实验一融合蛋白表达载体构建的设计与质粒提取与分析

实验一融合蛋白表达载体构建的设计与质粒提取与分析第一页，共六十二页，2022年，8月28日三、细胞转化感受态细胞的制备及转化（CaCl2法，提前过夜摇菌）四、重组质粒的鉴定（PCR法）提前转板过夜PCR原理，反应条件及PCR引物设计（软件操作）重组转化子的鉴定——PCR法（介绍Crackinggel等方法）重组转化者的保存（-70℃）五、体外重组蛋白表达及分析提前IPTG诱导SDS胶Brandford蛋白定量分析蛋白纯化及活性测定第二页，共六十二页，2022年，8月28日六、总RNA的提取及测定组织总RNA的提取，变性胶鉴定讲解RT-PCR七、基因组DNA的提取及鉴定基因组DNA的提取及鉴定基因组和cDNAPCR，基因结构分析八、基因的蛋白水平表达检测（Westernblot）Westernblot基因组DNA酶切胶检测总复习，总结第三页，共六十二页，2022年，8月28日实验一、融合蛋白表达载体构建的设计与质粒提取分析第一部分：分子实验相关知识PartI：实验课有关要求及注意事项PartII：分子生物学实验有关基础操作PartIII：基因克隆的原理PartIV：蛋白表达载体的构建第二部分：质粒DNA的提取及定量分析PartI：质粒DNA提取的原理PartII：方法步骤PartIII：结果与分析第四页，共六十二页，2022年，8月28日分子生物学实验室一般安全知识

不能在实验室吸烟，或吃喝东西。当使用危险或潜在危险物质时，请穿上工作服，戴上手套，保护眼镜和口罩。请记住，使用EB，酚等危险物质时，必须戴手套，并且应该经常水洗手套的外围，以免污染仪器等。当你离开实验室时，务必脱掉手套方可离去。使用同位素及酚时，建议戴两层手套。废物的处理：废液，强酸及强碱（须稀释）等液体可以倒入水槽，并放水冲走。废纸等固体废物应倒入垃圾桶。废弃的微生物以及培养它们的朔料枪头及管必须倒在指定桶内以备消毒，培养基以及盛其容器必须高压消毒后方可作普通物品处理。同位素实验的废液及物品，则分别倒在同位素室里指定的容器里。EB胶倒在指定桶内。酚及氯仿及盛它们的管分别倒在化学通风厨内的容器内。破碎的玻璃制品必须倒在特定的桶内。第五页，共六十二页，2022年，8月28日当你使用紫外分析仪时，应戴上防紫外线的眼镜。如果用它来切胶，请戴上面罩。同位素实验必须在同位素室进行。不得随意将同位素室里的任何仪器搬出来。完成同位素实验后，必须用仪器测定所用物品，桌面及手套等，肯定没有污染后方可离开同位素室。如果洒了化学，生物等危险物质，把那区域作一记号，并马上汇报老师，作相应的处理。一般的药品溅出，应马上用吸水纸清洁干净。如化学物品溅到皮肤等，应马上用水冲洗。如轻微割伤并没感染的话，可用红十字药盒里的止血贴，否则，马上送医院。任何事故应马上报告老师。第六页，共六十二页，2022年，8月28日量程：0.5～10μl(读数窗显示0.5～10.0,精度为0.1μl)5～50μl(读数窗显示5.0～50.0,精度为0.5μl)20～200μl(读数窗显示20～200,精度为1μl)100～1000μl(读数窗显示100～1000,精度为5μl)第七页，共六十二页，2022年，8月28日安装吸头使用量程配套的吸头将枪嘴垂直插入吸头盒的吸头上轻轻用力向下压，同时把手中的移液器按顺时针方向旋转180°，使吸头紧紧地扣在枪嘴上。第八页，共六十二页，2022年，8月28日移液操作一手拿住枪，另一手旋转转来设置你所要的容量。把合适的枪头插入枪的末端，并轻微旋转一下。把活动杆压下一档。这让枪定下你所要的容量。把枪头直伸入液体约2-5mm深处。如果深入过深，

