将组织细胞破碎，必要时可加入精制石英砂、玻璃粉、氧化铝等作为助磨剂。此法效率较低3.匀浆法利用匀浆器所产生的剪切力将组织细胞破碎。匀浆器一般由硬质磨砂玻璃制成，也可由硬质塑料可不锈钢等制成。通常用来破碎那些易于分散，比较柔软，颗粒细小的组织细胞。此法细胞破碎程度较高，对酶的破坏也较少，但难于在工业生产上应用。高压匀浆器细胞悬浮液加工后的细胞匀浆阀座碰撞环阀杠珠磨机通过温度，压力，声波等各种物理因素的作用，将组织细胞破碎的方法。冻融法、压差法、超声波法。（二）物理破碎法通过温度的突然变化使细胞破碎。例如将冷冻的细胞突然放进较高温度的水中，或将较高温度中的细胞突然冷冻都可使细胞破坏。此法对较脆弱的细胞效果较好。但难以应用于工业化生产。通过压力的变化使细胞破碎。常用的有高压冲击、突然降压和渗透压差法等。（1）高压冲击法是在结实的容器中装入菌体细胞和冰晶、石英砂等混合物，用活塞或冲击锤加高压冲击之，使细胞破碎。冲击压力可达每平方厘米几百至几千kg。压力差破碎法（2）突然降压法是将菌体装进高压容器中，加压至30MPa以上，打开出口阀，使菌体悬浮液经阀门流出，出口处压力突然降为常压，由于膨胀而使细胞破碎。突然降压法的另一种形式为爆破性减压法是将菌体悬浮在高压容器中，用氮气或二氧化碳加压到几十至几百大气压，振荡几分钟，使气体扩散到细胞内，然后突然排出气体，压力骤降，使细胞破碎。压力差破碎法（3）渗透压差法是利用渗透压的变化而使细胞破碎。应用时先将对数生长期的细胞从培养液中分离出来，再悬浮在20%左右的蔗糖溶液中平衡一段时间，然后离心收集细胞，迅速投入4℃左右的蒸馏水或低渗溶液中。由于细胞外渗透压突然降低，而使细胞破碎，将细胞中的酶等物质释出胞外。此法适用于膜结合的酶、细胞间质酶等的提取。可用于从海洋微生物中提取某些酶。但对G+菌不适用。通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞破碎的方法。有机溶剂：如甲苯，丙酮，丁醇，氯仿等。

非离子型表面活性剂：吐温、催通等。（三）化学破碎法（1）有机溶剂处理有机溶剂可使细胞膜的磷脂结构破坏，从而改变细胞膜的透过性，再经提取可使膜结合酶或胞内酶等释出胞外。常用的有机溶剂：甲苯、丙酮、丁醇、氯仿等。（2）表面活性剂处理表面活性剂可以和细胞膜中的磷脂及脂蛋白相互作用，使细胞结构破坏，增加膜的透过性。在酶的提取方面一般采用非离子型的Triton、Tween等表面活性剂。表面活性剂处理对膜结合酶的提取特别有效，在实验室和生产中均已成功使用。微生物种类酶细菌酵母霉菌植物细胞（四）酶促破碎法（1）自溶法（自身酶）（2）酶处理（外加酶）溶菌酶β-葡聚糖酶几丁质酶纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶机械破碎捣碎法研磨法匀浆法物理破碎温度差破碎法压力差破碎法超声波破碎法化学破碎有机溶剂表面活性剂酶促破碎自溶法外加酶法通过机械运动产生的剪切力，使组织、细胞破碎。通过各种物理因素的作用，使组织、细胞的外层结构破坏，而使细胞破碎。通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞破碎通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏细胞破碎方法及其原理三、酶的提取

指在一定的条件下，用适当的溶剂处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂中的过程，又称抽提。原料溶剂酶（一）提取方法

