一份猪链球菌病的病例报告

猪链球菌病的病例报告发病情况2014年1月20日，天气寒冷，阴雨，气温降低到2°C。某猪场断奶仔猪和育肥猪突然出现发烧、咳嗽、关节肿大、跛行等,体重多为35~55kg,该场兽医技术人员给病猪投喂阿莫西林、青霉素460万IU+链霉素1g头,连续3d,症状未见明显好转，到25日龄时，共发病仔猪23头，育肥猪8头，死亡6头，死亡率19.35%。经询问畜主了解到该场注射了猪伪狂犬病、猪蓝耳病、猪瘟和口蹄疫疫苗，未注射其他疫苗。临床症状猪链球菌病的类型猪链球菌病是一类病，临床常见的有四种类型，分别为化脓型、全身败血型、脑膜炎型和关节炎型。（1）化脓型链球菌化脓型链球菌是由E群链球菌感染引起，感染猪多表现全身组织器官的化脓，本类菌感染后一般在局部定植，免疫系统识别后，白细胞会通过趋化性向感染部位游走，特别是嗜中性白细胞，能将病原菌很快吞噬，同时自身也死亡裂解，化作脓细胞，引发脓肿。初期多见于下颌和咽喉部位的淋巴结，后期随着病原的迁移会引发其他部位的脓肿。（2） 败血型链球菌败血型链球菌以C群兽疫链球菌发病最多，感染猪后会在感染部位先行增殖，数量达到一定程度后会随血流到达全身，形成全身感染，之后不断分泌毒素，毒素入血后对血细胞造成破坏作用，引发全身性贫血，同时病灶不断扩散，造成全身组织器官的病变。病猪表现突然发病，体温上升到41〜42C范围内，全身衰弱，精神萎靡，采食量下降，皮肤发紫伴有出血点，可视黏膜发绀，部分猪腹泻，有的病猪表现呼吸急促，呈现腹式呼吸，黏液性鼻漏，常卧地不起，死亡率较高。（3） 脑膜炎型链球菌脑膜炎型链球菌感染通常由C群链球菌引起，多发于2月龄以内的仔猪，链球菌能损伤血脑屏障，对脑组织神经细胞造成破坏。病猪体温升高，一般在40〜42.5C，神经症状明显，全身颤抖，共济失调，原地转圈或倒走，有的嘴里出现不自主磨牙，猛力拍打背部病猪可蛙跳，后期出现四肢麻痹，无法行走，侧躺于地，四肢作游泳样动作，最终死亡。（4）关节炎型链球菌 关节炎型链球菌对关节部位有特殊的亲嗜性，特别是肘关节、膝关节和趾关节，能对关节滑膜造成损害，并引发黏液分泌的减少，初期表现行走姿势改变，跛行，后期关节炎性反应剧烈，局部肿大，行走困难，影响采食和饮水，体质越来越弱，在猪群中的地位也越来越低，易受其他猪的攻击，最终衰竭而死。临床诊断病猪表现复杂，多种类型都并存。病猪精神沉郁，食欲废绝，发烧、体温在41C以上，怕冷，眼结膜潮红，眼睑水肿，流泪，鼻腔内流出黏性和脓性分泌物.呼吸困难，皮肤发红，耳朵、腹部、后肢内侧等处有红色斑点.有5头病猪关节肿大，跛行，3头猪出现神经症状，盲目转圈，四肢运动失调，肌肉震颤，头往后仰。有3头猪后期并发脑炎症状，颈部强直、角弓反张，坐卧或瘫卧姿态。有4头猪类便拉稀，灰白色。病理变化剖检病猪3头，淋巴结肿大、充血，特别是颌下、咽部、颈部淋巴结病变明显，关节可见淡黄色化脓性渗出物;浆膜有浆液性炎症变化，脑膜炎病猪病变为脑膜充血、出血，脑膜程度不同地有弥散性出血点;心内膜红肿，心包积液:脾肿大，脾包膜上有纤维素沉着，表面和边缘有梗死灶:肝瘀血肿大，胆汁黏稠，肺部充血肿胀，膨隆有大量出血点，并有脓样小结节，间质性肺炎，支气管纤维素性炎症，气管内有黏液性分泌物。实验室诊断根据流行特点、临床诊断和病理剖解，以及以往流行病史，初步确定为链球菌。