将使枪头的外围粘上液体而导致取液的误差。让活动杆慢慢地回到原始位置。否者，过快产生的

气雾将污染枪管和你的溶液。让枪头在液中停一会，以便使液体完全进入枪头。如果枪头从液中移开太快，可能会有空气在枪头中。应目测是否有气泡或者所取的量是否符合你的要求。把枪头贴在液面附近的管壁或管底，然后把液体放出。须检查是否还有液体在枪头中，如是，慢慢把液体放入管中。把枪头去掉，扭回最大量程处。第九页，共六十二页，2022年，8月28日移液操作tips

吸酶或母液时，永远用新的干净的枪头。如果不幸污染了酶，请报告老师。即使是稀释一梯度溶液，如要求很严格的体积，也必须使用新的头。检测是否漏气的方法：将吸取液体后的移液器垂直静置15秒，观察是否有液滴缓慢的流出。若有流出，说明有漏气现象。严禁吸液后将移液器平放！对于粘稠液体可首先吸放几次，然后极缓慢地松开按钮，使溶液慢慢进入吸头内；否则，可使吸入体积减少。

第十页，共六十二页，2022年，8月28日移液器的校正在25℃时，水的密度大约为1g/ml（mg/ul）.

如要校正2-20ul移液器，取10和20ul水于分析天平上分别称三次。如要校正20-200ul移液器，测量100和200ul的水。如要校正100-1000ul移液器，测量500和1000ul的水。

如果你的移液器误差超过了5%，请通知老师。第十一页，共六十二页，2022年，8月28日离心管的使用手持离心管时注意不要触碰离心管内表面，包括盖子内表面第十二页，共六十二页，2022年，8月28日实验中加入任何试剂后应注意样品的混匀。混匀、保温等反应后样品应瞬时离心将内容物收集至管底后再进行下步的实验。实验过程中应做好每个样品的标记工作，且一般在离心管上用记号笔作标记时，应在两处重复做好标记。第十三页，共六十二页，2022年，8月28日基因克隆（DNA重组）克隆：来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。克隆化：获取同一拷贝的过程。

DNA克隆（分子克隆、基因克隆、重组DNA）：应用酶学方法，在体外将外源性遗传性物质（DNA）与载体结合成重组DNA分子，继而通过转化或转染宿主细胞、筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增、提取获得大量同一DNA分子的过程。第十四页，共六十二页，2022年，8月28日工具酶

工具酶

功能限制性核酸内切酶

识别特异序列，切割DNADNA连接酶

催化DNA中相邻的5’磷酸基和3’羟基形成二酯键DNA聚合酶I

a.合成cDNA的第二条链b.缺口平移c.测序d.补平反转录酶

合成cDNA多聚核苷酸激酶

催化多聚核苷酸5‘羟基末端磷酸化末端转移酶

同聚物加尾碱性磷酸酶

切除末端磷酸基第十五页，共六十二页，2022年，8月28日限制性核酸内切酶主要来源于原核生物，具有识别自身DNA或异源DNA的功能，通过切割破坏或限制异源DNA分子侵入宿主细胞来保护自身。识别特性：具有双链对称的回文结构

↓

5’

–GAATTC-3’3’

–CTTAAG-5’↑第十六页，共六十二页，2022年，8月28日限制性核酸内切酶命名：HindIII

属种株同一株具不同特异性酶分类：根据限制酶的识别切割特性、催化条件及是否有修饰酶活性，可分为Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型三类。DNA重组技术中最常用的是Ⅱ型酶，切割后得到的是带粘性末端或平末端的线性DNA。同裂酶（异源同功酶）：来源不同，识别的是同样的核苷酸靶子序列。同裂酶产生同样的切割，形成同样的末端。同尾酶：来源各异，识别的靶序列也不相同，但产生相同的粘性末端。BamHⅠ、BclⅠ、BglⅡ、Sau3AⅠ和XhoⅡ就是一组同尾酶，它们切割DNA之后都形成由GATC4个核苷酸组成的粘性末端。

