维持蛋白质结构的作用力

维持蛋白质结构的相互作用力

一、共价相互作用：（二硫键）

二硫键在胞外蛋白和胞内蛋白中的功能 二硫桥作为蛋白质结构花样的组成部分

蛋白质结构中原子间的相互作用可分为两类：共价相互作用和非共价相互作用。二硫键(-S-S-)又称作二硫桥或硫硫键：是指两个硫原子之间形成的化学键其键能很大，大约为30~100Kcal/mol

，因此是一种很强的化学键。它可以把不同的肽链或同一肽链的不同部分连接起来对稳定蛋白质的构象起着重要的作用。二硫键的形成：在细胞外大多数二硫键的形成是自发地，而在细胞内它需要细胞膜上的酶系统来将二硫键引入蛋白质。因为细胞是依靠很强的还原环境所维持的，例如5mM的还原谷胱甘肽和0.01mM的氧化谷胱甘肽，在这样的条件下蛋白质中二硫键的形成就不是自发的了二硫键在胞外蛋白中的功能：在胞外蛋白中二硫键决定了胞外蛋白的机械性质例如：角蛋白蛇毒毒素蛋白和其它的毒素蛋白、多肽激素消化酶、免疫球蛋白、溶菌酶以及牛奶蛋白等，在这些蛋白质中二硫键的作用对于结构的稳定SchematicmodelsofanantibodymoleculeandaFabfragment二硫键在胞内蛋白中的功能：二硫键决定了胞内蛋白的化学性质，新合成的蛋白很少具有二硫键，通常胞内蛋白中的二硫键只与功能相关而与结构稳定无关。Thirodoxin（硫氧还蛋白）

systemSchemeofelectronflowinthethioredoxinsystem.ElectronsfromNADPHareusedtoreducethioredoxinreductase(TrxR)(aNADPH-dependentflavoprotein),whichinturnreducesthioredoxin(Trx).Reducedthioredoxinisabletoreducedisulfidebondsinawidearrayofproteinsubstrates.还原状态氧化状态Thioredoxin

in

yeastBaoetal.2007ThioredoxinreductaseinyeastZhangetal.2008ComplexofTrxandTrxrinE.coliLennonetal.,Science2000二、非共价相互作用

蛋白质的空间结构主要是由非共价相互作用所维系的。弱的相互作用力使得非共价键易于断裂，使蛋白质分子具有柔性。主要非共价相互作用力:范得华相互作用,静电相互作用,疏水相互作用,氢键和盐键等类型键能(Kcal/mol)

色散力－C－H……H―C―

0.03静电相互作用－COO……H3N－

5C=O……O=C0.3氢键C－H……O4N－H……O=

3疏水相互作用+

+

－

－

蛋白质结构中的非共价相互作用

1、范得华相互作用:原子间以及被化学键所饱和的分子间存在着弱的相互吸引力①静电力（葛生力Keeson）；②诱导力(Debye力)；③色散力（London力）。

三种范得华相互作用中，色散力是占主要地位的相互作用力。

极性基团偶极矩之间的静电力（葛生力Keeson）：极性分子的永久偶极之间存在静电相互作用，作用力的大小和它们的相对取向及距离相关。诱导力(Debye力)：得拜提出除极性分子间有静电相互作用外，非极性的对称分子与具有永久偶极的极性分子相互作用，可使非极性分子中的电荷密度发生形变，产生诱导偶极矩。这种极性分子的永久偶极矩与非极性对称分子诱导偶极矩之间的相互作用称为诱导力。色散力London力:非极性分子中的原子和分子的原点振动引起的,动态极化可使在某一瞬间电子云的重心偏离核正电荷的中心使得非极性分子产生瞬间偶极矩,此瞬间偶极矩将在邻近分子中诱导出偶极矩，这种瞬间偶极矩与诱导偶极矩的相互作用力称作色散力范得华相互作用可用Lennard-Jones势函数表达:当两个原子或分子相距较远时范得华引力较明显，而当它们彼此接近达到一定距离时开始出现排斥若进一步接近则表现出很强的排斥力。色散力是占主要地位的相互作用力。原子共价键类型范得华半径(Å)氢1.00

