非编码RNA研究进展

非编码RNA研究进展长非编码RNA长非编码RNA长度在200bp以上。启动子相关长链RNA（promoterassociatedlongRNAs，PARs）；转录超保守区域（transcribedultraconservedregions，T-UCR）；长链非编码RNA（longnon-codingRNAs，lncRNAs）；假基因（pseudogenes）；反义RNA（antisenseRNA,asRNAs）。小RNA（SmallRNA）SmallRNA包含miRNA(microRNA)、ncRNA(non-codingRNA)、siRNA(smallinterferingRNA)、snoRNA(smallnucleolarRNA)、piRNA(piwi-interactingRNA)、rasiRNA(RepeatassociatedsmallinterferingRNA)等。高通量测序技术在SmallRNA研究中的应用包括：靶基因功能研究，生命活动调节，发育进化研究，生物Marker,致病机理研究，药物开发等。Smallnon-codingRNA（小非编码RNA)小非编码RNA的RNA长度在20-35bp；微小RNA（microRNAs,miRNAs）；源于核糖体RNA片段（tRNA-derivedfragment，tRF)；PIWI蛋白作用RNA（PIWI-interactingRNAs，piRNAs）；核仁小分子RNA（C/DsnoRNA-derivedRNA,sdRNA）；小干扰RNA（smallinterferingRNAs，siRNAs）。miRNAs与siRNAs与ARGONAUTE(AGO)/PIWI蛋白家族中的AGO亚族结合。小RNA在基因表达、表观遗传、疾病发生发展进程中发挥着重要功能。高丰度、高稳定性和高特异性预示其在临床分子标志物(biomarker)研究中具有高潜在价值。SmallRNA转录组测序是鉴定和定量解析smallRNA的新方法和有力工具。RocheGSFLXTitanium、IlluminaSolexaGAIIx和ABSOLID4均可以对SmallRNA进行大规模测序(Large-scalesequencing)分析，IlluminaSolexaGAIIx和ABISolid的读长正好配合了smallRNA的短序列且通量大，可以得到更高覆盖率，IlluminaSolexaGAIIx在smallRNA测序中广泛应用。通过对SmallRNA大规模测序(Large-scalesequencing)分析，可以从中获得物种全基因组水平的SmallRNA图谱，实现包括新SmallRNA分子的挖掘，其作用靶基因的预测和鉴定、样品间差异表达分析、SmallRNA聚类和表达谱分析等科学应用。图释：A：piRNA和miRNA在PAGE凝胶上的片段分布区域十分接近；B：同时对这两片段区域的RNA进行测序。SmallRNA测序有什么样的样品要求？(1)样品纯度要求：OD值应在1.8至2.2之间；电泳检测28S:18S至少大于1.5。(2)样品浓度：totalRNA浓度不低于750ng/μg；提取总RNA时请不要使用过柱法提取总RNA，样品总量不低于40μg?(SmallRNA:totalRNA大于0.3%)。或提供浓度大于2ng/μg，总量大于180ng的SmallRNA样品。(3)SmallRNA样品请置于-20℃保存；请提供SmallRNA样品具体浓度、体积、制备时间、溶剂名称及物种来源。请同时附上QC数据，包括电泳胶图、分光光度或Nanodrop仪器检测数据。如需进行多次样品制备，需要提供多次样品制备所需样品。(4)样品运输：样品请置于1.5ml管中，管上注明样品名称、浓度以及制备时间，管口使用Parafilm封口。建议使用干冰运输，并且尽量选用较快的邮递方式，以降低运输过程中样品降解的可能性。