四稀：稀盐、稀酸、稀碱、稀有机溶剂，水。提取方法提取对象

稀盐溶液

稀酸溶液

稀碱溶液

稀有机溶剂在低浓度盐溶液中溶解度较大的酶在稀酸溶液中溶解度大且稳定的酶在稀碱溶液中溶解度大且稳定的酶与脂质结合牢固或含较多非极性基团的酶（二）提取过程中的注意事项不超出酶的酸碱稳定范围；最好远离待提取酶的等电点。0~10℃左右，尤其是采用有机溶剂提取时。3、提取液体积（用量）：

为含酶原料体积的2~5倍。可一次抽提，也可分几次反复抽提。提高酶的稳定性。1、pH值：2、温度：4、加保护剂：第二节酶的沉淀分离、离心和膜过滤技术盐析沉淀法√有机溶剂沉淀法等电点沉淀法聚乙二醇沉淀法复合物沉淀法一、沉淀分离法（一）盐析沉淀法常用中性盐：（NH4）2SO4

优点：①溶解度大，温度系数小；②价廉易得；③可保护酶。在盐浓度达到某一界限后，酶的溶解度随盐浓度升高而降低，这称为盐析现象。

在一定的温度和pH值条件下（β为常数），通过改变离子强度使不同的酶或蛋白质分离的方法称为Ks分段盐析；而在一定的盐和离子强度的条件下（KsI为常数），通过改变温度和pH值，使不同的酶或蛋白质分离的方法，称为β分段盐析。由于硫酸铵在水中的溶解度大而且温度系数小，不影响酶的活性，分离效果好，而且价廉易得。2、为了得到较好的盐析效果，应控制下列因素：（1）不同酶，盐析时所需的盐浓度各不相同。（2）加盐操作时，防止局部盐浓度过高，防止产生泡沫。（3）pH值和温度：等电点附近，室温或低温操作。（5）脱盐：超滤、透析或层析。（4）蛋白质浓度：一般控制在2.5~3.0%为宜。（二）有机溶剂沉淀法1、作用原理

①去水膜；②降低介电常数；③破坏氢键。2、操作注意

低沸点，易燃易爆；低温操作，沉淀析出后要尽快分离。（三）等电点沉淀1、原理2、实际操作

与其他方法一起使用（盐析、有机溶剂沉淀、复合沉淀）。单独使用时，主要是用于从粗酶液中除去某些等电点相距较大的杂蛋白。3、注意加酸碱调节pH值时，防止局部酸碱过高。（四）选择性变性沉淀法1、热变性法：根据目的酶与杂蛋白热稳定性差异，可以在较高温度下，使杂蛋白变性沉淀，而酶则保持可溶状态。2、酸碱变性法：目的酶与杂蛋白的酸碱稳定性不同，可以调整pH使杂蛋白变性沉淀。

选择一定的条件使酶液中存在的某些蛋白质等杂质变性沉淀，而不影响所需的酶。二、膜分离技术在酶分离纯化中的应用

借助于一定孔径的半透膜，将不同大小、不同形状和不同特性的物质颗粒或分子进行分离的技术。二、膜分离技术在酶分离纯化中的应用

膜分离技术已被国际上公认为20世纪末至21世纪中期最有发展前途，甚至会导致一次工业革命的重大生产技术，所以可以称为前沿技术，是世界各国研究的热点。广泛应用于生物工程、化学、制药、饮料、电力、冶金、海水淡化、资源再生等领域。渗出液膜分离技术的地位和影响美国官方文件曾说“18世纪电器改变了整个工业进程，而20世纪膜技术将改变整个面貌”，“目前没有一种技术，能像膜技术这么广泛地被应用”日本和欧洲则把膜技术作为21世纪的基盘技术进行研究和开发。“谁掌握了膜技术，谁就掌握了化学工业的未来”-NormanN.Li，美国科学院院士，著名华裔科学家。膜分离已得到广泛应用。21世纪是工业生物技术的世纪，膜技术将扮演重要角色。（一）膜分离的类型渗透（Osmosis）透析（Dialysis）微滤（Microfiltration）超滤（Ultrafiltration）纳滤（Nanofiltration