双键1.60碳芳香环1.70酰胺1.50氧1.35氮芳香环1.70硫酰胺1.45蛋白质分子中的原子范得华半径

范得华力的距离常用范得华半径来表示两个原子间的范得华距离，近似地为两原子间的接触距离。2、静电相互作用:因为分子中不同类型的原子形成共价键时成键电子的分布是不对称的，因此分子中大多数的原子都带有部分电荷，另外蛋白质分子中极性氨基酸的侧链也带有部分电荷。

蛋白质的静电相互作用可分为蛋白质分子内部的静电相互作用和蛋白质分子外部与周围环境即溶剂的静电相互作用。

计算静电相互作用基本方程为Poisson方程：V2(r)=-4

(r),(r)：位置函数；(r)：电荷密度。

3、氢键:氢键是通过氢原子参与成键的特殊形式的化学键当一个电负性较强的原子与氢键合后，继续与另一个电负性较强的原子键合：

X－－H＋......Y－氢键是稳定蛋白质二级结构的主要因素。氢键的本质是X—H之间为极性的共价结合。电负性较强的X原子将氢原子的电子云拉向自己一方，使X—H变为偶极元，从而使X原子带有部分负电荷，而氢原子则带有部分正电荷。当带有部分正电荷的H和具有孤电子对电负性较强的Y原子接近时它们之间存在着静电引力，于是便形成了带部分共价键性质的氢键。氢键的键能一般为-3~-6Kcal/mol，介于范得华力和共价键之间，这样的能量表明氢键既有足够的稳定性，提供显著的结合能，又可以迅速解离。氢键类型供体－受体的距离―O―HO2.8±0.1―O―HO＝C2.8±0.1N－HO＝C2.9±0.1N－HO－2.9±0.1N－HN3.1±0.2N－HS3.7蛋白质分子中的氢键

对氢键形成特别重要的氨基酸

酪氨酸、苏氨酸和丝氨酸的侧链还有羟基；谷氨酰胺和天冬酰胺的侧链酰胺基团；有时，侧链原子常常与被捕获到的蛋白质内部的水分子形成氢键，而有时两个供体或受体基团之间共享一个氢键（分叉氢键）。4、疏水相互作用：疏水相互作用是由于非极性基团的存在，引起了水分子的结构重排，形成了水和水之间的氢键网络，使水的有序度增加而使熵降低。

维持蛋白质三级结构最主要的因素是疏水相互作用。非极性分子在水中倾向于聚集在一起以减少表面积，这也就是蛋白质分子中疏水内核形成的原因。疏水性的一个重要特点是它的可加和性，即一个大分子的疏水性可由组成它的基团的相对疏水性的加和得到。蛋白质分子疏水作用大小的衡量是将一个去折叠的蛋白质分子的侧链从水中取出，然后放到一个折叠了的蛋白质分子内部，测量得到的自由能的变化，则表示疏水相互作用的大小。实验上是测量一个自由氨基酸在水中和非极性溶剂中（常用乙醇和二亚烷）的相对溶解度。ΔG转移

=

RTln[Snp/SH2O]ΔG转移为自由氨基酸由水中转移到非极性溶剂中的转移自由能，Snp和SH2O

为在非极性溶剂和水中的溶解度。假定甘氨酸的ΔG转移

=0，

将其它自由氨基酸的测量值相对甘氨酸进行标度，由此人们计算出了各种氨基酸的相对亲水性和相对疏水性。氨基酸相对亲水性(Kcal/mol)相对疏水性(Kcal/mol)氨基酸相对亲水性(Kcal/mol)相对疏水性(Kcal/mol)甘氨酸(Gly)00色氨酸(Trp)8.283.4亮氨酸(Leu)0.111.8酪氨酸(Tyr)8.52.3异亮氨酸(Ile)0.24(2.5)谷胺酰胺(Gln)11.77-0.3颉氨酸(Val)0.401.5赖氨酸(Lys)11.91(-4.2)丙氨酸(Ala)0.450.5天冬酰胺(Asn)12.09-0.2苯丙氨酸(Phe)3.152.5谷氨酸(Glu)12.58-9.9半胱氨酸(Cys)3.63(-2.8)组氨酸(His)12.620.5甲硫氨酸(Met)3.871.3天冬氨酸(Asp)13.31(-7.4)苏氨酸(Thr)7.270.4精氨酸(Arg)22.31(-11.2)丝氨酸(Ser)7.45-0.3脯氨酸(Pro)

