【课件】2.2.2动物细胞工程课件高二下学期生物人教版选择性必修3

第2节

动物细胞工程02植物细胞工程的应用ZHIWUXIBAOGONGCHENGDEYINGYONG

02动物细胞融合技术与单克隆抗体DONGWUXIBAORONGHEJISHUYUDANKELONGKANGTI

教学目标1.阐明动物细胞培养的条件和过程。2.简述干细胞在生物医学工程中有广泛的应用价值。3.阐明利用动物细胞融合技术制备单克隆抗体的过程,认同单克隆抗体在临床上有重要的应用价值。4.阐明利用动物体细胞核移植技术克隆动物的过程和该技术的应用前景。本节聚焦1.什么是动物细胞融合技术?2.单克隆抗体是如何制备的?

在临床上有哪些应用?

我们知道，运用植物体细胞杂交技术，可以跨越不同种植物之间生殖隔离的屏障，培育出新的作物类型。那么，有没有技术能让不同种动物的体细胞进行杂交，培育出集不同细胞的优势于一身的动物细胞呢?

动物细胞融合技术就是指两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的技术。利用诱导剂诱导动物细胞融合。（1）自然发生：

受精卵（2）人工诱导：1.动物细胞融合概念一、动物细胞融合技术2.诱导动物细胞融合的常用方法：物理法：电融合法化学法：聚乙二醇（PEG)融合法生物法：灭活的病毒诱导法

（仙台病毒——应用最为广泛）一、动物细胞融合技术病毒的灭活灭活是指用物理或化学手段使病毒失去感染能力，但是并不破坏病毒的抗原结构。仙台病毒紫外线灭活丧失感染活性（不感染细胞）保留融合活性（诱导细胞融合）灭活病毒诱导细胞融合的原理病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能够与细胞膜上的糖蛋白发生作用，使细胞互相凝聚，细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。3.动物细胞融合过程一、动物细胞融合技术3.细胞融合的过程一、动物细胞融合技术两亲本细胞相互接触接触的细胞因细胞膜磷脂分子和蛋白质分子的运动而融合4.动物细胞融合的原理细胞膜的流动性

正在融合的鸡血细胞正在融合的淋巴细胞与骨髓瘤细胞一、动物细胞融合技术5.融合实质及完成的标志____________________6.应用①细胞融合技术已经成为研究_________、_________、_____和_________________等的重要手段。②利用动物细胞融合技术发展起来的__________，为_______________开辟了新途径。细胞核的融合细胞遗传细胞免疫肿瘤培育生物新品种杂交瘤技术制造单克隆抗体一、动物细胞融合技术7.植物体细胞杂交和动物细胞融合比较植物体细胞杂交动物细胞融合原理细胞融合前的处理方法诱导细胞融合的方法细胞融合成功的标志主要用途意义细胞膜具有一定的流动性植物细胞的全能性细胞膜具有一定的流动性用果胶酶和纤维素酶去除细胞壁用胰蛋白酶或胶原蛋白酶使细胞分散成单个细胞电融合法、离心法、聚乙二醇（PEG）融合法、高Ca2+-高pH融合法PEG融合法、电融合法、灭活病毒诱导法再生出细胞壁细胞核的融合获得完整的杂种植株主要用于制造单克隆抗体打破生殖隔离，实现远缘杂交育种，培育植物新品种。突破了有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能。1.抗体是机体受抗原刺激后产生的、并能与该抗原发生特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。抗体如何识别抗原？二、单克隆抗体及其应用2.体液免疫流程3.传统的获取抗体的方法长期以来，人们为了获得抗体，采用的方法是把某种抗原反复注射到动物体内，使动物产生抗体，然后从动物血清中分离出所需的抗体。用这种方法获得的抗体，不仅产量低，而且抗体的特异性差，纯度低，反应不灵敏。P49二、单克隆抗体及其应用为了解决这一难题，科学家们进行了多年的研究和探索。他们发现，哺乳动物感染病原体（如病毒、细菌等）后，体内会形成相应的B淋巴细胞。B淋巴细胞能分泌抗体，凝聚或杀死这些病原体。动物在免疫反应的过程中，体内产生的特异性抗体种类可多达百万种以上，但是每一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体。4.一个美丽的发现二、单克隆抗体及其应用5.单克隆抗体定义：

