第七章-花药和花粉培养

第七章花药和花粉培养一、概述（一）概念花药培养:把发育到一定阶段的花药接种在人工培养基上,使其中的花粉发育成单倍体植株的过程.花粉培养(小孢子培养):从花药中分离出花粉粒,使之成为分散的或游离状态,通过培养使花粉粒脱分化,进而发育成完整植株的过程.花药培养和花粉培养是获得植物单倍体的有效方法之一二倍体(diploid)植物其单倍体（haploid）即一倍体（monoploid）如，玉米2n=2x=20n=x=10；水稻2n=2x=24n=x=12四倍体(tetraploid)植物其haploid为dihaploid如，马铃薯2n=4x=48，n=2x=24六倍体(hexaploid)植物其haploid为triploid如，普通小麦2n=6x=42，n=3x=21八倍体(octoploid)植物其haploid为tetraploid如，草莓2n=8x=56，n=4x=28单倍体(haploid)——指具有配子染色体数的植物个体.

体细胞染色体数减半；单倍体植物与二倍体相比较，有三个明显的特点：

生长发育弱，体形小、各器官明显减小；

雌雄配子严重败育，有的甚至不能进入有性世代。

（二）花药或花粉培养在作物育种中的作用：供体植株小孢子（N）花粉培养花粉植株（N）雄核发育自然加倍人工加倍纯合植株（2N）（1）缩短育种年限：常规育种需4-6年获得纯系，而小孢子培养仅需1-2年。一年内获得纯系例：二倍体供体植株基因型为AaBb，若要从后代中选择基因为AAbb的纯合单株常规方法：AAbb出现的概率为1/16，并且不能将AAbb与Aabb、aAbb区分开。

（2）提高了目标基因型的选择效率

AB

aB

Ab

abAB AABB AaBB AABb AaBbaB aABB aaBB aABb aaBbAb AabB AabB AAbb

Aabbab aAbB aabB aAbb aabb例：二倍体供体植株基因型为AaBb，若要从后代中选择基因为AAbb的纯合单株单倍体方法：AAbb出现的概率为1/4。

单倍体

二倍体

AB-------------------------->AABB

aB---------------------------->aaBB

Ab---------------------------->AAbb ab---------------------------->

aabb供体亲本AaBb花粉培养

（2）提高了目标基因型的选择效率

植株不受显隐性的影响，在诱变育种中能在当代及时获得突变个体，加倍后成为稳定的纯系。

（3）诱变育种中的作用

（4）利于筛选隐性突变体提高诱变效率

（5）利于获得优良植株

花药的结构及花粉管的形成花药的结构及花粉粒的发育2NN减数分裂

四分体4个单核花粉粒（细胞壁薄、细胞质浓、核位于细胞中央）

营养细胞（大）单核花粉粒（单核靠边期）（两者仅以质膜相隔）精细胞生殖细胞（小）有丝分裂

（2-细胞花粉粒）精细胞

(3-细胞花粉粒）双核早期（三）花药培养与花粉培养的异同点培养目的相同，均获得小孢子植株。花药培养属于器官培养；而花粉培养属于细胞培养。花粉培养没有药壁组织干扰，单倍体产量高，但技术难度大。花药:植物的雄性生殖器官(器官培养)花粉:由花药中的花粉母细胞经减数后形成的单倍体细胞(细胞培养).（一）研究历史：首先报道通过花药培养获得单倍体植株成功的是印度学者Guha和Maheshwari(1964,1966)。1996年的统计数据表明,已有至少250多种植物花药培养成功。

花药培养获得单倍体的技术途径已在禾本科作物、茄科作物、十字花科作物的育种中广泛应用。二、花药培养技术（二）花药培养的基本程序是：外植体选择－适当的预处理—剥取花药、接种、培养—形成花粉植株—花粉植株的染色体加倍—炼苗移栽外植体的选择：供试材料的遗传背景，供试材料的生理状态，花粉的发育时期等。1、外植体的选择1）适宜的基因型2）适宜的生理状态：幼年、生长健壮、大田生长条件下的花药诱导频率相对要高3）花药中花粉的发育时期：单核花粉粒时期