BamHⅠ：BglⅡ：第十七页，共六十二页，2022年，8月28日目的基因cDNA：complementaryDNA

经反转录合成的、与RNA互补的单链DNA。基因组DNA：代表一个细胞或生物体整套遗传信息的所有DNA序列。目前获取目的基因的几种途径或来源化学合成法用适当方法筛选cDNA或gDNA文库就可以分离到目的基因。RT-PCR(从mRNA合成cDNA)

从染色体DNA中分离第十八页，共六十二页，2022年，8月28日载体载体的分类按来源：质粒、噬菌体、病毒按产物：克隆载体、表达载体按宿主细胞：原核细胞载体、真核细胞载体供插入目的基因并将其导入宿主细胞内表达或复制的运载工具。功能：1.运送外源基因高效转入受体细胞；2.为外源基因提供复制能力或整合能力；3.为外源基因的扩增或表达提供条件。载体具备条件1.自主稳定复制2.多克隆位点3.遗传标记4.分子量小，插入容量大5.细胞内拷贝多6.安全第十九页，共六十二页，2022年，8月28日

1.细菌质粒

是一种细菌染色体外小型双链环状结构的DNA，分子大小为1-20kb，对细菌的某些代谢活动和抗药性表型具有一定的作用。质粒载体是在天然质粒的基础上人工改造拼接而成。最常用的质粒是pBR322。

2.噬菌体（phage）噬菌体是感染细菌的病毒，按其生活周期分为溶菌型及溶原型两型。用野生型λ噬菌体改造和构建的噬菌体载体是线性双链DNA，基因组约为50kb，最常用的哓菌体为λDNA及其衍生系列。

3.黏性质粒（cosmid）是由质粒与噬菌体λDNA组成的一种4-6kb的环状杂种DNA。表达型载体将上述细菌质粒载体或噬菌体载体接上启动基因及多聚核糖体的基因序列组成了表达型载体。第二十页，共六十二页，2022年，8月28日不同类型载体容量第二十一页，共六十二页，2022年，8月28日质粒pUC19的分子结构①②③④第二十二页，共六十二页，2022年，8月28日重组DNA技术的基本流程1.目的基因的获取2.克隆载体的选择与构建3.外源基因与载体的连接4.重组DNA导入受体菌5.重组体的筛选6.克隆基因的表达第二十三页，共六十二页，2022年，8月28日实验流程第二十四页，共六十二页，2022年，8月28日PartIV：蛋白表达载体的构建

第二十五页，共六十二页，2022年，8月28日克隆基因的表达体系

1．原核表达体系

将克隆化基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达。这种方法在蛋白纯化、定位及功能分析等方面都有应用。

大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下特点：易于生长和控制；用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞系统的材料昂贵；有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。操作方便、快捷，需时较短，表达量大，适合工业化生产

大肠杆菌表达体系中尚有一些不足之处：①由于缺乏转录后加工机制，只能表达克隆的cDNA，不宜表达真核基因组DNA②由于缺乏适当的翻译后加工机制，表达的真核蛋白质不能形成适当的折叠或进行糖基化修饰③表达的蛋白质常常形成不溶性的包涵体，欲使其具有活性尚需进行复杂的复性处理④很难表达大量的可溶性蛋白。

第二十六页，共六十二页，2022年，8月28日克隆基因的表达体系2．真核表达体系与原核表达体系比较，真核表达体系如酵母、昆虫、哺乳类动物细胞表达体系显示了较大优势性。尤其是哺乳类动物细胞，不仅可表达真核的cDNA，而且还可表达真核基因组DNA第二十七页，共六十二页，2022年，8月28日选择表达系统通常要根据实验目的来考虑，比如表达量高低，目标蛋白的活性，表达产物的纯化方法等等。主要归结在表达载体的选择上。

