第四章 高效液相色谱

高效液相色谱法：

特指一种用液体为流动相的色谱分离分析方法。它在经典色谱理论的基础上，采用了高压泵、化学键合固定相高效分离柱、高灵敏专用检测器等新实验技术建立的一种液相色谱分析法。第四章高效液相色谱分析法HPLC

（HighPertormanceLiquidChromatography，）§4-1高效液相色谱法的特点

一、高效液相色谱与经典液相色谱方法的比较高压、高速、高速、高效、高灵敏度。高压：是HPLC一个突出的特点，供液压力和进样压力可达

150-350×105Pa高速：HPLC采用高压输液设备，流速大大增加，分析速度极快，只需数分钟；而经典方法靠重力加料，完成一次分析需时数小时。高效：填充物颗粒极细且规则，固定相涂渍均匀、传质阻力小，因而柱效很高。可以在数分钟内完成数百种物质的分离。高灵敏度：检测器灵敏度极高：UV—10-9g,荧光检测器—10-11g。二、液相色谱与气相色谱的比较液相色谱所用基本概念：保留值、塔板数、塔板高度、分离度、选择性等与气相色谱一致。液相色谱所用基本理论：塔板理论与速率方程也与气相色谱基本一致。但由于在液相色谱中以液体代替气相色谱中的气体作为流动相，而液体和气体的性质不相同；此外，液相色谱所用的仪器设备和操作条件也与气相色谱不同，所以，液相色谱与气相色谱有一定差别，主要有以下几方面：1、应用范围不同

气相色谱仅能分析在操作温度下能气化而不分解的物质。对高沸点化合物、非挥发性物质、热不稳定化合物、离子型化合物及高聚物的分离、分析较为困难。致使其应用受到一定程度的限制，据统计只有大约20%的有机物能用气相色谱分析；而液相色谱则不受样品挥发度和热稳定性的限制，它非常适合分子量较大、难气化、不易挥发或对热敏感的物质、离子型化合物及高聚物的分离分析，大约占有机物的70~80%。2、液相色谱能完成难度较高的分离工作①气相色谱的流动相载气是色谱惰性的，不参与分配平衡过程，与样品分子无亲和作用，样品分子只与固定相相互作用。而在液相色谱中流动相液体也与固定相争夺样品分子，为提高选择性增加了一个因素。也可选用不同比例的两种或两种以上的液体作流动相，增大分离的选择性。②液相色谱固定相类型多，如离子交换色谱和排阻色谱等，作为分析时选择余地大；而气相色谱并不可能。

③液相色谱通常在室温下操作，较低的温度，一般有利于色谱分离条件的选择。3、由于液体的扩散性比气体的小105倍，因此，溶质在液相中的传质速率慢，柱外效应对柱效的影响较大；而在气相色谱中，柱外区域扩张可以忽略不计。4、液相色谱中制备样品简单，回收样品也比较容易，而且回收是定量的，适合于大量制备。但液相色谱尚缺乏通用的检测器，仪器比较复杂，价格昂贵。在实际应用中，这两种色谱技术是互相补充的。

综上所述，高效液相色谱法具有高柱效、高选择性、分析速度快、灵敏度高、重复性好、应用范围广等优点。结论：从色谱分析的发展来看，HPLC比GC更为有用、更具发展前途！1．贮液罐（滤棒，可滤去颗粒状物质）2．高压泵（输液泵）3．进样装置4．色谱柱——分离5．检测器——分析6．废液出口或组分收集器7．记录装置三、高效液相色谱仪流程图四、HPLC的实际应用1、利用其高柱效（n=104片/米），有效分离极复杂体系中的痕量组分。正相色谱分离有机溶剂中的物质反相色谱分离水溶液中的物质----生化物质。2、用离子型固定相建立的离子交换色谱和离子对色谱法分析离子型体的含量。（蛋白质、氨基酸、常见阴阳离子等）3、利用多孔凝胶固定相建立空间排阻色谱法可分离高分子化合物。4、利用手性固定相可以拆分分离具有手性的化合物。§4-2影响色谱峰扩展及色谱分离的因素基础理论热力学理论：塔板理论——平衡理论动力学理论：速率理论——Vander方程一、塔板理论1.二、速率理论（与GC对比）使用细粒的固定相并填充均匀可减小A，提高柱效。减小B值，提高柱效的措施：使用分子量较大的载气，增加载气流速，降低温度，增大柱压。气相色谱采用粒度小的填充物和相对分子质量小的气体（如氢气）做载气，可使Cg减小，提高柱效。一般采用表面积较大的载体来降低液膜厚度。应控制适宜的柱温。2.高效液相色谱的速率方程

气相色谱速率方程和液相色谱速率方程的形式基本一致，主要区别在液液色谱中纵向扩散项可忽略不计,影响柱效的主要因素是传质阻力项。(2)