SmallRNA分离方法？现行的RNA纯化方法包括有机溶剂抽提+乙醇沉淀，或者是采用更加方便快捷的硅胶膜离心柱的方法来纯化RNA。由于硅胶膜离心柱通常只富集较大分子的RNA(200nt以上)，SmallRNA往往被淘汰掉，不适用于SmallRNA分离纯化。有机溶剂抽提能够较好的保留SmallRNA，但是后继的沉淀步骤比较费时费力。目前还有另外一些SmallRNA分离专用的试剂盒。如MirVanamiRNAIsolationKit是采用玻璃纤维滤膜离心柱(glassfiberfilter，GFF)，既能够富集10mer以上的RNA分子，又兼备离心柱快速离心纯化的特点。对于SmallRNA测序，采用PAGE胶电泳对小RNA进行分离。可以选择感兴趣的SmallRNA长度进行研究。SmallRNA的长度为18-30nt。推荐的测序长度为35bp，之后对序列信息进行修剪，去除接头序列仅留下SmallRNA序列。由于Solexa的读长足够满足SmallRNA测序的读长要求，且数据读取量大，性价比高，因此Solexa在SmallRNA测序方面得到广泛的应用。采用Solexa进行SmallRNA测序其文库构建方法如下：(1)PAGE胶纯化特定大小的小RNA分子；(2)5′接头连接和纯化；(3)3′接头连接纯化；(4)RT-PCR扩增；(5)SmallRNA文库的纯化；(6)文库的检测。SmallRNA文库需要通过电泳检测和AgilentTechnoligies2100分析仪检测以分析测序文库中片段的大小、纯度和浓度。SmallRNA测序文库的构建方法及质量控制？高通量测序研究SmallRNA优势？(1)可以直接从核苷酸水平上研究SmallRNA分子，不存在传统芯片杂交的荧光模拟信号带来的交叉反应和背景噪音问题，利于区分相同家族以及序列极为相似的不同SmallRNA分子；(2)可以对任意物种进行高通量分析，无需任何预先的序列信息以及二级结构信息；(3)灵敏度高，测序通量大，为SmallRNA分子的发现和研究提供了极大数据深度与覆盖率，能够检测丰度极低的稀有转录；(4)测序产生的原始数据可以与多种分析软件兼容，可以注释SmallRNA的基因组信息，并分析其表达水平，能够随时使用公用SmallRNA数据库注释已知的SmallRNA，还可以进一步分析未匹配的数据，发现新的SmallRNA种类及异构体，寻找更深入的研究信息。SmallRNA测序的影响因素？(1)样本的质量：进行SmallRNA测序过程中，需要对SmallRNA进行分离，分离SmallRNA的质量和纯度直接影响测序结果。由于RNA容易降解，因此RNA的抽提、纯化等操作一定要严格按照实验要求进行，以保证样品的质量。(2)构建文库的质量：文库构建需要PAGE胶分离纯化SmallRNA，然后连接接头进行纯化后才能进行RT-PCR，在此过程中，要小心操作保证SmallRNA无降解，同时纯化过程要保证接头去除干净，残余的接头会对后续的测序产生影响。(3)测序文库的上样量控制：这个因素也会很大程度影响簇生成的密度，由于上样量非常小，只有1-8pg，所以能否准确定量微量样品也是影响测序通量的重要因素。piRNA

[Piwi-interactingRNA(piRNA)]

piRNA的发现piRNA的发现为非编码小分子RNA的研究开辟了一个新领域，被Science评为2006年十大科技进展之一。2006年，四个独立的研究小组几乎同时在果蝇、小鼠、大鼠和人等物种生殖系细胞中发现了一类特异地与PIWI家族蛋白质相互作用的新型小分子RNA。Aravin等发现了该种小RNA，他们在3个月大的C57BL/6J雄性小鼠从小鼠全睾丸组织的全细胞裂解液中利用免疫共沉淀技术纯化并获得MILI核糖核蛋白复合体。该复合体中含有26-28ntRNA进行凝胶纯化，克隆和测序。