四分体4个单核花粉粒（细胞壁薄、细胞质浓、核位于细胞中央）

营养细胞（大）单核花粉粒（单核靠边期）（两者仅以质膜相隔）精细胞生殖细胞（小）有丝分裂

（2-细胞花粉粒）精细胞

(3-细胞花粉粒）双核早期

选择花药时，一般通过镜检来确定其中的花粉是否处于适宜的发育期。最常用的方法有醋酸洋红法。但是，某些植物的花粉细胞核不易着色，需采用焙花青-铬矾法，这种方法能将花粉细胞核染成蓝黑色。

为便于快速判断并获取适宜发育时期的花药培养材料，常采用染色法集合外部形态对比观察方法2、预处理低温预处理：不同材料对低温的温度及处理时间是不同的其它预处理方法：离心预处理、乙烯利预处理、高温预处理处理的目的：增强花粉粒细胞的同步化3、在适宜的条件下培养花药1）消毒、剥取花药：避免花药受到损伤，因为损伤常会刺激花药壁组织的发育，形成二倍体的愈伤组织。2）接种培养

花药培养常用的培养基：

N6：高硝态氮，低铵态氮，广泛用于禾本科植物的花药培养

B5、MS、White、Nitch等。

C17（王培等，1986）：适于小麦花药培养，提高出愈率。激素：相对较低的激素水平蔗糖：碳源；调节培养基渗透压，一般用量2-3%

番茄花药培养对蔗糖浓度的诱导反应蔗糖浓度2％3％4％6％10％13％

17％

诱导频率5％10％12％18％25％45％

8％温度柑橘在20°C以下，完全不能形成胚状体，且愈伤组织形成亦很少，当将温度提高到21～25°C时便会有胚状体形成，而当温度提高到26°C以上时又完全不能形成胚状体。油菜若将接种后的花药在30°C条件下培养2～3天，可显著提高花粉胚的形成率，小麦在33°C条件下培养3～5天，可提高成愈率和绿苗率光照：先弱后强培养方式液体培养：液体悬浮，或添加有利花粉胚悬浮的基质（如30%ficoll)双层培养：固体-液体双层培养花药花粉分步培养：条件培养：利用预先培养过花药的液体培养基进行花药培养，可使花药培养的效率大大提高。

1）胚状体发育途径：小孢子经历胚发生的各个阶段，最后子叶展开，形成花粉植株。4、花粉植株的形态发生烟草花药培养——通过胚状体途径再生形成小植株

1）胚状体发育途径：小孢子经历胚发生的各个阶段，最后子叶展开，形成花粉植株。2）愈伤组织发育途径：小孢子分裂数次形成愈伤，再分化形成花粉植株。此途径产生的植株会出现变异且倍性复杂。2）、花粉植株的形态发生方式5、单倍体植株鉴定和染色体加倍单倍体植株的鉴定1）形态学鉴定2）染色体分析单倍体植株的二倍化：0.02-0.4%的秋水仙素愈伤组织转接种到再生培养基愈伤组织分化形成再生植株部分花药产生愈伤组织接种在平板上的水稻花药水稻花药培养的愈伤化发生途径三、花粉培养（一）花粉培养的优势1）花粉培养可以排除花药培养中药壁、药隔和花丝等体细胞的干扰；2）花粉数量多，培养需要的器皿和空间较小；3）花粉具有单细胞性、单倍性和较高的同步性。（二）花粉培养技术1、取材时期：四分体时期到单核早期。2、花粉的分离：3、小孢子纯化：对获得的小孢子混合物进行分级过筛、梯度离心处理纯化小孢子4、花粉的培养1）自然散落法(漂浮培养自然释放法)：将花药接种在预处理液或液体培养基上，待花粉自动散落后，收集培养。2）机械游离法

a.磁搅拌法：用磁力搅拌器低速搅拌培养液中的花药，使花粉游离出来；

b.挤压法：在烧杯或研钵中挤压花药，将花粉挤出后收集培养。花粉培养方法1、直接培养：花粉置琼脂固化培养基上培养。2、预培养：花药在液体培养基中先培养2-4d，然后挤出花粉，经离心洗涤后悬浮于液体培养基中培养。3、双层培养：先铺一层琼脂固体培养基（加入失活花药的浸提液），凝固后，在其上接种密度为1*104的花粉悬浮液，接种量以1mm层厚为宜。4、看护