为进一步确诊，采集肺、心、肝、血液等病料，染色镜检，可见单个、成对、长串链状的革兰氏阳性球菌，并进行了细菌分离、培养鉴定和生化试验。为有针对性选择药物、进行了药敏试验。4.1染色镜检根据不同的病型采取不同的病料。败血型病猪，无菌操作采集新鲜的病死猪的心、肝、脾、肾和肺等病料，1-2厘米见方大小，放入干净自封袋或容器内，无泄漏包装，尽快冷藏运送到实验室。淋巴结脓肿型病猪，可用无菌注射器吸取未破溃的淋巴结脓肿内的脓汁。脑膜炎型病猪，无菌采取脑脊髓液及少量脑组织。实验室诊断可用采集的病料直接涂片染色镜检，即用病猪的组织或血液或脓汁直接涂片，姬姆萨染色镜检：心血涂片可见单个或成对的圆或椭圆形球菌，有的形成短链,有的形成长链。肝、脾或脑组织等脏器组织的触片中，镜检可见以单球菌与双球菌居多，短链较少。姬姆萨染色：涂片或触片置于空气中自然干燥后，滴数滴姬姆萨染色液于片上，经1-2分钟后，再加与染液等量的蒸馏水，使与染液混匀，5分钟后用水冲洗，自然干燥后镜检。细菌分离培养无菌采取疑似链球菌病死猪肝、肾或关节囊液（关节炎型）或化脓组织分别在鲜血琼脂平板上划线分离培养,37°C培养24小时。涂片，经革兰染色后镜检，可见紫色短链球形或卵圆型细菌，单个或成对排列，无芽孢，有的有荚膜。革兰染色（1）涂片:在载玻片上滴一滴生理盐水，然后左手拿平板右手持接种环，挑取当个菌落涂片。（2）干燥:涂片后在室温下自然干燥，也可在酒精灯上略加温，使之迅速干燥，但勿靠近火焰。（3）固定:常用高温进行固定。即手持载玻片一端，标本面朝上，在灯的火焰外侧快速来回移动3~4次，共约3~4秒。要求玻片温度不超过60C,以玻片背面触及手背皮肤不觉过烫为宜，放置待冷后染色。（4）染色：a.初染：加草酸铵结晶紫一滴，约一分钟，水洗。b.媒染：滴加碘液冲去残水，并覆盖约一分钟，水洗。c.脱色：将载玻片上的水甩净，并衬以白背景，用95%酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现紫色时为止，约20-30秒，立即用水冲净酒精。d.复染：用番红液染1-2分钟，水洗。e.镜检：干燥后，置油镜观察。生化鉴定以无菌操作将分离菌于生化糖发酵管做穿刺接种，37°C培养24~28h后观察结果。葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、水杨苷、精氨酸试验阳性，甘露醇、阿拉伯糖、菊糖、木糖、山梨糖、鼠李糖、肌醇、6.5%氯化钠、淀粉、甘油试验阴性。与链球菌的生化特性相符，说明该分离菌为链球菌。ELISA法（1） 采样方法采用前腔静脉采血，采血部位位于左右两侧的颈静脉与腋静脉至第1对肋骨间的胸骨柄汇合处。首先对猪采血部位进行剪毛，用5%碘酒消毒后再用75%的酒精消毒，待皮肤干燥后采血，整个采血过程均为无菌操作，采用未添加抗凝剂的普通采血管进行采集。（2） 血清样品制备对于采集好的血液，在环境温度较高的采样地区，静置于室温6〜8h；在环境温度较低的采样地区，于37C培养6〜8ho待血清析出后再于3000r/min离心5〜10min,无菌操作将血清分离分装于1.5mL已灭菌的离心管内，-20C保存待检。（3） 血清ELISA抗体检测试验准备。分别将待检血清和检测试剂盒从冰箱内取出置于室温预热待血清完全溶化后，用混样仪将血清充分混合均匀。洗涤液和稀释液按照检测试剂盒说明书要求配好备用。加样。