第2章酶反应的基本原理

第二章酶反应的基本原理提要：一、酶的组成及其结构特点二、酶的催化作用机理三、酶的类型及命名四、影响酶催化反应的因素

1.酶的概念酶：生活细胞产生的具有特殊空间构像的,能进行生物催化作用的生物大分子，包括蛋白质和核酸两类物质，其中以蛋白质为主。一、酶基本知识（1）酶与一般催化剂的共性

用量少，催化效率高不改变反应平衡点可降低反应活化能（2）酶的特性

高效性：以酶的转换数Kcat表示，mol底物/mol酶.min

酶的Kcat为103-107mol底物/mol酶.min，比非酶催化效率高107-1013

倍。

专一性：结构专一性（相对专一性/绝对专一性）立体异构专一性(几何异构/旋光异构)

温和性（不稳定性）：酶催化需要的活化能低，生物大分子，结构稳固性差。

可调控性：底物浓度、温度、pH、抑制剂和激活剂等。

2、酶的聚集方式（1）松散排列酶在细胞中各自以可溶的单体形式存在，彼此没有结构上的联系。反应时酶是随机扩散，催化效率不高。（如糖酵解历程）酶1酶2酶3酶4酶5（2）簇式排列几种酶有机地聚集在一起，镶嵌成一定的结构，形成多酶复合体。催化效率高。（如丙酮酸脱氢酶复合体、脂肪酸合成酶、纤维素酶复合体）（3）与生物膜结合一种结构更高的多酶复合体，酶整齐的排列在生物膜上。催化效率最高。（如呼吸链）酶1酶2酶4酶5酶3

单成份酶：脲酶、蛋白酶、淀粉酶、核糖核酸酶等。（简单蛋白质）双成份酶（结合蛋白质）酶蛋白辅因子（apoenzyme）（cofacter)辅酶（coenzyme)辅基(prostheticgroup)酶3、酶的组成

一级结构二级结构三级结构四级结构4、酶的结构层次维系蛋白质分子的一级结构：肽键、二硫键维系蛋白质分子的二级结构：氢键维系蛋白质分子的三级结构：疏水相互作用力、氢键、范德华力、盐键维系蛋白质分子的四级结构：范德华力、盐键

a盐键（离子键）b氢键c疏水相互作用力d范德华力e二硫键f酯键维持蛋白质结构的作用力氢键、范德华力、疏水相互作用力、盐键，均为次级键氢键、范德华力虽然键能小，但数量大疏水相互作用力对维持三级结构特别重要盐键数量小二硫键对稳定蛋白质构象很重要，二硫键越多，蛋白质分子构象越稳定离子键氢键范德华力疏水相互作用力键作用力性能5、酶的活性基团及活性中心活性中心：结合部位和催化部位结合部位:决定酶的专一性催化部位:决定酶所催化反应的性质。酶活性中心示意图部分酶活性中心的氨基酸残基

酶残基总数活性中心残基牛胰核糖核酸酶124His12,His119,Lys41溶菌酶129Asp52,Glu35牛胰凝乳蛋白酶245His57,Asp102,Ser195牛胰蛋白酶238His46,Asp90,Ser183木瓜蛋白酶212Cys25,His159

弹性蛋白酶240His45,Asp93,Ser188枯草杆菌蛋白酶275His46,Ser221碳酸酐酶258His93-Zn-His95His117

二、酶的催化作用机理1、中间产物学说E+SESE+P

中间产物存在的证据：同位素32P标记底物法（磷酸化酶与葡萄糖结合）；吸收光谱法（过氧化物酶与过氧化氢结合）。SEacabcESE-S复合物b2、诱导契合假说（induced-fithypothesis）酶与底物相互接近时，其结构相互诱导、相互变形和相互适应，进而相互结合。酶AB

3、趋近效应与定向作用（proximityeffect&orientationarrange）底物和酶的活性中心结合在一有限区域内互相接近，趋近效应使底物在活性中心的局部浓度提高数干至数万倍，大大增加底物互相碰撞的机会。