生物体内有上百万种B淋巴细胞，而每一种B淋巴细胞只产生一种特异的抗体。由一个B淋巴细胞增殖形成的细胞群所产生的单一型抗体分子就称为单克隆抗体（monoclonalantibody）。二、单克隆抗体及其应用B淋巴细胞与抗体（2）动物体内的B淋巴细胞可以产生百万种以上的抗体，每种抗体对特定的抗原具有特异性免疫作用。（1）B淋巴细胞受抗原刺激后，可以产生抗体。（3）每一个B淋巴细胞只能分泌一种特异性抗体。如何提高产量、提高抗体特异性差、纯度低、反应不灵敏的问题呢？二、单克隆抗体及其应用二、动物细胞融合技术与单克隆抗体（二）单克隆抗体及应用AG1234B1B2B3B4B3B3B3B3二、动物细胞融合技术与单克隆抗体（二）单克隆抗体及应用因此，要想获得大量的单一抗体，必须克隆单一的B淋巴细胞，形成细胞群。遗憾的是，在体外培养条件下，一个B淋巴细胞是不可能无限增殖的，怎么样解决这一问题呢？4.一个大胆的设想将能够产生特定抗体的B淋巴细胞和具有无限增殖能量的骨髓瘤细胞融合在一起，形成杂交瘤细胞。那这样就能够提高抗体的产量、同时提高纯度和灵敏性。科勒德国米尔斯坦英国创立抗原选择抗体学说，发明了单克隆抗体技术，因此获得了1984年的诺贝尔生理或医学奖。二、单克隆抗体及其应用怎样才能得到纯的抗体？想要获得单一的纯抗体，就必须从一个B细胞出发。光纯还不行，还要大量，怎么办？让B细胞大量繁殖（克隆）就可以产生大量抗体了。但，有问题：找，什么细胞能无限增殖呢？B细胞是不能无限增殖的，怎么办？癌细胞，只有癌细胞。但它不能产生抗体。二、单克隆抗体及其应用思路就出来了：

癌细胞能无繁殖，但不能产生抗体。B细胞能产生抗体，但不能大量繁殖。融合，只要将两个细胞融合即可互补。二、单克隆抗体及其应用二、单克隆抗体及其应用5.制备单克隆抗体的过程p49图2-16从细胞培养液或小鼠腹水中获取大量的单克隆抗体。5.制备单克隆抗体的过程注射特定的抗原多种B淋巴细胞骨髓瘤细胞诱导融合①

未融合的细胞②

多种杂交细胞动物细胞融合B淋巴细胞-B淋巴细胞骨髓瘤细胞-骨髓瘤细胞B淋巴细胞-骨髓瘤细胞①

未融合的细胞②

多种杂交细胞杂交瘤细胞抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞（能产生特定抗体的杂交瘤细胞）用特定的选择培养基第一次筛选克隆化培养、抗体检测第二次筛选（可进行多次）注射到小鼠腹腔内体外培养获取单克隆抗体从小鼠腹水中从细胞培养液中动物细胞培养①未融合的细胞

②多种杂交细胞杂交瘤细胞抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞（能产生特定抗体的杂交瘤细胞）用特定的选择培养基第一次筛选克隆化培养、抗体检测第二次筛选（可进行多次）注射到小鼠腹腔内体外培养获取单克隆抗体从小鼠腹水中从细胞培养液中注射特定的抗原多种B淋巴细胞骨髓瘤细胞诱导融合动物细胞融合动物细胞培养（1）该过程中应用到的技术__________________________（2）原理____________________________（3）注射特定抗原的目的____________________________________________________________________________________（4）诱导融合的方法_______________________________动物细胞特有的为______________动物细胞融合、动物细胞培养细胞膜具有一定的流动性、细胞增殖用特定的抗原对小鼠进行免疫，并从该小鼠的脾中得到能产生特定抗体的B淋巴细胞。PEG融合法、电融合法、灭活病毒诱导法*不是为了得到抗体！灭活病毒诱导法思考：只考虑两两融合，诱导融合之后，一定会得到所需的杂交瘤细胞吗？未融合的亲本细胞两两融合的细胞融合的具有同种核的细胞融合的杂交瘤细胞B-B细胞瘤-瘤细胞（5）第一次筛选的目的__________________________（6）如何筛选____________________________（7）筛选原理____________________________________________________________________________________（8）杂交瘤细胞的特点____________________________筛选获得杂交瘤细胞用特定的选择培养基进行筛选在选择培养基上，未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长。既能迅速大量繁殖，又能产生抗体补充了解——HAT选择培养基的筛选原理①