纵向扩散项Hb——可忽略同于气相色谱(1)涡流扩散项A分子在液相中的扩散系数比在气相中小4~5数量级。

传质阻力项（Cu）包含固定相传质阻力项（Hs）和流动相传质阻力项（Hm）(1)、固定相传质阻力项(3)传质阻力项

Cu减小Hs的措施：使用薄的固定相层，扩散系数大的固定液，减小流动相的流速。(2)、流动相传质阻力项（Hm）流动的流动相中的传质滞留的流动相中的传质使用细粒的固定相，粒度规则，并填充均匀，固定相孔径大，可减小Hm，提高柱效。

高效液相色谱速率理论公式可写为:结论(提高柱效的措施)：提高柱内填料装填的均匀性和减小粒度以加快传质速率；选用低黏度的流动相，或适当提高柱温以降低流动相黏度，都有利于提高传质速率；降低流动相流速可降低传质阻力相的影响，但又会使纵向扩散增加并延长分析时间。图３-１3.范氏方程曲线（H-u曲线）问题：气相色谱与液相色谱的H-u曲线有何不同，是什么原因造成的？气相色谱的H-u曲线，塔板高度H随u呈双曲线变化，曲线有一最低点，此时塔板高度最小，柱效最高，流速最佳。液相色谱的H-u曲线通常是流速u降低，塔板高度H总是降低，流动相流速增大，柱效平缓降低。出现这种情况主要是由于液相的流动相为液体，其扩散系数很小，通常比气体扩散系数小4-5个数量级，所以分子扩散项在低流速时也不起多大作用，未出现板高增加现象。在高流速时，固定相和流动相的传质都很快，传质阻力项小，故随H-u曲线上升缓慢。柱外扩展（柱外效应）色谱柱外各种因素引起的峰扩展。

(1)柱前峰展宽主要由进样引起的：进样器的死体积和进样时液流扰动引起的扩散造成了色谱峰的不对称和展宽。解决措施：将试样直接注入色谱柱顶端填料上的中心点，或注入到填料中心之内1-2mm。

(2)柱后峰展宽主要由连接管、检测器流通池体积引起。解决措施：减小连接管的体积、检测器的死体积4.影响高效液相色谱扩展的其它因素一、液液分配色谱及化学健合相色谱法（LLC）

(liquid-liquidpartitionchromatography,chemicalbondedphasechromatography二、液固吸附色谱法（LSAC）

(liquid-solidadsorptionchromatography)三、离子对色谱法（IC）(ionpairchromatography)四、离子交换色谱法(IEC)(ion-exchangechromatography)五、离子色谱法(IC)(ionchromatography,)六、空间排阻色谱法（SEC）（stericexclusionchromatography七、亲和色谱法(AC)§4-3高效液相色谱法的主要类型及其分离原理一、分配色谱原理：

根据各待测物在互不相溶的两溶液中的溶解度不同，因而具有不同的分配系数。在色谱柱中，随着流动相的移动，这种分配平衡需进行多次，造成各待测物的迁移速率不同，从而实现分离的过程。2.流动相:HPLC分析中，为防止固定相的流失，流动相与固定液应尽量不互溶，或者说二者的极性相差越大越好。正相分配色谱：流动相极性小于固定相极性，极性小的先流出，适于极性组分分离。反相分配色谱：流动相极性大于固定相极性，极性大的先流出，适于非极性组分分离。正相键合色谱中，随流动相极性增加，组分分配比k增加。

在HPLC分析中，有时要在流动相中加入适量的盐(碳酸铵、四烷基铵盐)或酸，为什么？答：都是为了防止峰形拖尾。加入盐类是为了减少待测物与键合相表面的残留硅醇基作用；加入酸是抑制酸类待测物的离解，使其以游离酸在柱内分离。反相键合色谱中，键合相碳链越长，分离效果越好。3.固定相常用的固定液只有几种，按极性由高到低为：,’-氧二丙腈(ODPN)、聚乙二醇(PEM)、三甲撑二醇(TMG)、十八烷(C18)、角鲨烷(SQ)。

1）机械涂渍固定相：将固定液通过机械混合的方法涂渍到表面多孔型(0.5-1.5%涂布量)或全多孔型载体(5-10%涂布量)上形成的液液色谱固定相。该种固定相最大的不足是固定液易流失、分离稳定性及重现性差，不适合梯度淋洗。为减少固定液的流失，通常在柱前加一根很短的前置柱，该柱涂有与分析柱相同但有更高含量的固定液，使流动相进入分析柱之前，预先被固定液饱和。2）化学键合固定相

化学键合固定相是通过化学反应将有机分子键合在载体表面所形成的柱填充剂，具有稳定、流失小、适于梯度淋洗等特点。

这种固定相分离机理既不是简单的吸附，也不是单一的液液分配，而是二者兼而有之。化学键合的表面覆盖度决定哪种机理起主要作用。对多数键合相来说，以分配机理为主。通常，化学键合相的载体主要是硅胶（表面有硅醇基）：Si-O-R：对热不稳定、遇水、乙醇等强极性会水解，使酯链断裂，因此只适于以不含水或醇的流动相。Si-R(或Si-N)：不水解，热稳定性比硅酸脂好。但所用的格氏反应不方便。使用水溶液作流动相时，其pH应在4-8之间。Si-O-Si-R：不水解，热稳定性好，在pH2-8范围内对水稳定。二、液-固色谱分离原理：根据各物质的吸附作用不同进行分离。分离对象：相对分子量中等的油溶性试样，对具有不同官能团的化合物和异构体有较高的选择性。缺点：由于非线性等温吸附常引起峰的拖尾现象。三、离子交换色谱