第二十八页，共六十二页，2022年，8月28日一个合格表达载体的组成要素

复制起始位点Ori即控制复制起始的位点。原核生物DNA分子中只有一个复制起始点。而真核生物DNA分子有多个复制起始位点。抗生素抗性基因可以便于加以检测，如Amp+,Kan+多克隆位点MCS克隆携带外源基因片段P/E启动子/增强子Terms终止信号加poly（A）信号可以起到稳定mRNA作用第二十九页，共六十二页，2022年，8月28日第三十页，共六十二页，2022年，8月28日pPROEXHT蛋白表达载体第三十一页，共六十二页，2022年，8月28日原核表达系统中的各因素复制子

：通常情况下质粒拷贝数和表达量是非线性的正相关筛选标记和报告基因：氨苄青霉素，卡那霉素

启动子：启动子的强弱是对表达量有决定性影响的因素之一组成型表达

:组成型启动子

诱导调控型表达

:IPTG融合表达：GST,His-Taq分泌表达

:信号肽，可以引导目的蛋白穿越细胞膜

可溶性表达

:转录终止子

:控制转录的RNA长度提高稳定性，避免质粒上异常表达导致质粒稳定性下降

核糖体结合位点

:多数载体启动子下游都有SD序列

表达菌株

:不同的表达载体对应有不同的表达菌株第三十二页，共六十二页，2022年，8月28日对原核表达载体应该注意3点：①选择合适的启动子及相应的受体菌；②用于表达真核蛋白质时注意阅读框错位；③根据表达天然蛋白质或融合蛋白来选择相应的表达载体。第三十三页，共六十二页，2022年，8月28日GST克隆载体的选择与构建昆虫谷胱氨肽-S-转移酶基因pPROEX-HT载体体外表达GST蛋白第三十四页，共六十二页，2022年，8月28日GGCACGAGGCAACAAAATGGCCAAGAAACTACATTATTTCCATTTGAACGGGCTTGCTGAGTCCATCAGGTACATCCTGCACTACGGCGGACAAAAGTTCGAGGATGTCAGATACGATCTGAAAAGCTGGCCCATCAAGAGTGTGAAAGACACTCTCCCATACGGCCAGCTGCCACTCTACGAGGAGGGAAATAAGACCCTAAACCAGTCACTGGCCATCGCGCGCTACGTAGCTGCCCAGGTCCACCTCCTGCCCACCGATCCCTGGGAGCAGGCCGTCCTGGATGCCATCGTCTTCAACATCTATGACTTCTGGGGAAAGATTCTGGTCTTCATCAAGGAGAATGATGCTGCTAAGAAGGAGGTAATCAAGAAGGAGATCATAAACGAATCCGTTGACTTCTTCTTCTCCCGATTTGAGAAGGAACTTAAGGCCAACAAGGGATTCTTCAACGGAAAGCTGAGCTGGGCTGACTTCGTCCTTGTGGGCATCGTCGAGTCTGCAAACCTGTNCCTTGGCACCGAGATTGAGAAGAAATACCCCACCGTGCTCGTGCTCGTCCAGAAAATCGCACCCTCCCTGGAGTGAAGGANTCATCGCGACTAGGAAACCATATGCTCTATAAATAAAGTACACGTACTGTAAAAAAAAAAAAAAPrimers：GGCACGAGGCAACAAAATGGCGTGTACTTTATTTATAGAGCATATGGGSTnucleotidesequenceandopenreadingframe(yellow)第三十五页，共六十二页，2022年，8月28日第三十六页，共六十二页，2022年，8月28日pPROEXHT蛋白表达载体第三十七页，共六十二页，2022年，8月28日第三十八页，共六十二页，2022年，8月28日GSTinpGEM-easyvector

GGAATTCGATTGGCACGAGGCAACAAAATG……EcoRI第三十九页，共六十二页，2022年，8月28日GST体外蛋白表达的实验流程第四十页，共六十二页，2022年，8月28日第二部分：质粒DNA的提取第四十一页，共六十二页，2022年，8月28日PartI：质粒DNA提取的原理