他们根据Piwi蛋白家族的成员MILI与这些小RNA的相互作用，命名为PiwiinteractingRNAs，即piRNAs。AravinA，GaidatzisD，PfefferS，etal．《AnovelclassofsmallRNAsbindtoMILIproteininmousetestes》．Nature，2006，442（7099）：203～207.GirardA，SachidanandamR，HannonGJ，etal．《AgermlinespecificclassofsmallRNAsbindsmammalianPiwiproteins》．Nature，2006，442（7099）：199～202Argonaute蛋白的一种亚家族——Piwi蛋白家族，为无脊椎动物的精子和干细胞的发育所必需。两种Piwi蛋白家族成员：MILI和MIWI是小鼠精子形成所必需的。Girard等在睾丸总RNA分离过程中也检测到了这种小RNA，它与MIWI蛋白（一种鼠科的Piwi蛋白）结合。这些小分子RNA在减数分裂起始期积累。所确证的这些1,000多条独特小分子RNA序列均具有强的5'尿嘧啶偏爱性。这些小分子RNA的遗传图谱显示了数量有限的基因簇，表明这些小分子RNA由较长的初级转录产物加工而成。这些小分子RNA的长度为26–31个核苷酸。明显与21–23个核苷酸的microRNAs和短siRNAs不同。因此我们称其为“Piwi相互作用RNA”或者piRNAs。他们用小鼠17号染色体，大鼠20号染色体和人的6号染色体进行分析，发有类似的piRNA，大多数基因簇出现在同线位置上。直系同源（Orthologous）的人类染色体区域也能产生具有piRNAs特性的小分子RNA，但序列不同。该类新型小分子RNA的证实为确定哺乳动物中精子形成过程中的Piwi蛋白的作用提供了起点。LauNC，SetoAG，KimJ，etal．《CharacterizationofthepiRNAcomplexfromrattestes》．Science，2006，313（5785）：363～367GrivnaST，BeyretE，WangZ，etal．《AnovelclassofsmallRNAsinmousespermatogeniccells．Genes&Dev，2006，20（13）：1709～1714此外，相继有3篇文章也分别报道了在小鼠的生精细胞、生殖系细胞以及睾丸中发现了piRNA。其中日本的实验室根据来源将其命名为germlinesmallRNA（gsRNA），由于命名原则的不同，故在名称上存在一定的差异。YukaW.Iwasaki,MikikoC.Siomi,andHaruhikoSiomi,《PIWI-InteractingRNA:ItsBiogenesisandFunctions》，AnnualReviewofBiochemistry，2015，Vol.84:405-433piRNA的起源piRNA来源于基因组中的piRNA簇(piRNAcluster)或转座子区域，由长的单链转录本切割产生。成熟的piRNA24-32nt。piRNA在动物界广泛表达，目前尚未在植物中检测到。除线虫外，从海绵动物(sponges)到高等哺乳动物中保守存在两条piRNA生成途径：初级生成途径（primarypathway）：初级生成途径主要发生在体细胞中，主要由单链piRNA簇、双链piRNA簇、基因来源的piRNA和转座子来源的生成途径。单链的piRNA前体加工成piRNA中间体后于Piwi蛋白结合发生细胞核或者细胞质沉默事件。次级生成途径（secondarypathway）：次级生成途径主要发生在生殖细胞中，PIWI家族在果蝇中有3个成员——Piwi、Aub和Ago3，其中Piwi和Aub结合初级piRNA。