）反渗透（ReverseOsmosis）1、按推动力不同：（2）压力差膜分离：（3）电位差膜分离：（1）扩散膜分离：电渗析（Electrodialysis）2、按膜孔径或截留物质的大小：微滤——超滤——纳滤、电渗析、透析——

反渗透膜孔径大小病毒生物大分子生物小分子盐类水灰尘细菌病毒生物大分子生物小分子盐类水灰尘细菌病毒生物大分子生物小分子盐类水灰尘细菌病毒生物大分子生物小分子盐类水膜微滤（MF）超滤（UF）纳滤（NF）反渗透滤（RO）灰尘细菌（0.2-2um）（10-200nm）（＜2nm）（2-10nm）各种膜分离法的原理和应用范围膜分离法截留的颗粒大小截留的主要物质过滤介质应用举例微滤（MF）0.2~2um灰尘、细菌微孔滤膜除菌，回收菌超滤（UF）10nm~200nm生物大分子及以上超滤膜蛋白质、多肽和多糖的回收和浓缩纳滤（NF）2nm~10nm生物小分子及以上纳滤膜脱盐、浓缩反渗透（RO）<2nm盐类及以上反渗透膜盐、氨基酸、糖的浓缩、淡水制造三、离心技术在酶分离纯化中的应用

离心是借助于离心机旋转所产生的离心力，使不同大小和不同密度的物质分开的技术。（一）基本原理离心力：Fc=mac=mω2r

rminrmeanrmax轴心离心管式中：Fc—离心力；

m—为物质质量(g)；

ac—为离心加速度(m/s2)；

r—离心管中受力粒子到离心机轴心的垂直距离相对离心力（relativecentrifugationforce，RCF）：=1.12×10-5n2r（g）（r取厘米，g为980厘米/秒2）工业上:相对离心力→离心分离因素

r取米，则：

RCF=1900n2r（g）（二）离心机分类冷冻系统、离心管帽冷冻系统、离心管帽、真空系统800025000低速离心机高速离心机超速离心机分离细胞、细胞碎片、培养基残渣及粗结晶等较大颗粒。分离各种沉淀物、细胞碎片及较大的细胞器等。制备用：分离纯化生物大分子、细胞器和病毒等。分析用：测定样品纯度、沉降系数、相对分子量。转速(r/min)（三）离心方法沉降速度法沉降平衡法差速离心密度梯度离心等密度梯度离心密度相近而大小不同密度差别较大（补充）中小大1、差速离心

采用不同的离心速度和离心时间，使不同沉降速度的颗粒先后分离的方法。应用范围：大小和密度有较大差别的颗粒。2、密度梯度离心

在离心管中用5~60%的蔗糖溶液，形成由管底到液面逐渐降低的梯度，将样品放在密度梯度溶液的表面，经过离心，沉降系数比较接近的颗粒在密度梯度溶液中形成若干条不连续的区带。梯度介质：蔗糖密度梯度系统样品蔗糖密度梯度沉淀慢的组分沉淀快的组分介质的最大密度＜样品组分的最小密度3、等密度梯度离心

当欲分离的不同颗粒的密度范围处于离心介质的密度范围时，在离心力的作用下，不同浮力密度的颗粒一直移动到与它们各自的浮力密度恰好相等的位置，形成区带。常用的离心介质：铯盐，如CsCl，Cs2SO4，CsBr样品密度梯度低密度组分高密度组分超速离心机按照其用途可以分为制备用超速离心机、分析用超速离心机和分析-制备两用超速离心机3种蛋白质分子在离心時，其分子量、分子密度、组成、形状等，均会影响其沉降速率，沉降系数即用來描述此沉降性质,其单位为S。每一种的沉降系数与其分子密度或分子量成正比。不同沉降系数的蛋白质，可利用超高速离心法，在密度梯度中作分離。密度梯度的制备：密度梯度混合器（四）离心沉降速度和沉降系数沉降速度（v）：离心管中的粒子在离心力场作用下，向垂直于转轴方向移动的速度。v