第四十二页，共六十二页，2022年，8月28日什么是质粒（plasmid）？质粒是染色体外的稳定遗传因子大小1-200Kb双链、闭环、超螺旋DNA主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中自主复制和转录，并表达所携带的遗传信息。第四十三页，共六十二页，2022年，8月28日碱裂解法抽提质粒DNA基本原理

质粒的分离是利用质粒DNA与染色体DNA在变性与复性中的差异来达到的目的。当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，由于染色体DNA与质粒DNA拓朴构型不同,染色体DNA双螺旋结构解开，而共价闭环质粒DNA的氢键虽被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕仍会紧密地结合在一起。当加入中和液后,溶液pH调恢复至中性，在高盐浓度的情况下，染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构并与蛋白质-SDS复合物等形成沉淀；不同的是，质粒DNA复性迅速而准确，保持可溶状态而留在上清中。这样，通过离心可沉淀大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质。除去沉淀后上清中的质粒可用酚氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。第四十四页，共六十二页，2022年，8月28日PartII：质粒DNA提取的

方法步骤

第四十五页，共六十二页，2022年，8月28日质粒DNA的提取方法方法：碱裂解法；煮沸裂解；羟基磷灰石柱层析法，质粒DNA释放法；酸酚法等。概括起来主要是用非离子型或离子型去污剂、有机溶剂或碱进行处理及用加热处理所有分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离质粒DNA(有时还要求纯化质粒DNA，根据实验所需)第四十六页，共六十二页，2022年，8月28日选择哪一种方法主要取决于以下几个因素：质粒的大小、大肠杆菌菌株、裂解后用于纯化的技术和实验要求第四十七页，共六十二页，2022年，8月28日碱裂解法1．收集菌体：取1.5ml培养液至Ep管中，12000rpm离心1min，弃上清，取沉淀。2．溶解菌体：将细菌沉淀悬浮于100μl预冷溶液Ⅰ中，强裂振荡混匀。3．变性：加入200μl溶液Ⅱ，盖严管盖轻柔颠倒5-6次以混匀内容物，冰上放置5分钟。4．复性：加入150μl溶液Ⅲ，温和振荡数次，冰上放置５分钟。5．12000rpm离心５分钟，取上清移到１个新的Ep管中。6.取上清（≈420ul），分别加入1/2体积酚(210ul)，和1/2体积氯仿/异戊醇（24:１）(210ul)，涡旋震荡混匀溶液。第四十八页，共六十二页，2022年，8月28日7.12000rpm、离心5分钟。小心移取上清液（≈400μl)至另一个新1.5mlEp管中。8.上清液加入２倍体积（≈800ul）预冷无水乙醇，混匀，于-20℃中静置0.5h。9.12000rpm,离心5分钟。弃上清，加入１ml70%乙醇漂洗沉淀，盖严管盖颠倒数次，１２000rpm离心10分钟。10．干燥DNA：用移液器小心吸走上清液，然后瞬时离心，再将残余的少量液体移走，用温和的电吹风吹干DNA沉淀（以看不到液滴为准）。11．加入50μlTE（含20μg/mlRNA酶，不含DNA酶）溶解DNA，-20℃下保存备用。第四十九页，共六十二页，2022年，8月28日碱法质粒抽提用到三种溶液

溶液I，50mM葡萄糖/25mMTris-Cl/10mMEDTA，pH8.0；

溶液II，0.2NNaOH/1%SDS(新鲜的)；

溶液III，3M醋酸钾/2M醋酸。

溶液I:Tris-Cl:适当pH值,葡萄糖：增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械剪切力作用而降解,悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部,