由初级加工途径生成的Aub-piRNA大多来源于转座子的反义链，可以通过序列互补配对识别正义链的转录本，然后由Aub切割形成次级piRNA的5'端，并装载到Ago3上，再通过与初级加工途径类似的3'端修剪、甲基化修饰等过程得到正义链来源的次级piRNA。Ago3-次级piRNA复合物再以同样的机制剪切产生反义链的Aub-次级piRNA，即被称作乒乓循环(ping-pangcycle)的piRNA次级加工途径。小鼠睾丸中同样存在由Mili和Miwi2介导的乒乓循环。piRNA是最近从哺乳动物睾丸组织中发现的一类能与PIWI蛋白质相互作用的新型小RNA；长度比一般的小RNA略长，分布在26～31nt之间，大部分集中在29～30nt、5′端具有尿嘧啶(U)偏向性(约86%)；piRNA是单链小分子RNA；piRNA与Argo蛋白家族中的Piwi亚家族蛋白相互结合，在细胞质和细胞核的功能十分活跃；piRNA的表达具有组织特异性；无明显特殊性的二级结构特异基序和特征。piRNA的结构特征piRNA在染色体上的分布极不均匀，在小鼠中主要分布在17、5、4、2染色体上，基本上不分布在性染色体上；piRNA主要存在于基因间隔区，而很少存在于基因区和重复序列区；它们一般集中成簇分布在1～100kb相对较短的基因组位点，一个这样的位点一般包含10～4500个小分子RNA；每一个成簇的piRNA几乎都具有同一取向，说明同一簇piRNA可能来源于同一个初始转录体；有很少一部分成簇的piRNA其取向会突然发生改变，这些具有双向特点的成簇piRNA则可能从同一个中心启动子转录而来。BetelD,SheridanR,MarksDS,etal.《ComputationalanalysisofmousepiRNAsequenceandbiogenesis》.PLoSComputBiol,2007,3(11):e222.piRNA生物学功能A.piRNA调控果蝇早期胚胎发育2001年，Aravin等发现，果蝇Y染色体上与Stellate同源的假基因Su(Ste)编码一类小RNA，其长度大于siRNA，与PIWI家族蛋白Aub相互作用，即现在熟知的piRNA。Su(Ste)基因缺失或aub突变即检测不到Su(Ste)来源的piRNA，同时导致Stellate蛋白积累、果蝇雄性不育。后续的研究发现，Aub-Su(Ste)piRNA通过在转录后水平降解成熟的mRNA，实现对Stellate基因表达的负调控。B.piRNA参与家蚕性别决定家蚕piRNA的最新研究发现，来自性染色体的FempiRNA通过直接切割靶mRNA参与性别决定。家蚕采用ZW性别决定系统，即雄性携带两条Z染色体，而雌性携带1条Z染色体和1条W染色体。决定性别的W染色体几乎全部为转座子序列，至今未鉴定出蛋白质编码基因。W染色体的转录本可以作为piRNA前体，加工成29nt的FempiRNA，在雌性家蚕中特异性表达。在家蚕胚胎中转染FempiRNA的反义链RNA或通过siRNA下调家蚕PIWI蛋白Siwi表达，均导致雌性家蚕出现雄性化特征。C.piRNA介导mRNA衰减PIWI/piRNA调控基因表达研究的新进展》DOI:10.13376/j.cbls/20150462010年，Rouget等报道发现果蝇piRNA参与早期胚胎中母源mRNA的降解。胚胎发育早期，随着早期胚胎转录机器的启动，母源mRNA逐渐被胚胎mRNA取代，被称作母源-合子过渡(maternal-to-zygonictransition)。过渡过程中，母源mRNA的降解通过CCR4-NOT脱腺苷酸复合物介导。D.piRNA调控基因表达的机制线虫piRNA由单个的转录小单元编码，其序列可覆盖几乎所有的蛋白质编码基因。线虫piRNA执行生殖细胞的全基因组转录本监测任务，一方面通过可遗传的RNA诱导的表观遗传沉默途径(RNA-inducedepigeneticsilencingpathway,RNAe)沉默外源的“非我”(non-self)基因；一方面保护内源基因mRNA的稳定性，并激活其表达。