=drdt=S·ω2rS=dr/dtω2rS为沉降系数，单位：秒

许多大分子和超分子复合物（如核糖体等）的沉降系数，都在10-13秒这个数量级，将定为1S。（五）离心时间差速离心密度梯度离心等密度梯度离心离心时间表示方法：①沉降时间、②区带形成时间、③平衡时间离心时间表示方法：①沉降时间、②区带形成时间、③平衡时间1dt=

ω2Sdrr·t2–t1=1ω2S（lnr2-lnr1）积分得：

根据所用的离心机，确定了沉降开始的离心半径r1和预定终止的r2，又确定了离心时的转速，对某一具体的颗粒，其沉降系数S也是定值，就可计算出离心所需时间（t2-t1）。第三节层析技术在酶分离纯化中的应用（一）色谱法基本操作过程（二）吸附色谱（三）离子交换色谱（四）凝胶过滤色谱（五）亲和色谱√√√一、色谱分离法

色谱法是1905年俄国植物学家茨维特发明的。他将植物色素的石油醚提取液倒入一根装有碳酸钙的玻璃管顶端，用石油醚淋洗玻璃管，使色素出现分离，在管内显示出不同的色带，色谱一词由此得名。碳酸钙（固定相）石油醚（流动相）色谱柱二、色谱法分类1、根据流动相状态不同分液相色谱气相色谱常压液相色谱√高压液相色谱2、根据支持介质不同分柱色谱√纸色谱薄层色谱毛细管色谱3、根据分离原理不同分吸附层析：吸附力不同离子交换层析：离子交换能力的不同凝胶过滤层析：相对分子质量不同亲和层析：专一而又可逆的亲和力三、基本操作过程层析柱的准备固定相材料的准备装柱平衡上样（洗涤和）洗脱收集洗脱液洗脱液检测，绘制洗脱曲线（柱再生）下一轮上样四、几种层析分离方法（一）吸附层析

利用物理吸附剂对不同物质吸附能力的不同而使混合液中各组分分离的方法。1、原理2、吸附剂的种类和特点（1）种类：活性氧化铝、硅胶、硅藻土、碳酸盐、活性碳、陶土、纤维素等。①来源丰富、价廉、可再生、吸附设备简单。②使用前要预处理，以除去杂质，提高吸附力，增强分离效果。③上样：低pH值和低离子强度，洗脱：提高pH值和离子强度。3、吸附的三个基本环节：加样、吸附、洗涤和洗脱。（2）特点：（二）离子交换层析1、原理

利用离子交换剂上的带电基团（活性基团）对各种离子亲和力不同而达到分离目的的一种分离方法。2、什么是离子交换剂?+++---母体带电基团带电基团母体离子交换树脂：交换容量不大，易使酶失活离子交换纤维素：最广泛的一类离子交换凝胶：不耐高流速洗脱+++---阳离子交换剂：能吸附带“+”的离子或酶-CM-（羧甲基）-PO32-（磷酸基）-SO3-（磺酸基）阴离子交换剂：能吸附带“-”的离子或酶

-DEAE（二乙基氨基乙基）-TEAE（三乙基氨基乙基）3、离子交换反应

蛋白质/酶在不同的pH条件下，将发生不同的离解作用，而带不同的电荷，选择相应的离子交换剂，同时要考虑被分离酶的稳定性。4、操作要点（1）离子交换剂的预处理：浸泡吸胀，再用HCl和

NaOH交换处理，离子交换树脂和凝胶用2~3倍于树脂体积的2mol/L，离子交换纤维素用0.5mol/L酸、碱处理。（2）装柱：湿法装柱，离子交换剂上样前抽气泡。（3）平衡、加样：1%~5%上样量。（4）洗脱、收集：

