第13章 维生素类药物的分析

第十三章维生素类药物的分析概述维生素：是维持人体正常代谢机能所必需的微量营养物资。人体不能合成维生素。如果人体缺少某种维生素，就会引起维生素缺乏症，而影响人体的正常生理机能。如：人体缺少VA,夜盲症.

人体缺少VC,坏血病.

VitA、D2、D3、

E、K1

等脂溶性水溶性

VitB族(B1、B2、B6、B12)

VitC、叶酸、烟酸、烟酰胺VitMVitPP对维生素类药物的分类，目前仍按它们的溶解性质分为-H维生素A醇-COCH3维生素A醋酸酯-COC15H31维生素A棕榈酸酯R:第一节脂溶性维生素类药物的分析一、维生素A的分析（一）化学结构与性质1、化学结构为一个具有共轭多烯侧链的环己烯（一）结构与性质一、具有UV吸收存在多种立体异构化合物维生素A325.5100%新维生素Aa32875%新维生素Ab320.524%新维生素Ac310.515%异维生素Aa32321%异维生素Ab32424%相对生物效价VitA2VitA3易发生脱氢、脱水、聚合反应鲸醇△或有金属离子存在时氧化↑共轭多烯侧链易被氧化（二）环氧化物VitA醛VitA酸（三）与三氯化锑发生呈色反应CHCl3溶解性（四）不溶于水易溶于有机溶剂和植物油等三氯化锑反应（一）条件无水无醇CHCl3鉴别二、蓝色紫红（BP（1998））λmax为326nm一个吸收峰UV法（二）λmax为350～390nm三个吸收峰去水VitA（VitA3）↓VitAUSP显色剂磷钼酸规定斑点颜色和Rf值BP

对照品法显色剂三氯化锑TLC法（三）含量测定三、紫外分光光度法－三点校正法维生素A的含量测定，过去曾用SbCl3比法。但由于SbCl3比色法呈色极不稳定，测定结果受水份、温度影响较大，反应专属性差，目前已被紫外分光光度法所替代。但由于SbCl3比色法操作简便、快速，所以目前对食品或饲料中维生素A的测定仍常用SbCl3比色法。这里我们主要介绍紫外分光光度法。（一）

UV法由于在维生素A的分子中具有共轭多烯的结构，所以具有特征的紫外吸收。这样，就可以用紫外分光光度法测定维生素A的含量。但是，由于在维生素A中，有很多结构相似的相关物质，这些相关物质在维生素A的最大吸收波长附近也有吸收（相关物质产生的吸收叫不相关吸收），这些吸收对测定有影响。为了消除不相关吸收的影响，准确测出维生素A的含量，Morton和Stubbs等人提出了一个校正公式－三点校正法，用来测定维生素A的含量杂质：立体异构体、氧化产物及光照产物、合成中间体、去氢维生素A（VitA2）、去水维生素A（VitA3）三点校正法1.条件：（1）杂质的吸收在310~340nm波长范围内呈一条直线，且随波长的增大吸收度减小；（2）物质对光的吸收具有加和性。波长的选择：三点校正法，即用三个波长点的吸光度对维生素A样品的吸光度进行校正。所以在测定时，需要选择三个测定波长。这三个波长的选择方法是：（1）1

VitA的max（328nm）（2）23

分别在1的两侧各选一点ⅰ．这两个波长分别在1两侧十几个nm处，即（等波长差法）ⅱ．VA在这两个波长下的吸光度应该等于1下的吸光度的6/7，即A2=A3=6/7A1（等吸光度法）当然，在这三个波长的范围内，杂质的吸收应为一条直线测定对象VitA醋酸酯第一法等波长差法第二法等吸收度法(皂化法)测定对象VitA醇测定法（1）基本步骤:第一步A选择选择依据：所选A值中杂质的干扰已基本消除注意：

C为混合样品的浓度第二步求第三步求效价换算因数由纯品计算而得：第四步：求标示量％方法：（2）

第一法维生素A醋酸酯判断是否在326～329nm之间在326～329nm之间改用第二法是否求算并与规定值比较

规定值差值

判断差值是否超过规定值的有一个以上超过无超过

计算A328（校正）

用A328计算03%－15%－3%第二法第二法

VitAD胶丸中VitA的含量测定

精密称取本品(规格10000VitAIU/丸)装量差异项下（平均装量0.08262g/丸）的内容物0.2399g至250ml量瓶中，用环己烷稀释至刻度，摇匀；精密量取2.0ml，置另一20ml量瓶中，用环己烷稀释至刻度，摇匀。以环己烷为空白，测定最大吸收波长为328nm，并在下列波长处测得吸收度为A300：0.354A316：0.561A328：0.628A340：0.523A360：0.216A300/A328：0.555A316/A328：0.907A328/A328：1.000A340/A328：0.811A360/A328：0.299求本品中维生素A的含量？A300/A328：0.564A316/A328：0.893A328/A328：1.000A340/A328：0.833A360/A328：0.3440.5550.9071.0000.8110.299