定向即底物和酶的活性中心结合时，可诱导酶蛋白的构象变化，使底物和酶的活性中心更好地互补，并使底物有正确的定向。这样，底物的反应基团更趋近酶的催化基团。这又进一步使反应速度提高几个数量级。

4、底物分子的形变与扭曲张力学说（strain）（1）酶受底物诱导发生构象改变，特别是活性中心的功能基团发生的位移或改向，呈现一种高活性功能状态。

（2）酶活性中心的某些基团或金属离子可改变底物敏感健的电子云分布，产生“电子张力”而易于断裂，也可使底物的构象改变，接近过渡态而易于反应，这就是张力（）学说。

羧肽酶A和溶菌酶的X线衍射分析证明了张力效应是酶催化的机制之一。5、多元催化(multielementcatalysis)多元催化：多个基元催化形式的协同作用。一般包括酸-碱催化，共价催化（亲核催化,亲电子催化）等。如凝乳蛋白酶：Ser-195亲核催化，His-57碱催化等；酸-碱催化：通过暂时提供（或接受）一个质子以稳定过渡态达到催化反应的目的；

广义酸基团广义碱基团pKa

（质子供体）（质子受体）酶活性中心广义酸碱基团溶菌酶酸、碱催化反应示意图共价催化（亲核催化,亲电子催化）：通过催化剂与底物的共价键结合，形成过渡态来加速反应。共价催化具有亲核、亲电过程。亲核催化：分别带有多电子的原子如O、S和N，可以提供电子去攻击底物上相对带正电子的原子（如羰基碳），即所谓的亲核攻击。亲电催化：是由亲电试剂(具有接受电子对的原子)引起的催化反应,是亲核催化的反过程．

酶促反应曲线产物0时间初速度酶促反应速度逐渐降低三、酶促反应动力学影响酶促反应速度的因素底物浓度[S]酶浓度[E]反应温度pH值抑制剂激活剂1、底物浓度对酶促反应速度的影响

vVm0.30.2Vm20.1012345678[S][S]与v关系：当[S]很低时，[S]与v成比例--一级反应当[S]较高时，[S]与v不成比例当[S]很高时，[S]，v不变--零级反应底物浓度对酶促反应速度的影响（1）米氏方程（Michaelis-Mentenequation）V=Vmax[S]Km+[S]米氏方程解释：当[S]Km时，v=(Vmax/Km)[S],即v正比于[S]当[S]Km时，vVmax,即[S]而v不变米氏方程成立条件：

初速度为标准单底物稳态（steadystate）（2）米氏方程推导

（3）米氏常数的意义1、当反应速度等于最大反应速度一半时，即V=1/2Vmax,Km=[S],米氏常数的单位为摩尔/L。2、不同的酶具有不同Km值，它是酶的一个重要的特征物理常数。3、Km值只是在固定的底物，一定的温度和pH条件下，一定的缓冲体系中测定的，不同条件下具有不同的Km值。4、Km值表示酶与底物之间的亲和程度：Km值大表示亲和程度小，酶的催化活性低;Km值小表示亲和程度大,酶的催化活性高。测定Km和V的方法很多，最常用的是Lineweaver–Burk的作图法—

双倒数作图法。

1Km11

=

+

V

Vmax[S]Vmax取米氏方程式的倒数形式：1/Vmax斜率=Km/Vmax-1/Km米氏常数Km的测定：例题D-丝氨酸脱水酶需要磷酸吡哆醛作为辅酶。催化反应：CH2OH·CHNH2·COOHCH3CO·COOH+NH3在实验中测定酶的磷酸吡哆醛饱和曲线得到下列数据：

[s]v磷酸吡哆醛10-5（M）

20分钟生成丙酮酸（M）

0.200.1500.400.2000.850.2751.250.3151.700.3402.000.3508.000.360用这些数据求丝氨酸脱水酶对磷酸吡哆醛的表观米氏常数。

vVm0.30.2Vm20.101234567810-6[S]丙酮酸M/20minVm=0.361/2Vm=0.18Km=3.210-6M解：1、v对[S]作图法:

磷酸吡哆醛10-

5（M）

20分钟生成丙酮酸（M）

[S]1/[S]v1/v0.205.00.1506.660.402.50.2005.000.851.170.2753.641.250.800.3153.171.700.580.3402.942.000.500.3502.868.000.1250.3602.78解2、1/v对1/[S]作图法：7654321-4-3-2-10123451/v1/[S]

-1/Km=-2.85105Km=3.5110-6

1/Vm=2.55;Vm=0.392、酶浓度对反应速度的影响反应速度与酶浓度成正比：当[S][E],式中Km可以忽略不计。k3[E][S]Km+[S]=k3[E]v=v[E]o0102030405060℃2.01.51.00.5温度对唾液淀粉酶活性的影响产物麦芽糖的毫克数3、温度对酶促反应速度的影响酶的最适温度:酶活性最高时的温度,也即酶的催化效率最高,酶促反应速度最大时的温度。酶的最适pH:酶催化活性最高时的pH。2810pH酶的活性

pH对某些酶活性的影响A:胃蛋白酶;B:葡萄糖-6-磷酸酶4、pH对酶促反应速度的影响AB部分酶的最适pH值

酶最适pH胃蛋白酶1.8过氧化氢酶7.6胰蛋白酶7.7延胡索酸酶7.8核糖核酸酶7.8精氨酸酶9.85、抑制剂对酶促反应速度的影响抑制作用:直接或间接地影响酶的活性中心,使酶活性降低或丧失。抑制剂：凡能降低酶活性而不引起酶蛋白变性的物质。（1）不可逆抑制（irreversibleinhibition）

SH

SE+Hg2+EHg+2H+

SH

S

SH

Cl

SE+As-CH=CHClEAs-CH=CHCl+2HCl

SH

Cl

S巯基酶路易士气例1：巯基酶的抑制抑制剂与酶的必需基团以牢固的共价键结合,使酶丧失活性,不能用透析超滤等物理方法除去抑制剂使酶恢复活性.

SEHg+

SCOONaCHSHCHSHCOONa

SHE+Hg

SHCOONaCHS

CHSCOONa二巯基丁二酸钠

SCH2OHSHCH2OHEAs-CH=CHCl+CHSHE+CHS

SCH2SH

SHCH2SAs-CH=CHCl二巯基丙醇解毒方法：ROOROOROXROO—EP+E—OHP+HX有机磷化合物羟基酶磷酰化酶(失活)ROOROO—EP+-CHNOH磷酰化酶(失活)N+CH3

-CHNN+CH3OOROOR+E—OH

P例2：羟基酶的抑制羟基酶:有丝氨酸侧链上的羟基为必需基团的酶有机磷(敌百虫、敌敌畏、对硫磷)不可逆抑制羟基酶的活性中心解磷定（2）可逆抑制(reversibleinhibition)抑制剂与酶以非共价键疏松结合引起酶活性的降低活丧失,结合是可逆的,能够通过透析、超滤等物理方法使酶恢复活性。可逆抑制类型：竞争性抑制(competitiveinhibition)非竞争性抑制（non-competitiveinhibition）反竞争性抑制（uncompetitiveinhibition）（3）竞争性抑制(competitiveinhibition)

概念竞争性抑制剂的结构与底物结构相似，与底物竞争同一种酶的活性中心,从而影响E与S的结合。竞争性抑制的底物浓度曲线竞争性抑制作用过程SSEEIIEE+P无I

有I

v[S]竞争性抑制的动力学方程:v=Vmax[S]Km(1+[I]/Ki)+[S]1v=KmVmax(1+)+[I]Ki1[S]1Vmax竞争性抑制的特征曲线：[I]正常1v1[S]1Vmax-1Km(1+)[I]Ki-1Km竞争性抑制的特点：I与S分子结构相似；Vmax不变，表观Km增大；抑制程度取决于I与E的亲和力，以及[I]和[S]的相对浓度比例。

COOHCH2CH2COOH琥珀酸脱氢酶+FAD+FADH2

COOHCHCHCOOH琥珀酸延胡索酸对氨基苯甲酸二氢蝶呤FH2FH4

谷氨酸二氢叶酸合成酶二氢叶酸还原酶磺胺药(-)氨甲蝶呤(-)例：

COOHCH2COOH丙二酸（-）（4）非竞争性抑制non-competitiveinhibition）SSEEEE+PSESIIII概念抑制剂与酶分子活性中心以外的其它部位结合而抑制酶活性，I和S与酶结合不存在竞争关系。非竞争性抑制作用过程：