21U-RNA加载到线虫PIWI蛋白PRG-1上，通过序列不完全互补配对识别靶mRNA，招募RNA依赖的RNA聚合酶(RdRP)合成与mRNA完全互补配对的22G-RNA。22G-RNA可以与两种Argonaute蛋白结合，与WAGO蛋白结合则招募组蛋白甲基转移酶启动RNAe，抑制外源mRNA表达；与CSR-1结合则保护内源靶mRNA不受RNAe沉默，并激活其表达。21U-RNA对基因表达双向调控的确切机制还有待于进一步的研究。E.piRNA调控转座转座元件是一类存在于多细胞生物基因组中的不稳定元素，它们可以通过频繁跳跃将自身插入到基因组的其它位点，从而实现对基因结构和表达的改变，对物种进化具有重要意义。如果转座元件在基因组中毫无约束地随意移动，则会破坏基因组的稳定性和完整性，危害个体的生存。因生殖细胞担负着传代的重任，其基因组的稳定性和完整性尤为重要。因此，在选择压力下，动物生殖系细胞可能就进化获得了PIWI/piRNA这样一条独特小RNA通路，用于控制转座子、逆转座子等自私性基因元件的活性，维持生殖细胞基因组稳定性及完整性。piRNA生物学功能核心组件PIWI蛋白Argonaute蛋白家族可分为AGO和PIWI两个亚家族成员，它们在物种间高度保守，并在小分子非编码RNA调控途径中发挥核心作用。AGO蛋白质成员特异性地与小分子干扰RNA(smallinterferingRNA,siRNA)和microRNA(miRNA)结合，在多种组织器官中发挥重要功能。PIWI蛋白质特异性地在动物生殖系细胞中表达，特异性地结合piRNA，在动物生殖细胞发育和配子生成过程中发挥多种重要功能。Argonaute家族蛋白质含有保守的PAZ(PiwiArgonautandZwille)结构域和PIWI结构域。结构及生化研究表明，AGO/PIWI蛋白质通过PAZ结构域与小分子RNA的3′末端结合，而PIWI结构域及MID结构域(themiddledomain)结合RNA分子的5′末端。PIWI结构域含有RNaseH的催化结构域，一部分Argonaute成员具有核酸内切酶活性，可在对应于向导小RNA分子第10位与11位碱基之间切割靶RNA链piwi是进化上非常保守的一类基因，最早在果蝇中被发现，对果蝇生殖干细胞的自我更新和维持是必需的。piwi基因缺失也导致线虫、斑马鱼及小鼠等模式生物生殖细胞发育受阻。这些研究表明，PIWI蛋白主要在动物生殖细胞中表达，其功能与生殖事件相关。在小鼠中，PIWI蛋白家族包括三个成员：MIWI2、MILI和MIWI，它们在小鼠雄性生殖细胞的发育分化过程中呈现高度时空特异性表达。piRNA在肿瘤中的研究迎来井喷piRNA在体细胞中表达具有组织特异性在乳腺，肺和胃组织中进行piRNA测序和表达谱分析，发现piRNA具有组织特异性piRNA在肿瘤中异常表达Piwi相互作用RNA（piRNA）是一类新发现的非编码小RNA，又称第三类小RNA。它们具有基因表达调控的功能，但与肿瘤发生、发展的关系非常仍然不太清晰。宁波大学郭俊明在胃癌中（1）发现了在胃癌组织中异常表达的piRNA。经piRNA芯片检测胃癌组织和癌旁组织中piRNA的表达，发现一些差异表达的piRNA，其中piR-651和piR-823的表达差异具有统计学意义。（2）揭示了胃癌组织与癌旁组织piRNA表达谱的差异。发现胃癌组织中piR-823的表达水平明显低于癌旁组织中的表达水平，而piR-651的表达则相反。发现piR-651和piR-823分别高表达于和低表达于胃癌组织中，并于胃癌患者的临床病理因素相关。（3）胃癌细胞株与正常胃上皮细胞中piR-823表达差异的研究。发现胃癌细胞中piR-823的表达明显低于正常胃上皮细胞中的表达。（4）多种肿瘤组织中piR-823表达差异的研究。