+0.01－0.010+0.02+0.04－－－－－=====适用于维生素A醇（等吸收度法）第一法无法消除杂质干扰时用此法[皂化法、6/7A法]（3）第二法水溶性脂溶性判断max是否在323～327nm之间取未皂化样品采用色谱法纯化后再测定计算是否判断A300/A325是否大于0.73是否取未皂化样品采用色谱法纯化后再测定计算A325(校正)03%－3%三氯化锑比色法（二）优点简便快速λmax618nm～620nm标准曲线法缺点呈色不稳定（5~10s内）水分干扰与标准曲线温差≤1℃专属性差三氯化锑有腐蚀性苯并－二氢吡喃醇三维生素E

名称R1R2相对活性α-生育酚β-生育酚γ-生育酚δ-生育酚CH3CH3HHCH3HCH3H1.00.50.20.1***生物效价右旋体：消旋体=1.4：10（天然品）（合成品）dl－α－生育酚醋酸酯结构与性质一、苯环+二氢吡喃环+饱和烃链1、易溶于有机溶剂，不溶于水2、UV3、酯键易水解△75℃15′（一）硝酸反应橙红色鉴别二、（橙红色）生育红生育酚HNO3强氧化剂取本品约30mg，加无水乙醇10ml溶解后，加硝酸2ml，摇匀，在75℃加热15分钟，溶液应显橙红色。三氯化铁－联吡啶反应△[O]（二）生育酚对-生育醌[O]弱氧化剂红色=41.0～45.5λmax=284nmλmin=254nm0.01%无水乙醇中UV法（三）维生素EUV图薄层板硅胶G展开剂环己烷-乙醚（4：1）显色剂硫酸（105℃5′）VitE

Rf

=0.7TLC法（四）游离生育酚硫酸铈滴定液（0.01mol/L）二苯胺（亮黄→灰紫）利用游离生育酚的还原性，将硫酸铈还原成硫酸亚铈检查

三、原理（一）试剂（二）（M生育酚=430.8）例取本品0.10g，加无水乙醇5ml溶解后，加二苯胺试液1滴，用硫酸铈液（0.01mol/L）滴定，消耗硫酸铈液（0.01mol/L）不得过1.0ml。≤2.15％限量（三）药典规定消耗硫酸铈液（0.01mol/L）≤1.0ml设：应消耗硫酸铈液≤Vml 0.01×1.0＝实际浓度×V若硫酸铈液浓度不是0.01000mol/L，应重新计算硫酸铈的消耗量例

Ce(SO4)2=0.01020mol/L四、含量测定GC法（一）GC特点1、选择性好灵敏度高速度快分离效能好挥发性低、不稳定、极性强→衍生化易受样品蒸气压限制载气→N2固定液→硅酮（OV-17）担体→硅藻土或高分子多孔小球柱温→265℃检测器→氢火焰离子化检测器(FID)内标→正三十二烷

n≥500R≥2VitE测定的色谱条件2、内标法加校正因子内标法供试液（样品+内标）内标物对照液（对照+内标）是样品中不存在的物质与被测组分峰靠近能与各组分完全分离与被测组分的量接近校正因子：实际工作中的计算方法例内标液

取正三十二烷加正己烷溶解并稀释成1.0mg/ml溶液对照液

精密称取VitE对照品0.2011g

置棕色具塞锥形瓶中，精密加入内标液10ml，密塞，振摇使溶解，取

1~3ul注入GC仪，测定，计算供试液

精密称取供试品0.1998g置棕色具塞锥形瓶中，精密加入内标液

10ml，密塞，振摇使溶解，取1~3ul

注入GC仪，测定，计算对照液供试液0.3730.368本品含C31H52O3应为96.0~102.0%BPGC

内标正三十二烷

R≥1.4USPGC

内标十六酸十六醇酯

R≥1.0JPHPLC

外标dl－α－生育酚

R≥1.4利用生育酚的易氧化性还原型氧化型二苯胺（亮黄→灰紫）△原理1、铈量法（二）指示剂2、防止Ce(SO4)2的水解减慢生育酚被O2氧化速度C、酸性条件Ce(SO4)2易溶于水生育酚易溶于醇B、溶剂分子量较大，反应慢易被O2氧化A、反应速度H2SO4讨论3、含量计算4、MVitE