根据样本数量，取所需板条。每板设阴、阳性各2孔，分别加入阴、阳性对照血清100ML。其余孔加入99pL样本稀释液，设2孔为空白对照，加入已灭菌的超纯水；其它为样品孔加入1pL样品。温育。加样后，盖板膜，猪链球菌病检测反应板置于37C温育30min。洗板。甩去孔内液体，按照说明书要求设定好程序进行洗涤。加酶。洗涤完成后，拍干净孔内剩余液体，每孔加酶标记物100pL。温育。检测反应板置于37C温育30min。洗板。甩去孔内液体，按照说明书要求设定好程序进行洗涤。显色。每孔加显色剂A、B各50pL,振荡混匀，检测反应板置于37C避光反应15min。终止。显色完成后，每孔加终止液50pL，充分振荡混匀，终止后即读数。读数。猪链球菌病抗体检测反应板于450nm/630nm双波长检测，读取各孔吸光度值(OD值)。2.4结果判定根据试剂盒说明书判断标准要求,当样品OD值±0.35时判为阳性，样品OD值＜0.3时判为阴性，当0.3W0D值V0.35时为可疑。溶血试验将菌落接种于5%兔鲜血平板，37°C培养24h后观察。a溶血:细菌在血平板上培养时，菌落周围形成的狭小(l~2mm)、草绿色溶血环。a溶血环中的红细胞未完全溶解。可形成a溶血环的细菌如甲型溶血性链球菌、肺炎链球菌。B溶血:细菌在血平板上培养时，菌落周围形成的宽大(2~4mm)、界限分明、完全透明的溶血环。B溶血环中的红细胞完全溶解。可形成B溶血环的细菌如乙型溶血性链球菌、金黄色葡萄球菌等。Y溶血:就是不溶血。溶血试验可以进一步确定链球菌的致病性强弱。4.6药敏试验[1]将分离菌株大量接种于鲜血琼脂平板上，用灭菌的镊子夹取直径为6mm浸有下列药物的干燥滤纸片分别贴于平皿培养基的表面,各纸片中心相距约24mm,纸片距平皿边缘约15mm,置37C温箱内培养24小时，分别测定抑菌环大小。判定标准为抑菌环直径在15mm以上为高度敏感、10~15mm为中度敏感、10mm以下为低度敏感，无抑菌环为不敏感。PCR鉴定[2]DNA的提取从鲜血琼脂平板上挑取链球菌单菌落接种于含5%新生牛血清的THB培养基，37'C摇床培养18-24h。取细菌培养物1.5mL于EP管中，12000rpm离心2min,浓缩菌液2-3次。沉淀用TE缓冲液567》L重悬，加10%SDS30uL和20mg/ml蛋白酶K35uL,混匀，37C水浴1h,加人5mol/LNaCl100uL充分混匀，再加人CTAB/NaCI溶液80uL混匀,65C水浴10min,加等体积的酚/氯仿/异戊醇(25:24:1),混匀，12000rpm离心5min,吸上清，转移到新EP管中，加0.6体积的异丙醇，12000rpm离心10min,弃上清，沉淀用70%乙醇1mL洗两次，弃上清，室温放置使乙醇挥发干净，加100uLddH20溶解沉淀，所得溶液即为DNA模板。PCR反应PCR反应体系为25uL:lOxPCRbuffer(含Mg2*)2.5uL,lOpMdNTP1|JL,模板1|JL,TaqDNA聚合酶0.25uL(1U),上下游引物(50umol/L)各0.5uL,加ddH2O定容至25uL.反应条件为94C预变性5min;94C60s,52.5〃C60s,72C90s,30个循环，最后72C延伸lOmin。PCR产物电泳50XTAE取10ml稀释成500ml,取50ml溶解0.5g琼脂糖。电炉上煮沸后加入EB5ul。