发现，结肠癌和肺癌组织中，piR-823的表达高于相应癌旁组织。（5）piR-823类似物抑制胃癌细胞的生长。把piR-823类似物导入到胃癌细胞中，MTT结果显示MGC-803和SGC-7901的生长均以剂量依赖方式受到抑制。（6）piR-651抑制剂通过影响细胞周期抑制胃癌细胞的生长，机制研究说明其阻止胃癌细胞于G2/M期。（7）动物实验说明piR-823具有抑制肿瘤细胞生长的作用。（8）外周血piRNA检测用于胃癌诊断的价值研究。胃癌患者外周血piR-651和piR-823的水平明显不同于正常人外周血中的水平；腺癌患者外周血piR-651的水平明显高于印戒细胞癌的水平；piR-823的水平与TNM分期和远处转移有关。piR-651、piR-823单独使用和联合使用的ROC曲线下面积分别为0.890、0.810和0.892；它们的阳性检测率均高于CEA的检测率。目的：利用piRNA测序筛选新型乳腺癌预后生物标记物前言Piwi-interactingRNAs(piRNAs)是一类26到32nt的非编码小RNA，在维持生殖细胞系上发挥重要作用，目前还认为其在体细胞中对基因表达起到转录后调控的作用。Piwi蛋白是piRNA生物合成和作用途径的中心，对基因的表达起表观调控作用。piRNAs/PIWIs已被报道可作为多种癌症的潜在生物标记物，但其在乳腺癌中的作用尚未得到全面的研究。研究者分别对来自104个病人的石蜡包埋乳腺肿瘤组织和11个冻存正常乳腺组织进行小RNA测序。结果正常组织获得10Mreads数，肿瘤组织获得165Mreads数，piRNA序列总数4,207,022条，被注释到676个piRNA上。发现25个差异表达的piRNA，包括17个上调和8个下调piNRA。图1.差异表达piRNAs的聚类热图然后，进行病例对照(Case–control)和纯病例(Case–only)统计分析，鉴定出8个piRNA可作为新的预后标记。同时利用基因表达综合数据库GEO对PIWI基因进行预后标记评价，发现PIWIL3和PIWIL4也跟预后相关。图2.利用差异piNRA构建的危险评分与生存的关系利用PIWI基因构建的危险评分与生存的相关性最后，利用mRNA表达数据库对这些预后差异显著的piRNA进行靶标分析，发现306个靶标基因与piRNA的表达呈现负相关。对鉴定的这些靶标基因富集分析发现主要富集到血管生成、转录、细胞信号传导等功能上。总的来说，该研究捕获了piRNA异常表达途径的整个级联事件,并发现了乳腺癌预后的新型生物标记物。是真核生物转录后加工过程中RNA剪接体（spilceosome）的主要成分，参与mRNA前体的加工过程。

snRNA（小核RNA）2016年1月8日，清华大学生命学院施一公教授研究组在《科学》（Science）就剪接体的结构与机理研究再发长文（ResearchArticle），题为《U4/U6.U5三小核核糖核蛋白复合物3.8埃的结构：对剪接体组装及催化的理解》（The3.8AStructureoftheU4/U6.U5tri-snRNP:InsightsintoSpliceosomeAssemblyandCatalysis）报道了酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）剪接体组装过程中的一个关键复合物U4/U6.U5tri-snRNP高达3.8埃分辨率的冷冻电镜结构，并在此基础上分析了剪接体的组装机制，为进一步理解剪接体的激活及前体信使RNA（pre-mRNA）剪接反应的催化机制提供了重要分子基础。该结构与2015年8月施一公研究组报道的分辨率为3.6埃的裂殖酵母（Schizosaccharomycspombe）剪接体结构的对比揭示了剪接体在pre-mRNA剪接反应过程中作为核酶（ribozyme）的催化本质，是RNA剪接研究领域的又一重大进展。