既适于无机离子，也适于有机物分离，如蛋白质、氨基酸、核酸等。1.原理：利用不同待测离子对固定相的亲和能力（或离子交换能力）的差别来实现分离的。待测离子与离子交换树脂固定相上带电荷基团或游离的离子发生可逆交换反应：

对阳离子，滞留顺序为：Fe3+,Ba2+,Pb2+,Sr2+,Ca2+,Ni2+,Cd2+,Cu2+,Co2+,Zn2+,Mg2+,UO22+,Tl+,Ag+,Cs+,Rb+,K+,NH4+,Na+,H+,Li+

对阴离子，滞留顺序为：柠檬酸根,SO42-,C2O4,I-,HSO4-,NO3-,CrO42-,Br-,SCN-,Cl-,HCOO-,CH3COO-,OH-,F-

2.固定相按离子交换剂类型分四种：

按固定相制作方法可分为：多孔型离子交换树脂(包括微孔型和大孔型)；表面多孔型(包括薄膜型）离子交换树脂；离子交换键合型。1）多孔型：聚苯乙烯+二乙烯苯交联，分微孔型和大孔型。交换基团多——交换容量大，稳定。但易溶胀，传质慢、柱效低、分析速度慢。2）表面多孔型：薄膜型=惰性核+树脂薄层(1-2m)多孔型=惰性核+硅胶微球+树脂薄层。克服了多孔型离子交换树脂的不足，但交换容量低，柱子易超负荷。3）离子交换键合相：利用化学反应将离子交换基团键合到惰性载体表面。载体可以是薄壳玻珠，也可以是多孔硅胶微粒。使用后者为载体，可得到性能稳定、耐压、高柱效的柱子。微孔型大孔型微孔微孔薄膜型表面多孔型离子交换层惰性核惰性核离子交换剂硅胶层涂覆3.流动相离子交换色谱流动相为盐类缓冲溶液(有一定pH和离子强度。pH值：影响酸或碱的离解平衡，控制组分离子形式所占的分数。当组分以分子形式存在时，则不被保留；离子分数越高，保留值越大。常用的有柠檬酸盐、磷酸盐、甲酸盐、乙酸盐和氨水等。离子强度I：对保留值的影响比pH更大。组分保留值受流动相中盐类总浓度控制。增加外加阴或阳离子将增加它们对—R+或—R-的竞争能力，使组分保留值减小。通过加入不同种类的盐，可影响柱的选择性，因为不同物质对交换剂的亲和能力不同。有机溶剂：外加有机溶剂通常减小组分的保留值。其极性越小，保留值越小。常用的有机溶剂有甲醇、乙醇、乙腈和二氧杂环已烷等。配离子L：当大量L、组分X随流动相进入柱后，发生配位剂交换：RM-L+XRM-X+L该法用于分离各种氨基酸或碱类。四、离子色谱

离子色谱(IC)分离原理与离子交换色谱原理一样，只是流出的各种离子用电导检测器检测。

存在的问题：由于流动相都是强电解质，其电导率比待测离子约高2个数量级，这种强背景电导会完全掩盖待测离子信号。

抑制型离子色谱：在离子交换柱之后，再串结一根抑制柱。该柱装填与分离柱电荷完全相反的离子交换树脂。通过分离柱后的样品再经过抑制柱，使具有高背景电导的流动相转变为低背景电导的流动相，从而可用电导检测器检测各种离子的含量。

例如：分析阳离子时，以无机酸为流动相，抑制柱为高容量的强碱性阴离子交换树脂，则发生下列反应：

R+—OH+HCl(流动相)——R+—Cl

-+H2O

R+—OH+MCl(待测物)——R+—Cl

-+M+OH-

可见，不仅大量酸转化为低电导的水，而且待测离子转化为具有更大淌度的碱。

不足：抑制柱要定期再生、谱峰在经过抑制柱后会展宽，降低分离度。非抑制型离子色谱：没有抑制柱，用电导率很低的溶液(如苯甲酸盐稀溶液)作流动相。思考：IC分离中，何为抑制柱？分析阴离子时，抑制柱中应填充何种离子交换树脂？五、离子对色谱法（IPC）

分离强极性有机酸和有机碱。

1.原理：将与待测物离子A电荷相反的离子B（称为对离子或反离子）加入到流动相中，使待测离子A与对离子B形成离子对AB，该AB离子对的性质与A离子或B离子的性质不同，即间接改变了待测离子的保留特性。例如：固定相为非极性键合相，流动相为水溶液，于流动相中加入与待测离子A-有相反电荷的离子B+：

由于离子对AB具有疏水性，因而被非极性固定相提取。其它待测离子A1，A2，A3……..因与B离子间的成对能力不同，而形成不同疏水性的离子对，使得各待测物在柱内的保留值不同，从而达到分离的目的。思考：有一强极性有机酸混合物，若用离子对色谱法分离，请问在流动相中应加入阴离子还是阳离子来形成离子对？六、尺寸排阻色谱法