(-3.3)氨基酸侧链的相对疏水性和亲水性

5、盐键

当一个氨基酸的氨基和与它空间相邻的另一个氨基酸的羧基互相靠近时，形成盐键。-COO......H3N-♁相邻的氨基和羧基的结合能大约为5.0Kcal/mol左右三、蛋白质工程

蛋白质工程的目的之一是提高蛋白质的稳定性。蛋白质的去折叠和折叠态之间的自由能变化之差来衡量：

ΔG＝GD－GN

蛋白质分子的天然构象不一定是自由能最低，最稳定的构象。研究发现几乎所有的天然蛋白质分子的稳定性都介于ΔG5-15Kcal/mol之间，这一性质可能和其生物学功能相关。同时这一性质也使人们有可能通过蛋白质工程的方法来提高蛋白质分子的稳定性。

在蛋白质工程研究中，人们拟从下面几个方面对蛋白质分子进行改造，以图提高蛋白质分子的稳定性：

1、疏水相互作用

2、静电相互作用

3、氢键

4、二硫键

疏水相互作用被认为是蛋白质折叠的主要驱动力，蛋白质分子中的疏水基团暴露于溶剂中往往会引起不利于蛋白质折叠的自由能变化，将氨基酸从水中转移到有机溶剂中的转移自由能的大小可用来衡量疏水相互作用的大小。Methews等人对T4溶菌酶中的Ile做了11种的不同氨基酸残基的替换，研究发现该蛋白质的稳定性和转移自由能之间存在着直接的比例关系，通过计算蛋白质折叠过程中溶剂可接触表面积的变化来评估疏水相互作用对蛋白质稳定性的影响。1疏水相互作用2静电相互作用蛋白质分子的静电相互作用包括带电基团以及原子上的部分电荷之间的相互作用。定点突变的实验结果表明静电相互作用对稳定性的影响依赖于带电基团的位置，例如在a螺旋的N端附近引入酸性氨基酸或在C端附近引入碱性氨基酸均可以提高蛋白质分子的稳定性。静电相互作用与溶液的pH值相关并受溶液中其它的离子的影响。3氢键氢键对蛋白质空间结构的稳定性极为重要，特别是对二级结构的形成起着关键的作用。Bryan等人用随机突变的方法诱变枯草杆菌蛋白酶BPN的基因筛选到的一个耐热突变型蛋白酶序列,测定表明是其218位的一个Asn变成了Ser。该突变酶的1.8A分辨率的空间结构测定表明Asn218变为Ser218后使得蛋白质结构中的一条β链中的另外两对氢键的几何构型得到改善，因此分子内的氢键的增加使得蛋白质结构更加稳定，从而提高了枯草杆菌蛋白酶的热稳定性。4二硫键引入二硫键可以减少蛋白质去折叠的构型熵，因此可以提高蛋白质分子的稳定性。但是引入二硫键的前提是二硫键的引入不能同时增加结构张力。在蛋白质分子中引入二硫键来提高蛋白质热稳定性的成功实验首先来自于对T4溶菌酶和l阻遏蛋白的蛋白质工程研究人们将T4溶菌酶的Ile3换成Cys3使之能与第97位的Cys形成二硫键NAD：烟酰胺腺嘌呤二核苷酸Astereoviewshowingtheextensivehydrogenbonds(dashedlines)madebyNAD+withLeu179,Ser198,Glu199,Arg204,Leu266,Leu268andIle291(residuesshowninpink).ManyvanderWaalcontactsaremadewithothersurroundingresidues.Thewatermoleculethatisconservedindi-nucleotidebindingproteinscontainingtheRossmannfoldisalsoshown.InTkTDH,thiswaterformsfourhydrogen