梯级洗脱（分时段改变洗脱液的pH或盐离子强度）梯度洗脱（连续改变pH或盐离子强度）（5）再生：离子交换剂要再生，和预处理程序相同。（三)凝胶过滤层析1、原理

利用各组分分子量大小不同，从而在凝胶网孔中流速不同达到分离的目的。（1）混合物上柱;（2）洗脱开始，小分子进入凝胶内，大分子则被排阻于外;（3）小分子滞留，大分子向下移动，大小分子开始分开;（4）大小分子完全分开;（5）大分子行程较短，已洗脱出，小分子尚在行进中。2、凝胶层析测定蛋白质（酶）的相对分子质量

不同分子之间的分离，是它们在内水和外水之间的一种分配行为，流出柱的先后，用分配系数Kd作定量描述：Kd

=（Ve-Vo）/ViVe——洗脱体积，指从洗脱开始到某一组分流出峰值时所用洗脱液体积Vo——外水体积，柱床中凝胶颗粒之间的空隙体积Vi——内水体积，凝胶颗粒内部空隙体积的总和当Ka=0时，Ve=Vo，全排出的大分子当Ka=1时，Ve=Vo+Vi，是全受阻的小分子或无机离子Ka=0~1时，其他大小介于两者之间的分子Kd

=（Ve-Vo）/ViVe——洗脱体积，指从洗脱开始到某一组分流出峰值时所用洗脱液体积Vo——外水体积，柱床中凝胶颗粒之间的空隙体积Vi——内水体积，凝胶颗粒内部空隙体积的总和Ve——洗脱体积，指从洗脱开始到某一组分流出峰值时所用洗脱液体积Vo——外水体积，柱床中凝胶颗粒之间的空隙体积Vi——内水体积，凝胶颗粒内部空隙体积的总和Ka值最小的，最先流出；Ka值最大的，最后流出。同一个凝胶床，内水体积和外水体积（Vo和Vi）为定值，因而洗脱体积（Ve）小的，就是相对分子质量大的。Ka

=Ve-VoViVe

=-blgMr+c

Mr—相对分子质量蛋白质分子量与凝胶层析洗脱体积的关系VelgMr····

用一组已知相对分子质量的蛋白质进行实验，作出上图，然后对未知相对分子质量的蛋白质（酶）在同一凝胶柱上实验，测得Ve，就可以查标准曲线算出它的相对分子质量。3、常用的凝胶种类（1）葡聚糖凝胶SephadexG-X

X—表示每克干胶的吸水值的10倍吸水值越大，分离范围(分子量)越大（2）琼脂糖凝胶

Sepharose2B、4B、6B

2B、4B、6B表示琼脂糖含量为2%、4%、6%，浓度越高，凝胶网眼孔径越小，分部的大分子相对分子质量越小，范围越窄。

琼脂糖分部的相对分子质量范围较葡聚糖宽广，上限达108，故适用于分离相对分子质量大的蛋白（酶）。（3）聚丙烯酰胺糖凝胶（PAG）Bio-GelP-2、4、6、…….、200、300，共10种型号。P后的数字表示分离的最大相对分子质量（×103）。4、操作要点（1）装柱：装柱前要吸胀和抽气。常温吸胀需较长时间，可加热溶胀。（2）上样：加样量不超过3%。（3）洗脱：洗脱液应与平衡时的溶液一致。（4）再生：无须经过再生处理。（5）长期不用时，可加0.02%的NaN3保存。（四)亲和层析1、原理

生物分子对间的专一而又可逆的结合力，称为亲和力，利用这种亲和专一性的特点，而制备专门的亲和吸附剂，用其进行蛋白质等生物分子的层析纯化，就是亲和层析，效率特别高。

酶—底物（包括酶的竞争性抑制剂和辅因子）抗原—抗体激素—受体

DNA—互补的DNA或RNA

凝集素和糖蛋白载体配体臂待分离组分亲和吸附洗涤洗脱再生杂蛋白目的酶

亲和分离原理示意图2、亲和吸附剂由母体与配体偶联而成。配基：作为固定相的分子对的一方。母体：又称载体，如各种凝胶、纤维素均是惰性物，须先活化后再与配基反应。臂：如果载体与配基间的距离太近，往往需要加臂。载体配体臂亲和吸附剂3、操作要点（1）要先洗涤后洗脱，用含有与亲和吸附剂相同的高浓度配基或另一种配基洗脱。（2）柱床要再生