尺寸排阻色谱又称凝胶(渗透)色谱，主要用于大分子的分离。1.分离原理：固定相为化学惰性的多孔凝胶，它类似于分子筛，但孔径更大。凝胶内有一定大小的空穴，分子体积大的待测物不能渗入孔穴中而被排阻，较早地被淋洗出来，中等的部分渗透，小分子则完全渗透，最后流出色谱柱。即待测物分子按分子大小(分子量大小)先后从柱中流出。2.固定相3.流动相的要求：能溶解样品且与凝胶相似(润湿凝胶)、粘度小(增加扩散速度)。

七、亲合色谱主要用于生物大分子与固定相之间的特异亲合力进行选择性分离及纯化的方法。分离原理：于载体表面先键合具有一般反应性能的环氧或联氨（称为间隔臂），然后再连接上配基，如酶、抗原或激素。当含有复杂混合试样的流动相流经这种经固定化的配基时，其中具有亲合力特性的生物大分子与配基相互作用而被保留，无此作用的则被洗出；随后，改变流动相pH或组成，再将被保留的大分子组分以纯品的形式洗脱出来。特点：选择性过滤、纯化效果好。该类固定相常用的载体有下列几类：①表面多孔型载体（薄壳型微珠载体），由直径为3040m的实心玻璃球和厚度约为12m的多孔性外层所组成。由于比表面积较小，试样容量低，需要高灵敏度的检测器。

②全多孔型载体，由硅胶、硅藻土等材料制成，直径3050m的多孔型颗粒。③全多孔型微粒载体，由nm级的硅胶微粒堆积而成，又称堆积硅珠。这种载体粒度为510m。由于颗粒小，所以柱效高，是目前使用最广泛的一种载体。1.液-液分配、化学键合及离子对分离色谱的固定相§4-4液相色谱法固定相微孔型大孔型薄膜型表面多孔型离子交换层惰性核惰性核离子交换剂硅胶层涂覆

2.液-固吸附分离固定相

种类：硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰胺等；结构类型：全多孔型和薄壳型；粒度：5～10μm；

3.离子交换色谱分离固定相结构类别：（1）薄壳型离子交换树脂（2）离子交换键合固定相树脂类别：（1）阳离子交换树脂

(强酸性、弱酸性)（2）阴离子交换树脂

(强碱性、弱碱性)

4.空间排阻分离固定相（1）软性凝胶

葡聚糖凝胶、琼脂凝胶等。多孔网状结构；水为流动相。适用于常压排阻分离。（2）半刚性凝胶

苯乙烯-二乙烯基苯交联共聚物，有机凝胶；非极性有机溶剂为流动相，不能用丙酮、乙醇等极性溶剂（3）刚性凝胶

多孔硅胶、多孔玻珠等；化学稳定性、热稳定性好、机械强度大，流动相性质影响小，可在较高流速下使用。

1.流动相特性

（1）液相色谱的流动相又称为：淋洗液，洗脱剂。流动相组成改变，极性改变，可显著改变组分分离状况；（2）流动相的极性小于固定相的极性，为正相色谱法，极性柱也称正相柱。（3）流动相的极性大于固定液的极性，为反相色谱法，非极性柱也称为反相柱。组分在两种类型分离柱上的出峰顺序相反。§4-5液相色谱法流动相2.流动相类别按流动相组成分：单组分和多组分；按极性分：极性、弱极性、非极性；按使用方式分：固定组成淋洗和梯度淋洗。常用溶剂：甲醇、乙腈、水、乙酸乙酯、四氯化碳、己烷等

采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。3.流动相选择

在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。

采用正相液-液分配分离时：首先选择中等极性溶剂，若组分的保留时间太短，降低溶剂极性，反之增加。也可在低极性溶剂中，逐渐增加其中的极性溶剂，使保留时间缩短。

常用溶剂的极性顺序：

水(最大)>甲酰胺>乙腈>甲醇>乙醇>丙醇>丙酮>二氧六环>四氢呋喃>甲乙酮>正丁醇>乙酸乙酯>乙醚>异丙醚>二氯甲烷>氯仿>溴乙烷>苯>四氯化碳>二硫化碳>环己烷>己烷>煤油(最小)4.选择流动相时应注意的几个问题

（1）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。（2）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝固定相等。（3）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并在柱中沉积。

（4）溶剂的黏度小些为好。

（5）流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。

HPLC仪器包括：高压输液装置;

进样系统;

分离系统;

检测系统;