细胞合成DNA有两条途径，正常细胞内两种途径都有，若全合成途径被阻断，可以通过补救合成途径合成DNA；②

骨髓瘤细胞不能合成转化酶和激酶，因此只能进行全合成途径；③

全合成途径能被氨基喋（dié）呤（A）阻断；④

次黄嘌呤（H）、胸腺嘧啶（T）是补救合成途径的原料；⑤

无增殖能力的细胞在培养基中存活仅5-7天，细胞的多聚体也容易死去。将诱导融合后的细胞接种于HAT培养基后两周，则细胞生存状况及原因为：B细胞和B-B细胞________________________________________骨髓瘤细胞和瘤-瘤细胞__________________________________________杂交瘤细胞_____________________________________________死亡；能进行补救合成途径，但是无增殖能力；死亡；两种途径均无法进行，无法合成DNA，无法增殖；存活；能进行补救合成途径，能合成DNA，可大量增殖。思考：得到的杂交瘤细胞一定是所需的吗？

杂交瘤细胞并不纯，因为从脾脏获得的B淋巴细胞不纯（既有未免疫的B淋巴细胞，又有产其他抗体的B淋巴细胞，以及能产所需抗体的B淋巴细胞），因此要进行第二次筛选。（9）第二次筛选的目的________________________________________________________（10）如何筛选____________________________________________________________________________________（11）选择抗体检测呈___性的杂交瘤细胞，即_______________________（12）抗体检测原理__________________________________获得足够数量的能分泌所需抗体的杂交瘤细胞用96孔板培养，在每一个孔中尽量只接种一个杂交瘤细胞的情况下，进行克隆化培养和抗体检测（进行多次筛选）阳分泌的抗体能与特定的抗原结合抗原和抗体能够特异性结合(分子水平的鉴定）补充了解——克隆化培养和抗体检测★有限稀释法每一个孔中尽量只接种一个杂交瘤细胞侧面模拟图克隆化培养一段时间取上清液进行抗体检测补充了解——不同水平的克隆及实例分子水平细胞水平个体水平DNA复制、PCR技术动物细胞培养植物组织培养、动物细胞核移植思考：单克隆抗体的制备涉及什么水平的克隆？细胞水平（13）如何获取大量所需杂交瘤细胞________________________________________________________（14）如何获取单克隆抗体①体外培养____________________________②小鼠腹腔内培养____________________________（15）单克隆抗体的优点______________________________________________________________在体外条件下大规模培养（接种于培养液中）或注射到小鼠腹腔内增殖从细胞培养液中获取从小鼠腹水中获取能准确地识别抗原的细微差异，与特定抗原发生特异性结合，并且可以大量制备。思考：试比较两次筛选的原因、方法和结果第一次筛选第二次筛选原因方法结果诱导融合后得到的细胞中，除杂交瘤细胞之外，还有未融合的亲本细胞，也有融合的具有同种核的细胞。由于小鼠在生活中还受到其他抗原的刺激，所以经第一次筛选之后获得的杂交瘤细胞中有能产生其他抗体的细胞。用特定的选择培养基进行筛选用96孔板培养，在每一个孔中尽量只接种一个杂交瘤细胞的情况下，进行克隆化培养和抗体检测（进行多次筛选）筛选获得杂交瘤细胞获得足够数量的能分泌所需抗体的杂交瘤细胞

第二次筛选：在“多孔培养板上”培养杂交瘤细胞系列，每孔只放一个杂交瘤细胞。“克隆化培养”每个杂交瘤细胞，并进行“单一抗体检测”，“检测阳性”的孔内即是所需要的杂交瘤细胞。注意分离B淋巴细胞（B）；找到骨髓瘤细胞（G）。注意B淋巴细胞是一个系列。（B1,B2,B3,---Bn）细胞融合——三种融合方式:（BB；BG；GG）

第一次筛选：在“选择培养基培养”上培养筛选杂交瘤细胞（只有BG杂交瘤细胞存活。但BG杂交瘤细胞也是一个系列：如B1G,B2G---BnG。而BB,GG在此培养基上不能存活。）二、单克隆抗体及其应用（3）为何要进行两次筛选？（4）如何进行第2次筛选？培养在多孔培养板上，每孔只有一个杂交瘤细胞。第1次筛选得到杂交瘤细胞（多种）。第2次筛选得到能产生特异性抗体的杂交瘤细胞群。问题强化：（1）本过程利用了哪些原理？免疫原理，细胞融合原理和动物细胞培养原理（2）为什么选用小鼠骨髓瘤细胞与B细胞融合？这样融合成的杂交瘤细胞，继承了双亲细胞的遗传物质，不仅具有B细胞分泌抗体的能力，而且还有无限增殖的本领，因而可以获得大量单克隆抗体。二、单克隆抗体及其应用