10倍于柱床体积的0.1mol/LNaCl-0.1mol/LTris-HCl洗至pH8.5，改用0.5mol/LNaCl-0.1mol/LHAC洗至pH4.5，然后用纯水洗至中性。亲和层析法纯化胰蛋白酶

鸡蛋清

Sepharose4B

猪胰脏

↓↓↓提取↓活化

提取分离纯化↓↓↓纯卵粘蛋白(CHOM)→←活化Sepharose4B

胰蛋白酶原粗提液↓↓

偶联

激活↓↓

CHOM-Sepharose4B→←胰蛋白酶提取液↓

亲和层析↓纯胰蛋白酶环氧氯丙烷活化载体活化偶联亲和结合洗脱吸附层析离子交换层析凝胶层析亲和层析固定相操作步骤特殊点洗脱特点应用物理吸附剂，如活性氧化铝、磷酸钙胶体等离子交换凝胶离子交换纤维素离子交换树脂葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶（凝胶网孔内水为固定相）用琼脂糖或纤维素为载体共价结合适当的配基而成亲和吸附剂无纤维素和凝胶类交换剂装柱时先抽气，柱床要再生后再上样湿凝胶抽气后湿法装柱上样后先洗涤除杂质，然后洗脱，柱床要再生洗脱液含酶的配基或其他物质用样品和平衡缓冲液洗脱常用pH梯度或盐浓度梯度洗脱洗脱液离子强度比样品液高酶分离纯化成本较低离子交换纤维素洗脱条件较温和，酶分离纯化多用广泛用于酶分离纯化、脱盐、测定相对分子质量酶纯化效率高，但制备亲和吸附剂较麻烦，贵第四节电泳技术在酶分离纯化中的应用第四节电泳技术在酶分离纯化中的应用一、电泳的基本原理二、聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）三、等电聚焦电泳√

带电颗粒在电场的作用下，向着与其电性相反的电极方向移动，称之为电泳(electrophoresis，简称EP)。电泳的定义：

电泳技术：是根据各种带电粒子在电场中迁移速度的不同而对物质进行分离。带电粒子在电场中迁移的速度：A、α—常数r—粒子的半径Q—粒子的表面电荷量η—介质的粘度E—电场强度μ—介质的离子强度一、电泳的基本原理（1）电场强度（电压）（2）带电粒子表面电荷（3）带电粒子大小（4）介质的粘度（5）溶液的离子强度（6）电渗的影响，公式中没有反映，主要在纸电泳时表现较明显。此式表明：影响电泳时带电粒子迁移速度的因素，包括：因此，不同的分子可以由Q和r不同而彼此分离。在一定的电泳条件下，E、η、μ为定值。电泳时的迁移速度差别取决于：分子的表面电荷多少和分子大小。取决于PI与溶液的pH值的关系。电泳的分类：纸电泳薄层电泳薄膜电泳凝胶电泳等电点聚焦电泳根据支持体分类:√1、聚丙烯酰胺凝胶（PAG）

丙烯酰胺：arc，单体甲叉双丙烯酰胺：bis，双体，arc浓度：凝胶的孔径大小arc和bis的比例：凝胶的强度催化剂用量：聚合时间二、聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）交联剂PAGE的应用类型浓度梯度PAGESDS不连续PAGE

用于一般分析分离纯化

用于测定Pr相对分子质量和分离纯化

用于测定Pr单体相对分子质量和双向电泳2、不连续PAGE的特性和分离Pr的效应（1）三个不连续凝胶浓度不连续；pH值不连续；缓冲液不连续。

（2）三种效应浓缩效应；电荷效应；分子筛效应。用梯度混合仪制成从上至下4%~30%的均匀浓度梯度凝胶。其网眼孔径从上至下越来越小。电泳时，不同Pr主要依r大小而分离，即分子筛效应>电荷效应。可用于测定蛋白质的相对分子质量。3、浓度梯度PAGE4、SDSSDS：十二烷基硫酸钠