此外还配有梯度淋洗、自动进样和数据处理装置。其工作过程如图所示。§4-6高效液相色谱仪自学提纲1、高效液相色谱仪有哪几部分构成？2、何谓梯度洗脱？适用于哪些样品的分析？与程序升温有什么不同？3、高效液相色谱仪的检测器有哪些？各自的特点和使用范围如何？有何缺点？通用型检测器有哪些？选择型检测器有哪些？4、高效液相色谱仪使用的流动相为什么要预先脱气？常用的脱气方法有哪些？1.高压输液系统1）贮液器：1-2L的玻璃瓶，配有溶剂过滤器(Ni合金)，其孔很约2m，可防止颗粒物进入泵内。2）脱气：超声波脱气或真空加热脱气。溶剂通过脱气器中的脱气膜，相对分子量小的气体透过膜从溶剂中除去（气泡会影响检测）。3）高压泵：对输液泵的要求：密封性好、输液流量稳定无脉动、可调范围宽、耐腐蚀。输液泵种类：恒压型和恒流型。

恒压泵(类似于风箱)可迅速获得高压，适于柱的匀浆填充。但因泵腔体积大，在往复推动时，会引起脉动，且输出流量随色谱系统阻力（主要是柱填充物）变化而变化，现已较少使用。

恒流型溶剂流量恒定，与柱填充情况无关，使用较多。有机械注射式和机械往复式两种。应用最多的是机械往复式恒流泵(见下图。每分钟往复25~100次，因此脉动小。对流量变化敏感的检测器也会有噪声干扰，此时可连接一脉动阻尼器)。马达往复式拉动密封溶剂球阀脉动阻尼器到色谱柱机械往复柱塞泵示意图4）梯度淋洗装置：在分离过程中逐渐改变流动相组成的装置。如果只有一个泵，可采用低压混合设计（将两种或以上的溶剂按一定比例混合，再由高压泵输出）；如果有两个或以上泵，调节各自的流量，在高压下混合。2.进样系统与GC相比，HPLC柱要短得多，因此由于柱本身所产生的峰形展宽相对要小些。即，HPLC的展宽多因一些柱外因素引起。这些因素包括：进样系统、连接管道及检测器的死体积。进样装置包括两种。1）隔膜注射进样：使用微量注射器进样。装置简单、死体积小。但进样量小且重现性差。2）高压进样阀：目前最常用的为六通阀。由于进样量可由样品管控制，因此进样准确，重复性好，如图。动画3.色谱柱1）对色谱柱的要求：内壁光滑的优质不锈钢柱，柱接头的死体积尽可能小。柱长多为10~30cm，内径为4~5mm(尺寸排阻色谱柱常大于5mm，制备色谱柱内径更大)；2）柱的填充：主要采用匀浆法。根据使用匀浆试剂的性质不同可分为：平衡密度法：非平衡密度法：

填充方法：填充时，按上述方法制作匀浆液，用流动相充满色谱柱及其延长管中，然后将匀浆液倒入匀浆填充器，在较高压力下迅速将其注入色谱柱内。要求填充速度快(防凝聚、沉降或结块)、且无空气进入(影响填充均匀性)。常用分离柱4.检测器液相色谱检测器包括紫外吸收、荧光发射、示差折光和安培检测器等。1）紫外检测器其检测原理和UV-Vis方法一样。只是此时所采用的吸收池为微量吸收池，通常其光程为2-10mm,体积约为1~10L。

HPLC分析中，约有80%的物质可以在254nm或280nm处产生紫外吸收。因此该类检测器应用很广。

在选择测量波长时注意：溶剂必须能让所选择的光透过，即所选波长不能小于溶剂的最低使用波长。石英窗接色谱柱UV光电倍增管废液波长可的松氟美松皮质酮快速扫描—光电二极管阵列（PDA）检测所获得的三维色谱-光谱图2）荧光检测器许多有机物具荧光活性，尤其是芳香族化合物具有很强的活性。荧光检测器是一种选择性很强的检测器，其灵敏度比UV检测器高2~3个数量级。3）示差折光检测器原理：利用两束相同角度的光照射溶剂相和样品+溶剂相，利用二者对光的折射率不同，其中一束（通常是通过样品+溶剂相）光因为发生偏转造成两束光的强度差发生变化，将此差示信号放大并记录，该信号代表样品的浓度。为通用型检测器，灵敏度为10-7g/mL。但对温度变化敏感，且不适于梯度淋洗。4）安培检测器(amperedetector)

由恒电位仪和一薄层反应池（体积为1~5L）组成。该检测器是利用待测物流入反应池时在工作电极表面发生氧化或还原反应，两电极间就有电流通过，此电流大小与待测物浓度成正比。采用安培检测器时，流动相必须含有电解质，且呈化学隋性。它最适于与反相色谱匹配。但此检测器只能检测具有电活性的物质。接参比电极和对电极接色谱柱Teflon塑料块1cm工作电极(Pt,Au,碳糊)5）电导检测器电导检测器主要用于离子色谱的检测。其原理是基于待测物在一些介质中电离后所产生的电导（电阻的倒数）变化来测量电离物质的含量。电导检测器的主要部件是电导池。其响应受温度影响较大，因此需要将电导池置于恒温箱中。另外，当pH>7时，该检测器不够灵敏。其它检测器还包括：MS、IR、Evaporativelightscatteringdetector(光散射)、极谱等。1、选择色谱方法的主要依据有哪些？2、根据相对分子质量如何选择色谱法？3、根据溶解性如何选择色谱法？4、根据分子结构如何选择色谱法？§4-7