U4/U6.U5tri-snRNP是剪接体组装过程中最大也是最保守的预组装复合物，它由U5小核核糖核蛋白（snRNP），U4、U6snRNA和其他蛋白因子组成。在该复合物中，U6snRNA呈现失活构象。U4/U6.U5tri-snRNP与A复合物结合形成B复合物，再经过一系列成分、构象重组后，U1、U4snRNP解离，剪接体形成，U6snRNA从而被激活。所以，tri-snRNP的加入是组装成具有催化活性的剪接体这个过程中不可或缺的一步，其高分辨率结构的解析对于揭示pre-mRNA剪接反应的分子机理至关重要。

U4/U6.U5tri-snRNP电镜密度及三维结构示意图他们探索并优化了蛋白提纯方案，获得了性质良好的酿酒酵母U4/U6.U5tri-snRNP复合物的蛋白样品，并利用单颗粒冷冻电镜技术重构出了总体分辨率为3.8埃的三维结构，核心区域分辨率更是高达3.0-3.5埃，从而首次将该复合物分辨率推进至近原子分辨率，并搭建了该复合物的原子模型。此高分辨率的结构中，一个出人意料的发现是U4/U6.U5tri-snRNP复合物中存在着与之结合的pre-mRNA。该pre-mRNA通过与U5snRNA和U6snRNA碱基互补配对被识别，其5‘剪接位点中高度保守的鸟嘌呤核糖核苷酸（Guanine）被关键蛋白Prp8特异性识别。这一发现为剪接体的组装和剪接反应的催化提供了新的见解。pre-mRNA与tri-snRNP结合非编码RNA与其它组学整合研究（一）非编码RNA与表观遗传学调控表观遗传学的特点可遗传的，即这类改变通过有丝分裂或减数分裂，能在细胞或个体世代间遗传；可逆性的基因表达调节，也有较少的学者描述为基因活性或功能的改变；没有DNA序列的改变或不能用DNA序列变化来解释。表观遗传修饰主要包括DNA以及一些与DNA密切相关的蛋白质(例如组蛋白)的化学修饰.某些非编码的RNA也在表观遗传修饰中起着重要的作用。EpigeneticRegulationofCancerSiteSpecificHypermethylationGlobalHypomethylationHistoneModificationsRegulatingFactorsDietaryHormonalGeneticVermaM,SrivastavaS.LancetOncol.(2002)3:755-63.DNAMethyltransferasesHistoneMethyltransferasesHistoneAcetylases/DeacetylasesEpigeneticsRegulates:CellCycleControlDNADamageApoptosisInvasionX-ChromosomeInactivationImprintingAging表观遗传修饰从多个水平调控基因表达

DNA:DNA甲基化蛋白质：组蛋白修饰

染色质：染色质重塑

RNA：非编码RNADNA甲基化

DNA甲基化(DNAmethylation)是研究得最清楚、也是最重要的表观遗传修饰形式，通过将S一腺苷甲硫氨酸作为甲基供体，并在DNA甲基转移酶(DNAmethyltransferase，DNMT)的催化下，CpG二核苷酸中的胞嘧啶环上5′位置的氢被活性甲基所取代，从而转变成为5甲基胞嘧啶(5-methylcytosine，5mC)。83哺乳动物基因组中5mC占胞嘧啶总量的2%-7%，约70%的5mC存在于CpG二连核苷。在结构基因的5’端调控区域,