=472样品→dl－α－生育酚固定相→十八烷基硅烷键合硅胶流动相→甲醇-水（49：1）检测波长→292nmR＞2.6RSD≤0.8%JP-RP-HPLC法（外标法）（三）测定对象→血清中VitA和VitE固定相→十八烷基硅烷键合硅胶流动相→甲醇-水（96：4）检测波长→8′前330nm8′后292nmRP-HPLC法（外标法）（四）氨基嘧啶环－CH2－噻唑环(季铵碱)第二节水溶性维生素类药物的分析HClCl-一、维生素B1（一）溶解性1、易溶于水2、水溶液呈酸性（二）UV共轭双键λmax=246nm结构与性质一、嘧啶环——伯氨噻唑环——季铵1、可与酸成盐2、与生物碱↓→↓3、含量测定——非水碱量法（三）硫色素反应（四）碱性ChP鉴别试验二、（一）硫色素反应硫色素＋2HVitB1H+H+H+H+（二）沉淀反应S元素反应Cl-反应（三）其他反应三、含量测定喹那啶红－亚甲蓝（紫红→天蓝）（一）非水溶液滴定法UV法（二）片剂、注射剂=421（每片）相当于标示量的%=A=ECL规格g/片g/100mlgChP（每ml）相当于标示量的%=规格g/mlml准确度高灵敏度低操作繁琐设备简单（三）硅钨酸重量法重量法特点1、原理2、2×337.273479.22

取本品约50mg，精密称定，加水50ml溶解后，加盐酸2ml，煮沸，立即滴加硅钨酸试液4ml，继续煮沸2分钟，用80℃恒重的垂熔玻璃坩埚滤过，沉淀先用煮沸的盐酸溶液（1→20）20ml分次洗涤，再用水10ml洗涤1次，最后用丙酮洗涤2次，每次5ml，在80℃干燥至恒重，精密称定，所得重量与0.1939相乘，即得测定方法3、例

精密称取本品0.0519g，加水50ml溶解，加盐酸2ml煮沸，立即滴加硅钨酸试液4ml，继续煮沸2分钟，用80℃恒重的垂熔玻璃坩埚滤过，沉淀先用煮沸的盐酸溶液（1→20）20ml分次洗涤，再用水10ml洗涤1次，后用丙酮洗涤2次，每次5ml。在80℃干燥至恒重，称得沉淀重量为0.2557g。求本品的含量按干燥品计算为多少？(本品干燥失重项下测定结果为3.73%)A.取样量±50mg提高灵敏度B.80℃

保持4个H2OC.HCl

增大沉淀颗粒D.硅钨酸：VitB1=8：1

使沉淀完全E.硅钨酸边搅拌边缓慢加入增大沉淀颗粒实验条件4、NaOH（四）硫色素荧光法原理1、激发波长365nm发射波长435nm方法与计算2、+NaOH+铁氰化钾+异丁醇+NaOH+异丁醇+NaOH+铁氰化钾+异丁醇+NaOH+异丁醇SdAb对照液供试液特点3、（1）灵敏度高，线性范围宽（2）代谢产物不干扰，适用于体液分析二维生素CL－抗坏血酸1、易溶于水2、水溶液呈酸性结构与性质一、（一）溶解性二烯醇结构二酮基结构二烯醇结构（二）强还原性有活性有活性无活性△糖类的显色反应50℃结构与糖类相似（三）具糖的性质C3－OH的pKa=4.17C2－OH的pKa=11.57酸性（四）一元酸L(+)－抗坏血酸活性最强手性C（C4、C5）（五）光学活性**与碱反应（六）水解反应（七）UV特征与氧化剂的反应（一）鉴别试验二、1、与AgNO3反应2、与2，6-二氯靛酚反应(ChP2000)氧化型玫瑰红色还原型蓝色OHˉ(ChP2000)（玫瑰色）（无色）3、与碱性酒石酸铜反应USP4、与KMnO4反应糖类的反应（二）或盐酸50℃吡咯USP（蓝色）(糠醛)（戊糖）50℃(吡咯)UV（三）BP0.01mol/LHCl指示剂淀粉指示液原理1、碘量法（一）含量测定三、H+取本品约0.2g，精密称定，加新沸过的冷水100ml与稀醋酸10ml使溶解，加淀粉指示液1ml，立即用碘滴定液（0.1mol/L）滴定，至溶液显蓝色，在30秒内不褪。每1ml碘滴定液(0.1mol/L)相当于8.806mg的C6H8O6方法2、（1）酸性环境d.HCl

（2）新沸冷H2O减慢VitC被O2氧化速度讨论4、（3）立即滴定赶走水中O2减少O2的干扰（4）附加剂干扰的排除片剂——滑石粉——过滤注射剂——抗氧剂——丙酮甲醛Na2SO3NaHSO3

Na2S2O3Na2S2O5CHHOOaS3aSO+H2NHON2252HONHCOS3a2，6-二氯靛酚钠滴定法法（二）USPJP原理1、自身指示终点法方法2、（2）快速滴定