非竞争性抑制的动力学方程:1v=KmVmax(1+)+[I]Ki1[S]1Vmax（1+）[I]Ki非竞争性抑制的特征曲线：1v正常[I]1[S]-1Km1Vmax(1+)[I]Ki非竞争性抑制的特点：1、I与S分子结构不同；2、Vmax减小，表观Km不变；3、抑制程度取决于[I]大小。Ag1+、Cu2+、Hg2+和Pb2+对酶的抑制质子化的叔胺（R3NH+）对乙酰酯酶的抑制概念抑制剂仅与酶和底物的中间复合物结合而抑制酶活性。

反竞争性抑制作用过程：

EEE+PEIISSS（5）反竞争性抑制（uncompetitiveinhibition）反竞争性抑制的动力学方程:v=Vmax[S]Km+(1+[I]/Ki)[S]1v=KmVmax(1+)[I]Ki1[S]1Vmax反竞争性抑制的特征曲线：[I]正常1v1[S]1Vmax-1Km[I]Ki+(1+)-1Km1Vmax(1+)[I]Ki反竞争性抑制的特点：1、I与S分子结构不同,I只与ES结合2、Vmax和表观Km都减小；3、抑制程度取决于[I]和[ES]二者的浓度。氰化物或肼对芳香硫酸酯酶的抑制可逆性抑制作用的动力学比较作用特点无抑制剂竞争性抑制非竞争性抑制反竞争性抑制与I结合组分动力学参数表观Km表观Vm双倒数作图斜率纵轴截距横轴截距KmVmKm/Vm1/Vm-1/KmEKm(1+[I]/Ki)VmKm(1+[I]/Ki)/Vm1/Vm1/Km(1+[I]/Ki)E、ESKmVm/(1+[I]/Ki)Km(1+[I]/Ki)/Vm(1+[I]/Ki)/Vm-1/KmESKm/(1+[I]/Ki)Vm/(1+[I]/Ki)Km/Vm(1+[I]/Ki)/Vm-(1+[I]/Ki)/Km6、激活剂对酶促反应速度的影响（1）激活剂:凡能使酶由无活性变为有活性或使酶活性增加的物质。如：金属离子：Mg2+、

K+、Mn2+阴离子：Cl-

有机物：胆汁酸盐（2）分类：必需激活剂Mg2+对己糖激酶非必需激活剂Cl-

对淀粉酶四、酶活性测定1、酶活性酶的催化能力，以酶促反应速度来衡量。2、酶活性单位指酶促反应在单位时间（s,min,h）内生成一定量（mg,μg,μmol）的产物或消耗一定量的底物所需的酶量。一个国际单位（IU,1976年）：在特定条件下,1min内使底物转变1μmol所需的酶量；一个催量（kat）：在特定条件下,1Sec内使底物转变1mol所需的酶量

1I.U.=16.6710-9kat=16.6710-3

Kat；

1Kat=6107I.U.

酶比活：每毫克蛋白所含有的每活力单位数。3、酶活力测定包括两个阶段：反应阶段和测定阶段。一般采取如下步骤：(1)根据酶的专一性，选择适宜的底物，并配制成一定浓度的底物溶液。要求底物均匀一致，具有一定的纯度，新鲜配制。（2）确定酶促反应的温度，pH值等条件。温度可选酶反应最适温度pH值应是酶促反应的最适pH值反应条件在反应过程中应尽量保持恒定不变。(3)酶液与底物溶液在规定状态下混合开始反应。(4)适时测定产物的生成量或底物的减少量。终止酶反应的方法①加热失活：酶反应时间一到立即取出适量的反应液，置于沸水浴中；②变性失活：酶反应时间一到立即加入适宜的酶变性剂，如三氯醋酸等；③酸碱失活：酶反应时间一到使反应液的pH值迅速远离酶催化反应的最适pH，从而终止反应；④低温失活：酶反应时间一到将取出的反应液立即置于冰粒堆中或冰盐溶液中，使反应液的温度迅速降低至10℃以下。固定化酶的活力测定振荡测定法：称取一定重量的固定化酶，放在一定形状，一定大小的容器中，加入一定量的底物溶液，在特定的条件下，一边振荡或搅拌，一边进行催化反应经过一定时间，取出一定量的反应液进行测定。注意点：