液相色谱分离方法的选择

要正确地选择色谱分离方法，首先必须尽可能多的了解样品的有关性质，其次必须熟悉各种色谱方法的主要特点及其应用范围。选择色谱分离方法的主要根据是样品的相对分子质量的大小，在水中和有机溶剂中的溶解度，极性和稳定程度以及化学结构等物理、化学性质。一、相对分子质量

对于相对分子质量较低（一般在200以下）、挥发性比较好、加热又不易分解的样品，可以选择气相色谱法进行分析。相对分子质量在200~2000的化合物，可用液固吸附、液-液分配和离子交换色谱法。相对分子质量高于2000，则可用空间排阻色谱法。二、根据溶解性选择水溶性样品最好用离子交换色谱法和液-液分配色谱法；微溶于水，但在酸或碱存在下能很好电离的化合物，也可用离子交换色谱法；油溶性样品或相对非极性的混合物，可用液-固色谱法。三、根据分子结构选择若样品中包含离子型或可离子化的化合物，或者能与离子型化合物相互作用的化合物（例如配位体及有机螯合剂），可首先考虑用离子交换色谱，但空间排阻和液-液分配色谱也都能顺利地应用于离子化合物；异构体的分离可用液-固色谱法；具有不同官能团的化合物、同系物可用液-液分配色谱法；对于高分子聚合物，可用空间排阻色谱法。书中所列的各类化合物使用的是什么色谱法，何种色谱柱及检测器？§4-8

HPLC的应用

1.环境中有机氯农药残留量分析

固定相：薄壳型硅胶(37～50m)

流动相：正己烷流速：1.5mL/min

色谱柱：50cm2.5mm(内径)

检测器：示差折光检测器

可对水果、蔬菜中的农药残留量进行分析。2.稠环芳烃的分析——稠环芳烃多为致癌物质。

固定相：十八烷基硅烷化键合相流动相：20%甲醇-水~100%甲醇线性梯度淋洗，2%/min

流速：1mL/min

柱温：50ºC

柱压：70104Pa

检测器：紫外检测器§4-9制备型液相色谱仪

preparativeliquidchromatography

获得高纯物质（色谱纯）的有效方法。半制备柱(内径8mm，长度15~30cm)，一次制备量０.1~１mg。1.色谱柱的柱容量（柱负荷）

对分析柱：不影响柱效时的最大进样量；对制备柱：不影响收集物纯度时的最大进样量；超载：进样量超过柱容量。柱效迅速下降，峰变宽。超载可提高制备效率，以柱效下降一半或容量因子k降低10%为宜。2.液相制备色谱的方法收集组分时，通常有以下情况：（1）可获得良好分离，主峰使用制备柱，超载提高效率；（2）两主成分之间的小组分；超载，分离切分使待分离组分成为主成分（富集）后，再次分离制备。3.制备型液相色谱仪

制备型液相色谱仪：结构与分析型一样，但泵流量大、进样量大、采用制备柱；柱后馏分收集器。制备柱：内径20～50mm，柱长50cm。一、高效毛细管电泳基本原理电泳：电解质溶液中的带电离子在电场力的作用下，以不同的速度向其所带电荷相反的电极方向迁移的现象，称之为电泳。

毛细管电泳：以高压电场为驱动力，以毛细管为分离通道，依据试样中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离、分析物质的一类液相技术，是经典电泳和现代微柱分离的结合。§4-10高效毛细管电泳2.高效毛细管电泳技术上的重要突破高效毛细管电泳在技术上采取了两项重要改进：一是采用了0.05mm内径的毛细管,；二是采用了高达数千伏的电压。毛细管的采用使产生的热量能够较快散发，大大减小了温度效应，使电场电压可以很高。电压升高，电场推动力大，又可进一步使柱径变小，柱长增加，高效毛细管电泳的柱效远高于高效液相色谱，理论塔板数高达几十万块/米，特殊柱子可以达到数百万。1.经典电泳分离法的不足

所用分离柱的柱径大，柱较短，分离效率不高（远低于HPLC），温度影响大。高效毛细管电泳在技术上采取了两项重要改进。3.电泳现象与电渗流现象电渗流：石英毛细管在pH>3时,内壁带负电荷与接触的缓冲溶液形成双电层，在高电场的作用下，双电层中的水合阳离子层引起溶液在毛细管内整体向负极方向流动而形成电电渗流。速度V电渗流。4.分离过程电场作用下，柱中出现：电泳现象和电渗流现象。

带电粒子的迁移速度=电泳和电渗流两种速度的矢量和。

正离子：两种效应的运动方向一致，在负极最先流出；

中性粒子无电泳现象，受电渗流影响，在阳离子后流出；

阴离子：两种效应的运动方向相反，V电渗流>V电泳时,阴离子在负极最后流出,在这种情况下,不但可以按类分离,除中性粒子外,同种类离子由于受到的电场力大小不一样也同时被相互分离。5.分离类型(1)毛细管区带电泳（CZE）

