刘东文毕业答辩

离子束辐照诱变细菌纤维素生产菌株研究陕西科技大学学生：刘东文指导老师：张雯专业：制药工程学号：201004040207毕业答辩研究背景细菌纤维素（BacterialCellulose,BC）BC的独特性质BC生产菌株—木醋杆菌离子束辐照诱变的优势目的及意义研究内容离子束辐照诱变条件的确定筛选体系的建立菌株的诱变突变菌株的筛选突变菌株的遗传稳定性研究突变菌株的材料学特性研究壹离子束辐照诱变条件的确定菌体细胞的收集

5mL种子液固体培养基平板上30℃静态培养24h菌膜移取至装有10mL无菌水和玻璃珠的100mL三角瓶振荡培养箱（200r/min，30℃）中振荡培养1h使菌体细胞充分混匀菌膜移取至装有10mL无菌水和玻璃珠的100mL三角瓶离子束辐照诱变条件的确定“1”代表只抽真空的菌株的固体培养基平板；“7”代表离子注入剂量为32×1014N+/cm2的菌株的固体培养基平板；“9”代表离子注入剂量为47×1014N+/cm2的菌株的固体培养基平板；“11”代表离子注入剂量为67×1014N+/cm2的菌株的固体培养基平板；“12”代表离子注入剂量为70×1014N+/cm2的菌株的固体培养基平板。离子束辐照诱变条件的确定选择41×1014N+/cm2

的剂量进行辐照诱变。贰固体培养基平板-96孔板-试管筛选体系的建立筛选体系的建立根据观察固体培养基平板上的菌落特征来进行固体培养基平板初筛；所以选用96孔板进行初次复筛；为了得到更准确的结果，要对菌株产品进行检测，所以用试管进行二次复筛。叁菌株的诱变菌株的诱变操作台真空室真空泵肆突变菌株的筛选突变菌株的筛选固体培养基平板初筛96孔板复筛试管复筛固体培养基平板初筛固体培养基平板初筛将固体培养基平板上菌落筛入96孔板。第1列是对照菌株，第2、3、4、5、6、7列是选取颜色较为发白且菌落生长迅速的菌落，第8、9、10、11、12列是选取表面水润光滑的菌落。96孔板复筛96孔板复筛

因为细菌纤维素膜是木醋杆菌的初级代谢产物，所以根据膜的生长快慢及膜的基本形态可以做出筛选。根据所建立的固体培养基平板-96孔板-试管筛选体系，得到96孔板初次复筛所选出的50株菌株为：2G、3D、4F、6C、8D、5E、1B、6A、4E、11G、7H、3A、6G、5A、11E、10B、2D、2E、5D、10A、8G、1E、5G、6D、9B、7B、11C、8B、10G、10C、6F、3G、1G、4A、5F、8E、3E、6E、11F、8F、9A、5C、3H、11D、9H、4B、2C、2B、1D、7A.试管复筛从左到右四张图片依次代表“菌株4E”、“菌株5E”、“菌株11E”和“菌株2G”试管复筛时的BC膜生长状态，试管后面试管架上为其余菌株试样。试管复筛以产量为先决筛选条件，选取2D、2E、3D、4E、5A、5D、5E、5G、11E作为优良变异菌株，以1B、1G作为对照菌株。试管复筛

2D产量提高303.3%，持水率提高8.37%，2E产量提高201.1%，持水率提高7.9%，3D产量提高125.4%，持水率提高12.2%，4E产量提高138.1%，持水率提高10.42%，5A产量提高87.3%，持水率提高8.89%，5D产量提高334.9%，持水率提高7.59%，5E产量提高141.2%，持水率提高10.6%，5G产量提高306%，持水率提高4.87%，11E产量提高112.7%，持水率提高8.61%。伍突变菌株的遗传稳定性研究突变菌株的遗传稳定性研究标号产量/g·L-1提高百分比持水率持水率提高百分比复水率复水率提高百分比1B1.013-1.33%94.81%0.00%89.59%0.00%1G1.0270.00%95.12%0.33%89.23%-0.40%2D1.66061.64%94.58%-0.25%79.42%-11.35%2E2.227116.81%95.25%0.46%82.96%-7.40%3D1.62057.74%96.16%1.42%84.32%-5.88%4E1.94088.90%94.63%-0.19%84.76%-5.39%5A2.973189.52%93.02%-1.89%85.75%-4.29%5D3.473238.20%95.88%1.13%89.64%0.06%5E2.987190.81%93.02%-1.89%84.97%-5.16%5G1.81376.57%95.57%0.80%89.70%0.12%11E3.220213.53%92.50%-2.44%79.71%-11.03%突变菌株的遗传稳定性研究标号产量/g·L-1提高百分比产量持水率持水率提高百分比复水率复水率提高百分比1G0.470%96.67%0%94.74%0%2D1.7373.33%94.05%0.65%77.39%-12.77%2E2.07107.33%95.35%2.04%84.53%-4.72%3D1.6060.00%95.99%2.72%84.83%-4.38%4E2.27126.67%91.97%-1.58%81.91%-7.67%5A2.85184.67%92.23%-1.30%85.57%-3.54%5D3.47246.67%95.77%2.48%90.10%1.55%5E3.20220.00%91.95%-1.61%85.59%-3.53%5G1.8786.67%95.31%1.99%89.35%0.71%11E3.67266.67%89.59%-4.13%77.73%-12.38%突变菌株的遗传稳定性研究标号产量/g·L-1提高百分比产量持水率持水率提高百分比复水率复水率提高百分比1G0.53-46.67%96.21%0%93.98%2D1.7979.33%93.85%0.43%77.01%-13.20%2E2.74174.00%93.93%0.51%80.52%-9.24%3D1.6060.00%96.06%2.79%84.92%-4.27%4E2.27126.67%92.16%-1.38%81.91%-7.67%5A2.85184.67%92.23%-1.30%85.53%-3.60%5D3.47246.67%95.85%2.56%90.13%1.59%5E3.13213.33%92.26%-1.28%85.89%-3.19%5G1.9393.33%95.14%1.81%89.02%0.33%11E3.47246.67%90.22%-3.46%78.95%-11.02%突变菌株的遗传稳定性研究

实验结果表明，遗传稳定性较差的菌株是2E，产量第一代为2.07g/L，第二代产量为2.27g/L，第三代产量为2.74g/L.其他菌株遗传稳定性良好，如5A、5D、5E，从产量上来分析：5A基本上维持在2.85g/L,5D产量基本上维持在3.47g/L左右，5E基本上维持在3.15g/L左右。所以，除了菌株2E,总体遗传较为稳定。陆突变菌株的材料学特性研究电镜扫描菌株1B发酵生产BC膜SEM图谱

菌株5D发酵生产BC膜SEM图谱

电镜扫描菌株3D发酵生产BC膜SEM图谱

菌株5G发酵生产BC膜SEM图谱电镜扫描

相比于对照菌株1B,韧性优良的菌株5D表面致密，截面纤维较粗；持水性能较好的菌株3D结构相对松散，纤维比较纤细；复水性能优良的5G表面结构致密，但从截面观察，纤维层之间比较松散。结论菌体细胞的收集及菌体细胞浓度的确定为离子束辐照诱变提供了的前提条件；确定了最佳诱变剂量41×1014N+/cm2；建立了固体培养基平板—96孔板—试管筛选体系，最终筛选到9株目标突变菌株；除了菌株2E,总体遗传较为稳定。