另外450mlTAE倒入电泳槽中。用透明胶封闭电泳板，琼脂糖溶液冷却至温热时，倒入带梳子的电泳板中，冷却后，拔出梳子，放入电泳槽中。力口样：PCRMarker：lulMarker+lulLoadingBuffer+4ulTAE混匀于塑料膜上，加入孔中。PCR样品：5ul样品DNA+lulLoadingBuffer混匀后依次加入孔中。接上电源，电压120V，电流50mA进行电泳。电泳约1小时后，紫外灯检测。4.6多重PCR反应[2]参考上述PCR反应体系中PCRbuffer(含Mg2+)、TaqDNA聚合酶的用量，将dNTP和模板的量适当提高，重点优化3种引物之间的比例和退火温度。先建立并优化单个靶基因PCR检测体系，继而进行多重PCR体系组合和条件优化。固定EF引物的用量，改变另外两引物的比例。优化的PCR反应体系为：10xPCRbuffer(含Mg"*)5uL,2.5mmol/LdNTP3uL,10umol/L上下游引物Sly0.6uL,MRP、EFL|物各1.0uL,DNA模板1.5pL,TaqDNA聚合酶0.25uL(1U),加ddH2O定容至50uL.扩增参数：94C预变性5min,94C50s,50.3C60s,72C90s,35个循环，最后72C延伸10min.此条件下，三种毒力基因均可获得有效特异的扩增。治疗对于败血型的猪链球菌病病猪，采用药物进行治疗，药物选择3X104U的青霉素、30mg磺胺类,2次/d，连续治疗4d；对于关节炎型猪链球菌病病猪，将青霉素、庆大霉素和适量的氨基比林加以混合之后注射，2次/d；对于脑膜炎型病猪，用磺胺类药物进行治疗，同时给予强心和补液；对于重症的病猪，可静脉注射生理盐水、葡萄糖和VC,1次/d，连续治疗3d。在初次注射时，可以适当增加剂量，待病猪病情好转之后再将剂量减少。对于新生的仔猪，用小诺霉素与柴胡混合药物进行注射治疗；若仔猪存在神经症状，按照1：1的比例利用等渗盐水将增效磺胺钠稀释后注射;若病猪处于刚刚断奶的阶段，可用氯丙嗪或者恩诺沙星和柴胡的混合药物进行注射治疗［3］。预防措施隔离病猪治疗、对疑是患病猪也进行隔离治疗。淘汰治不好的染病猪。对病死猪进行深埋、发酵、焚烧等无害化处理”。加强饲养管理，降低饲养密度，保证饲料和饮水的质量。饲料要做到不发霉，饮水要做到清洁。改善饲养环境加强猪舍内通风换气保持舍内环境温温度在猪只适宜范围之内。及时清除积粪和打扫圈舍，保持圈舍地面的干净。并定期进行驱虫、灭蚊。灭鼠的工作。清除养猪环境中易引起损伤的因素如针头、碎玻璃、铁片等。减少对猪的各类应激。清除传染源。对患病猪舍加强消毒工作，用卫可，百胜进行消毒。对于发病期间猪所使用的食槽及饲养管理用具以及病猪和带菌猪的排泄物、分泌物进行严格的消毒，切断病毒的传播途径，防止病毒的进一步传染与扩散。药物预防。可在饲料中适当添加一些抗菌素药物，如青霉素、氯霉素、红霉素、磺胺类和头孢类药物。加强检疫监督，严格引种。坚持自繁自养和“全进全出”的饲养方式。完善繁育体系，建立良种繁殖场，解决猪源不足问题。若必须引种-定要从正规的种猪场引种，并经检疫合格后方可引进。科学的免疫程序，种猪在60日龄首次免疫接种猪链球菌病氢氧化铝胶苗以后每年春秋各免疫1次，不论大小猪一律机内成皮下注制5mL/(kg体重),浓缩菌苗注射3mL/(kg体重)，注射后21d产生免疫力，免疫期约6个月或选用链