神经节苷脂诱导胶质瘤细胞自噬性死亡

神经节苷脂诱导胶质瘤细胞自噬性死亡马明明;王雪晶;丁雪冰;张钱林;贺爽;张杰文(GM1)U251GM1U251MTTMDCLC3-Ⅱ的表达;WesternblottingLC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值、Lamp-2a、Beclin-1,GM148h,U251细胞存活率明显降低,且具有剂量依赖性,差异有统计学意义(P<0.05);与对照组相比,GM148h,U251LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值、Lamp-2aBeclin-1的表达水平明显上调,差异有统计学意义(P<0.05)GM1U251【期刊名称】《肿瘤基础与临床》【年(卷),期】2012(025)004【总页数】3页(P281-283)【关键词】自噬性死亡;神经节苷脂;U251细胞【作者】马明明;王雪晶;丁雪冰;张钱林;贺爽;张杰文【作者单位】河南省人民医院神经内科,河南,郑州,450003;郑州大学第一附属医院神经内科,河南,郑州,450052;河南省人民医院肾脏内科,河南,郑州,450003;河南省人民医院神经内科,河南,郑州,450003;河南省人民医院神经内科,河南,郑州,450003;河南省人民医院神经内科,河南,郑州,450003【正文语种】中文【中图分类】R730.264;R730.23神经节苷脂(monosialotetrahexosy1ganglioside，GM1)是哺乳类动物细胞膜的重要组成部分。以往研究［1GM1目前研究［2GM1U251GM1U251细胞培养人脑胶质瘤细胞系U251购于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，常规培养于含体积分数12%胎牛血清的DMEM完全培养液中，置于37℃、体5%CO21～2190%后，以消化液(含质量分数0．30%胰蛋白酶和质量分数0．05%EDTA)消化，1∶4比例稀释、培养。MTTU251963×103/孔)，次日对照组给予常规DMEM培养液，实验组分为5个浓度组，分别加入0、50100、250μg·mL－1GM1，448h10μLMTT90μLDMEM，37℃2h150μLDMSO570nmA/A×100%。0、50、100、250μg·mL－1GM1，48hPBSAnnexin120μL，8μLAlexaFluor488AnnexinⅤ和2μL100μg·mL－1PI工作液，室温下孵育15min，向标本中加入400μLAnnexin结合缓冲液，在冰上轻轻混匀，立即将标本用流式细胞仪分析。Westernblot250μg·mL－1GM12448h细胞，提取总蛋白并检测。经SDS电泳，湿转至PVDF膜后封闭，一抗4℃过夜，加入HRP标记的二抗，杂交炉孵育2h，暗室中行X线胶片曝光，GAPDH设为内参。U2511245min15%BSA(0．25%TritoX-100)封闭，PBS3Hochest33258(1∶10000)，3min，用OlympusIX70SPSS13．0¯x±stα=0．05。GM1U251MTT0、50、100、250μg·mL－1GM148hU251(98．0±8．2)%、(79．3±12．2)%、(62．2±14．3)%、(51．2±7．3)%;与对照组比较，差异有统计学意义(P0．051。GM1U2510、50100、250μg·mL－1GM148h后，U251细胞凋亡率为(2．1±0．3)%、(4．0±0．5)%、(20．1±8．1)%、(40．2±7．0)%;与对照组比较，差异有统计学意义(P0．052。WesternblotLC3、Lamp-2a、Beclin-1GM1LC3-Ⅱ表达水平，250μg·mL－1GM10、24、48hLC3-Ⅱ表达水平逐渐上调，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值逐渐上调，明显高于对照组(P＜0．05);与对照组相比，Lamp-2aP＜0．05);与对照组相比，Beclin-10．05。LC3-Ⅱ表达荧光显微镜下可见，250μg·mL－1GM1给药0、48h后，U251细胞内出现LC3-Ⅱ表达高亮点，呈颗粒状聚集，说明自噬体形成，而对照组无此现象。见图4。细胞有2种死亡方式:细胞坏死和程序性细胞死亡，其中程序性细胞死亡有Ⅰ型(细胞凋亡)和Ⅱ型(自噬性细胞死亡)2种［3]。自噬是指溶酶体降解利用细胞内物质成分的过程［4]。细胞自噬的主要生理功能是及时清除细胞中产生的"垃圾"(如破损或衰老的细胞器、折叠错误的蛋白质等)，维持细胞内稳态。因此，无论是肿瘤细胞还是正常细胞，保持一种基础低水平的自噬活性对细胞的生理活动至关重要，但过度细胞自噬则引起细胞的过量损伤导致细胞死亡［5]。神经系统原发性肿瘤60%为胶质瘤，恶性胶质瘤预后差，平均生存周期不超过1a［6]。手术是胶质瘤的主要治疗方式，但侵袭到远处的瘤细胞，往往难以清除，是唑胺能够诱导恶性胶质瘤细胞发生自噬，3－甲基腺嘌呤在抑制替莫唑胺诱导自噬bafilomycinA1caspase-3BNIP3［8]。姜黄素能够抑制该通路诱导自噬性恶性胶质瘤细胞死亡从而产生抗肿瘤效果［9]。原人参萜AktU87MGGM1U251GM1U251U251U251过程;为GM1治疗恶性脑胶质瘤提供了新的理论依据。【相关文献】［1]KarpiakSE，MahadikSP．ReductionofcerebraledemawithGM1ganglioside［J]．JNeurosciRes，1984，12(2/3):485－492．［2]LedeenRW，WuG．GM1ganglioside:anothernuclearlipidthatmodulatesnuclearcalcium．GM1potentiatesthenuclearsodiumcalciumexchanger［J]．CanJPhysiolPharmacol，2006，84(3/4):393－402．［3]BurschW．Theautophagosomal-lysosomalcompartmentinprogrammedcelldeath［J]．CellDeathDiffer，2001，8(6):569－581．［4]SapunarD，VilovicK，EnglandM，etal．Morphologicaldiversityofdyingcellsduringregressionofthehumantail［J]．AnnAnat，2001，183(3):217－222．［5]LiF，VierstraRD．Autophagy:amultifacetedintracellularsystemforbulkandselectiverecycling［J]．TrendsPlantSci，2012．［6]SchwartzbaumJA，FisherJL，AldapeKD，etal．Epidemiologyandmolecularpathologyofglioma［J]．NatClinPractNeurol，2006，2(9):494－503．［7]KanzawaT，GermanoIM，KomataT，etal．Roleofautophagyintemozolomide-inducedcytotoxicityformalignantgliomacells［J]．CellDeathDiffer，2004，11(4):448－457．［8]KanzawaT，ZhangL，XiaoL，etal．ArsenictrioxideinducesautophagiccelldeathinmalignantgliomacellsbyupregulationofmitochondrialcelldeathproteinBNIP3［J]．Oncogene，2005，24(6):980－991．［9]ShinojimaN，YokoyamaT，KondoY，etal．RolesoftheAkt/mTOR/p70S6KandERK1/2signalingpathwaysincurcumin-inducedautophagy［J]．Autophagy，2007，3