（1）在振荡或搅拌速度速度不高时，反应速度随振荡或搅拌速度的增加而升高，在达到一定水平后不再升高。（2）若速度过大，可能引起固定化酶的结构破坏，缩短固定化酶的使用寿命。（3）底物浓度，pH值，温度，反应时间等条件可与游离酶活力测定的条件相同。例题：某无细胞的粗提液，每mL含20mg蛋白质。在0.5mL的标准总反应体积中，含有10L这中提取液。在最适宜条件下，一分钟内生成30ng的产物。求：用下述单位表示反应速度v:nmol/ml/min,nmol/L/min,mol/L/min,mol/L/min若10l该提取液，在1ml总反应体积中进行实验，其反应速度是多少？反应混合液和提取液中酶活性浓度各是多少？酶制剂的比活力是多少？解：V=30/0.5=60nmol/ml/min=60103nmol/L/min=60mol/L/min=610-5mol/L/minV=30/1=30nmol/ml/min=310-5mol/L/min反应液酶活性浓度=60nmol/ml/min

=0.06mol/ml/min=0.06单位/ml0.5ml的反应液内含0.03单位酶，即10l(0.01ml)提取液含0.03单位酶，所以：提取液酶活性浓度=0.03/0.01=3单位/ml酶比活=3/20=0.05单位/mg蛋白五、酶的分类与命名(一)分类1961年国际酶学委员会（EnzymeCommittee,EC）根据酶所催化的反应类型和机理，把蛋白类酶分成6大类：1.氧化还原酶类：主要是催化氢的转移或电子传递的氧化还原反应。AH2+B（O2）A+BH2（H2O2，H2O）（1）脱氢酶类：催化直接从底物上脱氢的反应。AH2+BA+BH2（需辅酶Ⅰ或辅酶Ⅱ）（2）氧化酶类①催化底物脱氢，氧化生成H2O2：AH2+O2A+H2O2（需FAD或FMN）②催化底物脱氢，氧化生成H2O：2AH2+O22A+2H2O（3）过氧化物酶ROO+H2O2RO+H2O+O2（4）加氧酶（双加氧酶和单加氧酶）O2+OHOHC=OC=OOHOH（顺，顺-已二烯二酸）ROH+H2O+氧化型辅助因子RH+O2+还原型辅助因子（又称羟化酶）2.转移酶类：催化化合物中某些基团的转移。A·X+BA+B·X根据X分成8个亚类：转移碳基、酮基或醛基、酰基、糖基、烃基、含氮基、含磷基和含硫基的酶。3.水解酶类：催化加水分解作用。AB+H2OAOH+BH4.裂解酶类：催化非水解性地除去基团而形成双键的反应或逆反应。CH3C=OCOOHC—C键CH3C=OH+CO2C—O键CH2COOHHO—CH—COOHHCCOOHHOOCCH+H2OC—N键COOHCH—NH2CH2COOHCOOHCHHCCOOH+NH35.异构酶：催化各种异构体之间的互变。AB常见的有消旋和变旋、醛酮异构、顺反异构和变位酶类。6.合成酶类：催化有ATP参加的合成反应。A+B+ATPA·B+ADP+Pi7.核酸酶（催化核酸）Ribozyme（1）ribozyme的发现

80年代初期，美国科罗拉多大学博尔德分校的ThomasCech和美国耶鲁大学的SidneryAltan各自独立地发现RNA具有生物催化功能.从而改变了生物催比剂的传统概念。为此，T.Cech和S.Altman共同获得了1989年度诺贝尔化学奖。（2）Ribozyme的种类根据催化底物是否是本身的RNA分为：分子内酶（incis）包括：自我剪切酶、自我剪接酶