最普遍、最基本的一种分离模式。(2)毛细管凝胶电泳（CGE）

将聚丙烯酰胺在毛细管柱内交联生成凝胶。其具有多孔性，类似分子筛的作用，试样分子按大小分离。能够有效减小组分扩散，所得峰型尖锐，分离效率高。可分离测定蛋白质、DNA等。

在缓冲溶液中加入离子型表面活性剂，形成一疏水内核、外部带负电的胶束。在电场力的作用下，胶束在柱中移动。由于电泳流和电渗流的方向相反，且V电渗流>V电泳，则带负电的胶束以较慢的速度向负极方向移动，中性试样分子在胶束相和溶液（水相）两相间分配，疏水性强的组分与胶束结合的较牢，流出时间长。用来分离中性物质，扩展了高效毛细管电泳的应用范围。(3)毛细管胶束电动色谱（MECC）(4)毛细管等电聚焦（CIEF）(5)毛细管等速电泳（CITP）(6)毛细管电渗色谱（CEC）二、主要特点和应用高分辨率：理论n高达数百万块，甚至数千万块；高灵敏度：可检测出低至10-21

mol/L浓度的物质；高分析速度：可在3分钟内分离30种阴离子；1.7分钟分离19

种阳离子；4分钟可分离10种蛋白质；试样用量少：仅需几nL（10-9

L）的试样；操作成本低：分析一个试样仅需几毫升流动液。不足之处：进样不够方便。应用范围相对较窄。分析阴离子时，由阴极进样，在阳极检测。但电渗流方向与阴离子受电场力作用移动方向相反，出峰时间较长。三、仪器设置一、纸层析和薄层层析分离过程§4-11纸层析和薄层层析法

纸层析和薄层层析也属于色谱分析法。但与其它色谱方法不同的是在分离过程中一般不使用动力源。将试样点在色谱滤纸或层析板的一端，并将该端浸在作为流动相的溶剂（常称之为展开剂）中，随着溶剂向上的移动，经过试样点时，带动试样向上运动。纸层析和薄层层析流动相的移动是依靠毛细作用用薄层色谱法分离混合离子，若混合离子的极性大小顺序是A＜B＜C，用极性有机溶剂作展开剂，其比移值Rf值大小顺序为（）。A＜B＜C二、操作技术1.层析纸和层析板

特制的色层滤纸。按需要剪裁成长条形（或筒型）。层析板是用专门的涂布器把浆状的吸附剂（硅胶或氧化铝，200～250目）均匀地涂在长条形玻璃板上（厚度0.15～0.5mm）。干燥后即可使用。2.展开剂

由一种或多种溶剂按一定比例组成。如用纸层析分离氨基酸时，常用的展开剂组成和配比为：正丁醇：乙酸：水=4：1：1。3.点样

用微量注射器或玻璃毛细管吸取一定量试样点在原点上。试样点的直径一般应小于5mm。

4.显色、检测

有些组份在紫外光照射下产生荧光，可在紫外灯下用铅笔将组份斑点描绘出来。常用的显色方法有喷洒显色剂、碘蒸气熏或氨水熏等。三、特点及应用1、平板色谱简单、方便、及操作费用低；2、可以在一块层析板上同时展开多个试样及将多条滤纸同时展开；3、采用方形薄层板还可以方便的进行二维展开，即按一般方法展开后，改变方向和展开剂再次展开，进一步改善分离效果；

4、试样一般不需要经过预处理即可分离。缺点：分离效率较低，不适用挥发性试样分离。定性定量不便。应用：平板色谱法在染料、农药、医药、有机酸碱类化合物、糖类化合物、氨基酸、蛋白质及中草药中有效成分的分离分析中经常被使用。也可以用于无机离子的分离。还经常作为高效液相色谱的一种预试方法。

思考题1.现需分离分析一氨基酸试样，拟采用哪种色谱？2.提高液相色谱中柱效的最有效途径是什么？3.何谓反相液相色谱？何谓正相液相色谱？4.在液相色谱法中，梯度淋洗适用于分离何种试样？5.在液相色谱中，范氏方程中的哪一项对柱效能的影响可以忽略不计？(p66)6.对下列试样，用液相色谱分析，应采用何种检测器：（l）长链饱和烷烃的混合物（2）水源中多环芳烃化合物。7.对聚苯乙烯相对分子质量进行分级分析，应采用哪一种液相色谱法？8.什么是化学键合固定相？它的突出优点是什么？9.什么叫梯度洗脱？它与气相色谱中的程序升温有何异同？10.指出下列各种色谱法，最适宜分离的物质。（l）气液色谱；(2)正相色谱；（3）反相色谱；（4）离子交换色谱;（5）凝胶色谱；(6）气固色谱；(7）液固色谱。1、在LC中，提高色谱柱的柱效率最有效的途径是___A.减小载体粒度