CpG二连核苷常常以成簇串联形式排列，这种富含CpG二连核苷的区域称为CpG岛(CpGislands)，其大小为500-1000bp，约56%的编码基因含该结构。基因调控元件(如启动子)所含CpG岛中的5mC会阻碍转录因子复合体与DNA的结合。DNA甲基化一般与基因沉默相关联；非甲基化一般与基因的活化相关联；而去甲基化往往与一个沉默基因的重新激活相关联。癌细胞的整个基因组水平处于低甲基化状态，比正常低20%～60%，这种低甲基化大多发生于编码区和内含子区域，以及约占人类基因组20%～30%的重复序列区抑癌基因启动子区域CpG岛高度甲基化，且与DNA结合的组蛋白广泛去乙酰化85组蛋白修饰组蛋白修饰(histonemodification)是表观遗传研究的重要内容。组蛋白的N端是不稳定的、无一定组织的亚单位，其延伸至核小体以外，会受到不同的化学修饰，这种修饰往往与基因的表达调控密切相关。被组蛋白覆盖的基因如果要表达，首先要改变组蛋白的修饰状态，使其与DNA的结合由紧变松，这样靶基因才能与转录复合物相互作用。组蛋白是重要的染色体结构维持单元和基因表达的负控制因子。组蛋白修饰的种类染色质重塑染色质重塑（chromatinremodeling）是一个重要的表观遗传学机制。染色质重塑是由染色质重塑复合物介导的一系列以染色质上核小体变化为基本特征的生物学过程。组蛋白尾巴的化学修饰（乙酰化、甲基化及磷酸化等）可以改变染色质结构，从而影响邻近基因的活性。88MicroRNAmiRNA是近年来生命科学领域的研究热点，是一组生物体基因组编码的内源性非编码小RNA。miRNA主要采用降解靶mRNA和抑制靶mRNA的翻译两种作用方式在转录后水平调控基因表达。降解靶mRNA的方式与siRNA的作用方式相似，直接作用于靶mRNA，直接导致mRNA表达水平下降。但绝大多数哺乳动物细胞中的miRNAs并不导致靶mRNA的降解，而是通过与靶mRNA的3’端非翻译区（UTR）不完全匹配结合，抑制mRNA翻译成蛋白质，使靶基因的蛋白质表达水平下降。89

miRNA与肿瘤发生的关系存在两种可能的模式[Caldas,etal.（NatureMedicine2005）]：1、若miRNA表达上调，其对应抑癌基因表达下调时，则可能导致肿瘤发生；2、若miRNA表达下调，其对应癌基因表达上调时，同样可能导致肿瘤发生。

许多瘤基因和肿瘤抑制基因都受到miRNAs分子的调控，此时的miRNAs可能起到癌基因或是肿瘤抑制基因的作用。miRNA癌基因的活化和miRNA抑癌基因失活导致肿瘤抑瘤基因表达下调以及这些miRNA基因与蛋白编码癌基因、抑癌基因协同作用导致肿瘤发生.miRNA的甲基化修饰92RNA甲基化近两年，科学家们首次发现了一种可逆性的RNA甲基化—m6A。定位了哺乳动物转录组中的m6A，鉴定了这种动态修饰的「读」、「写」和「擦除」蛋白，解析了m6A在转录后调控中的一些功能。RNA甲基化（m6A）研究在表观遗传领域开始崭露头角，成为最前沿的热点！N6-甲基腺嘌呤(m6A）是真核生物最常见和最丰富的RNA分子修饰。m6A修饰是METTL3甲基转移酶复合体催化的，而最近新发现的RNA去甲基化酶FTO和ALKBH5可以通过一种α-酮戊二酸和Fe2+依赖型的形式对m6A去甲基化。METTL3(methyltransferaselike3)，FTO和ALKBH5被证明在很多生物过程中起重要作用，从发育和代谢到生殖。m6A存在于很多物种质中，占到了RNA碱基甲基化修饰的80%。m6A主要分布在mRNA中，也出现在非编码RNA如tRNA，rRNA和snRNA。在转录成的RNA中相对高的m6A含量会影响RNA的代谢过程，比如剪切，核转运，翻译能力和稳定性，以及RNA转录2014年发现了WTAP(wilms"tumour1-associatingprotein)蛋白作为m6A甲基转移酶复合物调控亚基，调节m6A甲基转移酶催化亚基METTL3和METTL14在细胞体内的定位和活性。WTAP结合RNA并招募METTL3/METTL14复合物对RRACH特异序列进行甲基化修饰研究成果MammalianWTAPIsaRegulatorySubunitoftheRNAN6-Methyla