2min内

（1）酸性环境HPO3-HAc

稳定VitC防止其他还原性物质干扰（3）剩余比色测定

（定量过量）（测剩余染料）讨论3、（4）缺点

需经常标定贮存≤一周不稳定干扰多氧化力较强HPLC法（三）1、HPLC的优点灵敏度高选择性高分离分析同步微量分析干扰少

快速2、HPLC法分离VitC常用方法及测定对象

对象制剂、生物样品、果汁方法离子交换色谱法离子对色谱法分配色谱法（正、反相）血、尿、组织、细胞等例多种维生素片中VitA、VitB1、VitB2

、VitB6

、烟酰胺、VitC、VitE的含量测定色谱柱

ODS流动相

A、水-甲醇（4：1）

B、甲醇

（梯度洗脱）抗氧剂

二巯基丙烷磺酸钠水溶性维生素

离子对色谱法（樟脑磺酸）内标法+校正因子内标物——苯酚脂溶性维生素

外标法108．在三氯醋酸或盐酸存在下，经水解、脱羧、失水后，加入吡咯即产生蓝色产物的药物应是

A.氯氮卓

B.维生素AC.普鲁卡因

D.盐酸吗啡

E.维生素C99：88．中国药典（2000年版）采用以下何法测定维生素E含量

A.酸碱滴定法

B.氧化还原法

C.紫外分光光度法

D.气相色谱法

E.非水滴定法98：79．中国药典（2000年版）采用气相色谱法测定维生素E含量，内标物质为

A.正二十二烷

B.正二十六烷

C.正三十烷

D.正三十二烷

E.正三十六烷99：77.下列药物的碱性溶液，加入铁氰化钾后，再加正丁醇，显蓝色荧光的是

A.维生素AB.维生素B1

C.维生素CD.维生素DE.维生素E97：77．既具有酸性又具有还原性的药物是

A.维生素AB.咖啡因

C.苯巴比妥

D.氯丙嗪

E.维生素C99m：132.维生素C的鉴别反应，常采用的试剂有

A.碱性酒石酸铜

B.硝酸银

C.碘化铋钾

D.乙酰丙酮

E.三氯醋酸和吡咯99m：84.测定维生素C注射液的含量时，在操作过程中要加入丙酮，这是为了

A.保持维生素C的稳定

B.增加维生素C的溶解度

C.使反应完全

D.加快反应速度

E.消除注射液中抗氧剂的干扰98：85.能发生硫色素特征反应的药物

是

A.维生素AB.维生素B1

C.维生素CD.维生素EE.烟酸97：81．使用碘量法测定维生素C的含量,已知维生素C的分子量为176.13，每1ml碘滴定液

(0.1mol/L)相当于维生素C

的量为

A.17.61mgB.8.806mgC.176.1mgD.88.06mgE.1.761mg97：[121—125]（99：[121—125]）

可发生以下反应或现象的药物为

A.维生素B1B.维生素CC.两者均能D.两者均不能

121.与碘化汞钾生成黄色沉淀

122.麦芽酚反应

123.在乙醚中不溶

124.与2,6-二氯靛酚反应使颜色消失

125.硫色素反应ADCBA115．维生素A的鉴别试验为

A.三氯化铁反应

B.硫酸锑反应

C.2,6-二氯靛酚反应

D.三氯化锑反应

E.间二硝基苯的碱性乙醇液反

应77．中国药典（2000年版）规定维生素A的测定采用紫外分光光度法（三点校正法），此法又分为

A．等波长差法

B．等吸收度法

C．6/7A法

D．差示分光法

E．双波长法78．维生素E的鉴别试验有

A．硫色素反应

B．硝酸氧化呈色反应

C．硫酸-乙醇呈色反应

D．碱性水解后加三氯化铁乙醇液与2,2-联吡啶乙醇液呈色反应

E．Marquis反应80.下面哪些描述适用于维生素AA.分子具有长二烯醇侧链，易被氧化

B.具有较长的全反式共轭多烯结构

C.含酯键，经水解后产生苯并二氢吡喃衍生物，易被氧化

D.与三氯化锑的无醇氯仿液中呈不稳定兰色，很快转变为紫红色

E.样品用无水乙醇溶解后，加硝酸加热后，呈橙红色

维生素A与

反应即显蓝色，渐变成紫红色；反应需在

条件下进行。（）维生素A分子中由于具有共轭多烯侧链，因而其性质很稳定，不易被氧化变质。三氯化锑无水×

维生素E在酸性或碱性溶液中加热可水解生成游离

，当有氧或其他氧化剂存在时，则进一步被氧化成醌型化合物，尤其在碱性下更易发生。生育酚

维生素B1的噻唑环在

介质中可开环，再与嘧啶环上氨基缩合环合，然