EDTA:抑制DNase的活性，和抑制微生物生长(是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂)溶液IINaOH：是最佳的溶解细胞的试剂。这一步要记住两点：第一，不能用旧的NaOH；第二，时间不能过长，必须温柔混合，不然基因组DNA也会断裂SDS:是离子型表面活性剂。它主要功能有：（1）溶解细胞膜上的脂质与蛋白，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜。（2）解聚细胞中的核蛋白。（3）SDS能与蛋白质结合成为R-O-SO3-…R＋-蛋白质的复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。溶液III醋酸钾:K+离子会与SDS形成溶解度很低的盐并与蛋白质形成沉淀而除去；高浓度的盐，使得沉淀更完全（在pH为8左右的溶液中，DNA分子是带负电荷的，加一定浓度的NaAc或KAC，使Na+中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，易于互相聚合而形成DNA钠盐沉淀）。2M的醋酸:中和NaOH，创造质粒复性的环境。

第五十页，共六十二页，2022年，8月28日酚/氯仿/异戊醇进行抽提，然后进行酒精沉淀才能得到质量稳定的质粒DNA酚/氯仿/异戊醇(25/24/1)1水饱和酚的比重略比水重，碰到高浓度的盐溶液（比如4M的异硫氰酸胍），离心后酚相会跑到上层，不利于含质粒的水相的回收；但加入氯仿后可以增加比重，使得酚/氯仿始终在下层，方便水相的回收；

2.酚与水有很大的互溶性，如果单独用酚抽提后会有大量的酚溶解到水相中，而酚会抑制很多酶反应（比如限制性酶切反应）

3.异戊醇，其作用主要是为了让离心后上下层的界面更加清晰，也方便了水相的回收。而且加入异戊醇能降低分子表面张力，所以能减少抽提过程中的泡沫产生。保护层（水相）饱和酚（0.25％8-羟基喹啉）第五十一页，共六十二页，2022年，8月28日实验一、质粒DNA提取准备工作：（一）固体LB(luria-Bertani)培养基的制备（100mL）：称量0.5g胰蛋白胨，0.5gNaCl，1.0g酵母粉，1.5g琼脂粉，加入去离子水至100ml，混匀；高压蒸汽灭菌15-20min；取出，移入超净工作台，待凉至50-60oC时加入氨苄青霉素（50mg/ml）至终浓度为50ug/ml，混匀将培养基倒入培养皿中（培养基覆盖皿底即可，每皿约20ml）半盖上培养皿，培养基彻底冷却后（15min），合上培养皿盖，倒放置于4

oC冰箱中。第五十二页，共六十二页，2022年，8月28日（二）细菌划线培养：目的：产生单菌落，供后续克隆分析注意：通常37oC培养过夜（12-14小时）第五十三页，共六十二页，2022年，8月28日（三）液体扩大培养：液体LB培养基的制备：同固体LB，但不加琼脂粉，灭菌。在超净工作台中，加入3mlLB至一灭菌的试管中，加入3ul50mg/ml的AmP用小枪头挑一单菌落，连枪头一起放入试管中，37oC250rpm培养过夜。第五十四页，共六十二页，2022年，8月28日质粒提取（TIANprepMiniPlasmidkit)1.柱平衡：向吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中）加入500ul的平衡液BL,12000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中2.收集菌体：取1.5ml培养液至Ep管中，12000rpm离心1min，弃上清（尽量移除上清）。3．溶解菌体：将细菌沉淀悬浮于250ul溶液P1中（请先检查是否加入RNaseA），涡旋振荡混匀。4．变性：加入250ul溶液P2，盖严管盖轻柔颠倒6-8次,使菌体充分裂解。(此时菌体变得粘稠、澄清)5．复性：加入350μl溶液P3，立即温和上下翻转6-8次（此时会出现白色絮状沉淀）；12000rpm离心10分钟。6.取上清，转移到吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中），12000rpm离心30-60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放回收集管中。第五十五页，共六十二页，2022年，8月28日7.向吸附柱CP3中加入500ul去蛋白液PD，12000rpm离心30-60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放回收集管中。8.向吸附柱CP3中加入600ul漂洗液PW（请先检查是否已经加入无水乙醇），12000rpm离心30-60秒，倒掉收集管中的废液，