B.适当升高柱温

C.降低流动相的速度

D.降低流动相的粘度

A一、分配色谱原理：根据各待测物在互不相溶的两溶液中的溶解度不同，因而具有不同的分配系数。在色谱柱中，随着流动相的移动，这种分配平衡需进行多次，造成各待测物的迁移速率不同，从而实现分离的过程。2.流动相:HPLC分析中，为防止固定相的流失，流动相与固定液应尽量不互溶，或者说二者的极性相差越大越好。因此，根据流动相与固定相极性的差别程度，可将液液色谱分为正相分配色谱（流动相极性小于固定相极性，极性小的先流出，适于极性组分分离）和反相分配色谱（流动相极性大于固定相极性，极性大的先流出，适于非极性组分分离）。2.固定相原则上，用于GC的固定相也可用于HPLC作固定相。但HPLC固定液易流失，因此常用的只有几种，按极性由高到低为：,’-氧二丙腈(ODPN)、聚乙二醇(PEM)、三甲撑二醇(TMG)、十八烷(C18)、角鲨烷(SQ)。

根据涂渍方法的不同，可将固定相分为机械涂渍型和化学键合型，后者应用更为广泛。1）机械涂渍固定相：将固定液通过机械混合的方法涂渍到表面多孔型(0.5-1.5%涂布量)或全多孔型载体(5-10%涂布量)上形成的液液色谱固定相。该种固定相最大的不足是固定液易流失、分离稳定性及重现性差，不适合梯度淋洗。

为减少固定液的流失，通常在柱前加一根很短的前置柱，该柱涂有与分析柱相同但有更高含量的固定液，使流动相进入分析柱之前，预先被固定液饱和。2）化学键合固定相

化学键合固定相是通过化学反应将有机分子键合在载体表面所形成的柱填充剂，具有稳定、流失小、适于梯度淋洗等特点。这种固定相分离机理既不是简单的吸附，也不是单一的液液分配，而是二者兼而有之。化学键合的表面覆盖度决定哪种机理起主要作用。对多数键合相来说，以分配机理为主。通常，化学键合相的载体主要是硅胶（表面有硅醇基）：Si-O-R：对热不稳定、遇水、乙醇等强极性会水解，使酯链断裂，因此只适于以不含水或醇的流动相。Si-R(或Si-N)：不水解，热稳定性比硅酸脂好。但所用的格氏反应不方便。使用水溶液作流动相时，其pH应在4-8之间。Si-O-Si-R：不水解，热稳定性好，在pH2-8范围内对水稳定。3.正相和反相键合色谱法正相键合色谱中，随流动相极性增加，组分分配比k增加。

在HPLC分析中，有时要在流动相中加入适量的盐(碳酸铵、四烷基铵盐)或酸，为什么？答：都是为了防止峰形拖尾。加入盐类是为了减少待测物与键合相表面的残留硅醇基作用；加入酸是抑制酸类待测物的离解，使其以游离酸在柱内分离。何为正相色谱，何为反相色谱？正相色谱低极性流动相反相色谱高极性流动相中等极性流动相中等极性流动相时间时间时间时间待测物极性：A>B>C正、反相色谱中极性和保留时间的关系时间，min固定相：C1固定相：C8固定相：C18硅胶-烷基键合相中烷基链长对反相色谱分离的影响1-尿嘧啶；2-苯酚；3-乙酰苯；4-硝基苯；5-苯甲酸甲酯；6-甲苯可见：反相键合色谱中，键合相碳链越长，分离效果越好。二、离子交换色谱此法是利用离子交换原理和液相色谱技术相结合，测定各类阴、阳离子的分离分析方法。它既适于无机离子，也适于有机物分离，如蛋白质、氨基酸、核酸等。1.原理：利用不同待测离子对固定相的亲和能力（或离子交换能力）的差别来实现分离的。待测离子与离子交换树脂固定相上带电荷基团或游离的离子发生可逆交换反应：对阳离子，滞留顺序为：Fe3+,Ba2+,Pb2+,Sr2+,Ca2+,Ni2+,Cd2+,Cu2+,Co2+,Zn2+,Mg2+,UO22+,Tl+,Ag+,Cs+,Rb+,K+,NH4+,Na+,H+,Li+

对阴离子，滞留顺序为：柠檬酸根,SO42-,C2O4,I-,HSO4-,NO3-,CrO42-,Br-,SCN-,Cl-,HCOO-,CH3COO-,OH-,F-

思考：待测阳离子电荷越小、其水合离子的半径越大，则越先出峰？对吗？2.固定相按离子交换剂类型分四种：

按固定相制作方法可分为：多孔型离子交换树脂(包括微孔型和大孔型)；表面多孔型(包括薄膜型）离子交换树脂；离子交换键合型。1）多孔型：聚苯乙烯+二乙烯苯交联，分微孔型和大孔型。交换基团多——交换容量大，稳定。但易溶胀，传质慢、柱效低、分析速度慢。2）表面多孔型：薄膜型=惰性核+树脂薄层(1-2m)多孔型=惰性核+硅胶微球+树脂薄层。克服了多孔型离子交换树脂的不足，但交换容量低，柱子易超负荷。3）离子交换键合相：利用化学反应将离子交换基团键合到惰性载体表面。载体可以是薄壳玻珠，也可以是多孔硅胶微粒。使用后者为载体，可得到性能稳定、耐压、高柱效的柱子。微孔型