CH3（CH2）11SO4Na2在配制凝胶时加入SDS，同时加巯基乙醇。Pr在电泳时，其中的寡聚体Pr解聚为单体（亚基）。SDS分子将每个单体分子表面覆盖起来，使其形成短轴为1.8nm，而长轴各异的SDS—亚基复合物，电泳时，他们的表面电荷基本相同。故可因分子长轴大小（即亚基分子大小）差别而分离，换言之，亚基的大小是彼此分离的依据。所以此法可用于测定单体的相对分子质量。SDS测定蛋白质（亚基）的相对分子质量（Mr）与它们的电泳迁移率（U）之间，存在如下关系：lgMr=lgK-bU

用lgMr对U作图，只要实验测得U

，就可用标准曲线法求得未知蛋白质（亚基）的相对分子质量。mR=蛋白质移动的距离溴酚蓝移动的距离实际工作中，常用相对迁移率（用mR

表示）代替U作图。

三、等电点聚焦电泳（IsoelectricFocusing，IEF）

等电点聚焦电泳是在电泳介质中加入两性离子载体，电泳时形成由阳极到阴极的连续递增的pH梯度，蛋白质按其电荷性质不同各自向着与其等电点相等的pH处移动聚焦，从而彼此分离的电泳技术，无论Pr从正极出发或是从负极出发，都会聚焦在等电点处。低pH等电聚焦电泳进行过程中高pH（＋）（＋）低pH等电聚焦电泳结束后高pH（－）（－）1、等电点聚焦电泳分离Pr原理2、两性离子载体

各组分的pI值十分接近，在电泳中可以形成连续的pH梯度，常用的商品名为Ampholine，规格有pH3.5~9.0和精细分级的pH3.5~5、5~9、9~11的多种商品可供不同的要求使用。

由于其分辨率可达0.01pH单位，因此特别适合于分离分子量相近而等电点不同的蛋白质组分。

液体介质3、支持pH梯度的介质两性电解质载体在蔗糖密度梯度柱中形成pH梯度。凝胶介质两性电解质载体在凝胶内形成pH梯度。凝胶中加有两性电解质溶液（pH9-3）

加电场后在凝胶内形成一个稳定pH梯度

加样品，然后继续电泳凝胶染色表明样品按照各自pI值沿着pH梯度分布第五节酶液的浓缩、结晶、干燥与成型浓缩：是从稀溶液中除去一部分溶剂（水），使其变成浓缩液的工艺。工业上处理大量物料：低温真空蒸发、薄膜蒸发和超滤。一、稀酶液的浓缩(1)低温真空蒸发(2)薄膜蒸发(3)超滤浓缩1、结晶的一般原理不饱和溶液饱和溶液过饱和溶液析出沉淀（快）析出结晶（慢）（无排列排队机会）

结晶是指控制适当的条件，使溶液中的溶质以晶体形态从溶液中析出的工艺过程。二、结晶第一步：形成过饱和溶液稍微越过饱和状态，处于介稳态，浓缩、降温、调节pH至pI，可使溶液趋于过饱和。第二步：形成晶核过饱和溶液在一定条件下可形成极微小的有序排列的固相物，成为后续晶体生长的核心，称为晶核。第三步：晶体生长溶质在晶核周边不断有序排列，晶体逐步长大。2、结晶“三步曲”3、结晶条件（1）酶的纯度——一般酶纯度应达到50%以上。（2）酶蛋白的浓度——对大多数酶来说，蛋白质浓度在3~50mg/mL

较好。（3）晶种——有些不易结晶的酶，需加入微量的晶种才能形成结晶。（4）温度——一般控制在0~4℃范围内。（5）pH值——一般选择在被结晶酶的pI