19世纪30年代，科学家曾在患肺结核、天花和麻疹等疾病的病人的病理组织中观察到多核细胞。如何解释这一现象?旁栏思考p49

病人体内的病毒等诱导多个体细胞融合形成了多核细胞。二、单克隆抗体及其应用二、单克隆抗体及其应用单克隆抗体的应用

资料1用抗人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体做成的“早早孕诊断试剂盒”，在妊娠第8天就可以作出诊断，这比原来的诊断方法提前了10d左右，可以避免孕妇在不知道妊娠的情况下因服用药物而对胎儿造成不利影响。该方法检测的准确率在90%以上。

资料2使用高效的细胞毒素类药物进行化疗可以有效杀伤肿瘤细胞。但细胞毒素月满西楼:没有特异性，在杀伤肿瘤细胞的同时还会对健康细胞造成伤害，这限制了它在临床上的应用。抗体一药物偶联物（antibody-drugconjugates,ADC)通过将细胞毒素与能特异性识别肿瘤抗原的单克隆抗体结合，实现了对肿瘤细胞的选择性杀伤。ADC通常由抗体、接头和药物（如细胞毒素）三部分组成，它的作用机制如下图所示。二、单克隆抗体及其应用

单抗隆抗体的应用（1）ADC的抗体和药物各具有什么作用?（2）除了细胞毒素,还有哪些物质理论上可以作为ADC偶联的药物?（3）单克隆抗体诊断试剂盒和ADC在临床应用上各具有什么优势?（4）单克隆抗体在临床上还有哪些应用？你可以课后搜集资料,然后以“单克隆抗体在临床上的应用”为主题,出一期黑板报或制作电子板报宣传相关知识。

（1）ADC的抗体和药物各具有什么作用？

抗体主要发挥靶向运输作用，即通过特异性结合靶细胞表面的抗原，将连接的药物输送到靶细胞;药物发挥治疗效应，如杀伤靶细胞。（2）除了细胞毒素，还有哪些物质理论上可以作为ADC偶联的药物？

可以用放射性同位素标记单克隆抗体进行靶向放疗。一些作用于细胞信号转导通路的药物可以通过阻断肿瘤细胞的信号通路来抑制其生长，理论上也可以将这些药物与单克隆抗体结合进行治疗。（3）单克隆抗体诊断试剂盒和ADC在临床应用上各具有什么优势？

单克隆抗体诊断试剂盒中的单克隆抗体只与特定的抗原反应，因此检测的特异性和灵敏度大大提高；生产单克隆抗体的杂交瘤细胞可以传代培养、冷冻保存和复苏利用，有利于控制产品的质量和标准化生产诊断试剂盒。ADC能够协同发挥抗体特异性识别的靶向作用和细胞毒素对肿瘤细胞的杀伤作用，因此它在临床上具有靶点清楚、毒副作用小等优点。

（4）单克隆抗体在临床上还有哪些应用？你可以课后搜集资料,然后以“单克隆抗体在临床上的应用”为主题,出一期黑板报或制作电子板报宣传相关知识。

单克隆抗体在临床上的应用涉及治疗、诊断等方面。

单克隆抗体药物已被广泛用于肿瘤、自身免疫病等疾病的治疗，如利妥昔单抗被用于治疗复发难治的低分化B细胞淋巴瘤；曲妥珠单抗被用于治疗乳腺癌等。在临床诊断方面，单克隆抗体被广泛用于一些感染性疾病的检测、肿瘤的诊断、激素和细胞因子的测定等。以单克隆抗体在诊断肿瘤方面的应用为例，用放射性同位素或荧光标记抗肿瘤表面抗原的单克隆抗体，可以用这些抗体来对体内的肿瘤进行定位，辅助诊断并确定肿瘤的复发与转移等。

单克隆抗体能准确地识别抗原的细微差异，与特定抗原发生特异性结合，并且可以大量制备，因此被广泛用作诊断试剂，在多种疾病的诊断和病原体鉴定中发挥重要的作用。例如,利用同位素或荧光标记的单克隆抗体在特定组织中成像的技术，可定位诊断肿瘤、心血管畸形等疾病。除前面介绍的单克隆抗体可以运载药物外，单克隆抗体自身也能用于治疗疾病。在医药领域，单克隆抗体药物占有非常重要的地位。2015年，全球销售额排名前十位的药物中，单克隆抗体药物就有5种。同年,，我国的单克隆抗体药物市场规模已达72亿元。二、单克隆抗体及其应用单克隆抗体的应用（1）作为诊断试剂——最广泛的应用

准确、高效、