发酵工程-菌种的衰退、复壮和保藏

菌种的衰退、复壮和保藏李敏04.14.2016①能在廉价原料上快速生长；②生长条件易于掌控；③对设备和操作方式适应性强；④菌株生产性能稳定性强；⑤产物产量高，积累浓度高；⑥产物的回收容易；⑦抗杂菌、抗噬菌体能力强；⑧菌体不是病原菌。发酵菌种的基本要求(1)微生物保藏单位获取(2)自然界分离(3)野生菌株诱变(4)基因重组(5)动植物细胞发酵菌种获得的一般途径

性状稳定的菌种是微生物学工作最重要的基本要求，否则生产或科研都无法正常进行。

影响微生物菌种稳定性的因素：a）变异b）污染c）死亡一、菌种的衰退菌种的退化

变异有正变（自发突变）和负变两种，负变即菌株生产性状的劣化或有些遗传标记的丢失均称为菌种的退化。一、菌种的衰退衰退的表现

1）原有形态形状变得不典型；

2）生长速度变慢；

3）代谢产物生产能力下降；

4）对外界不良环境的抵抗力下降。

菌种退化现象：菌落颜色的改变，畸形细胞的出现等菌株生长变得缓慢，产孢子越来越少直至产孢子能力丧失菌种的代谢活动，代谢产物的生产能力或其对寄主的寄生能力明显下降菌种退化的原因菌种退化的主要原因是有关基因的负突变。突变在数量上的表现依赖于传代旺盛细胞，发生突变的机率比处于休眠状态的细胞大得多。

菌种衰退的原因

1）基因自发突变（根本原因）

粘质赛氏杆菌（Serratiamarcescens)H-2892

菌株生产力：18g/L组氨酸，

五次传代后菌株生产力：4g/L

2）变异菌株性状分离随着菌种传代和核的分离也会使性状表现多样化，产量也会随之变化，即使是单核孢子发生突变时，如果双链DNA上仅一条链上某个位点发生变化，经移殖后也会出现性状分离。因此一个较稳定的变异株的获得必须经过多次分离纯化。

菌种衰退的原因剂量（以存活率计，%）菌落总数突变菌落数突变频率（突变菌落/103）不纯菌落（%）纯不纯100（对照）80~10060~8020~601~2012165120608553492298841134665195—122017280.0822716.722.6—43302113

变异菌株性状分离——不同剂量紫外线处理裂殖酵母时不纯菌落百分数在菌种筛选工作中经常遇到初筛摇瓶产量很高，复筛产量逐渐下降而被淘汰的现象，在霉菌中更为常见。

3）传代次数的影响，使负突变株的比例逐渐占了优势

个别细胞性状改变不足以引起菌种退化，经多次传代，退化细胞在数量上占优势，于是退化性状表现逐步明朗化，最终成为一株退化菌株。

菌种衰退的原因实验移接代数每代斜面保存时间（天）回复子比数腺苷产量（g/L）1234560267912147133，1447，3，9，3，71，1447，3，9，3，13，58，1447，3，9，3，13，8，3，47，447，3，9，3，13，8，3，4，14，6，6，311/4.5×1061/2.4×1061/2.2×1051/3.5×1051/5.3×1031/1.0×10313.514.910.713.18.17.4连续传代——产腺苷的黄嘌呤缺陷型菌株在接种传代过程中产量和回复子数量间的关系4）与培养条件有关的其它因素——温度、湿度、培养基成分及各种培养条件等。

如在保藏菌种中基因突变率就随温度降低而减少。

衰退是发生在微生物细胞群体中的一个由量变到质变的逐步演变的过程。

菌种衰退的原因菌种退化的原因

基因突变连续传代菌种退化生产保藏条件变化质粒脱落二、衰退的防止与复壮1.减少传代次数2.创造良好的培养条件3.利用不易衰退的细胞传代4.采用有效的菌种保藏方法（一）防止衰退的措施（一）防止退化的措施前期育种时需注意1.合理的育种，处理细胞用单核的，避免使用多核细胞；2.增加突变位点，减少分离回复；3.诱变处理后分离纯化，以保证保藏菌种纯；（1）控制传代次数

基因的变化往往发生在复制和繁殖过程中，繁殖越颇繁，复制的次数越多，基因发生变化的机会也就越多。因此应该尽量避免不必要的接种和传代，把传代次数控制在最低水平，以降低突变机率。（一）防止退化的措施（1）控制传代次数一般情况下，斜面每移植一代，霉菌、放线菌、芽孢杆菌在低温下可保藏半年左右，酵母可保藏3个月左右，无芽孢细菌可保藏1个月左右。为此，生产菌种每移植一代，最好同时移植较多的斜面，以供一段时间生产之需，这样移植次数就可减少。（一）防止退化的措施（2）选择合适的培养条件

培养条件对菌种衰退有一定的影响，选择一个适合原种生长的条件可以防止菌种衰退。另外，生产上应避免使用陈旧的斜面菌种。（一）防止退化的措施（3）利用不同类型的细胞进行传代

在放线菌和霉菌中，由于它们的菌丝细胞常含有许多核，甚至是异核体，因此用菌丝接种时就会出现衰退和不纯的子代。而孢子一般是单核的，利用孢子来接种，可以达到防止衰退的目的。但是这也必须注意到微生物细胞本身的特点。对构巢曲霉来说，利用它的分生孢子传代易发生衰退而用它的子囊孢子移种则不易退化。（一）防止退化的措施（4）选择合适的保藏方法

采用有效的菌种保藏方法也可以防止菌种的衰退。

采用有效的菌种保藏方法研究和制定出更有效的菌种保藏方法以防止菌种退化。（一）防止退化的措施（二）菌种的复壮1.从衰退的菌种群体中把少数个体再找出来，重新获得具有原有典型性状的菌种(狭义复壮，消极措施)。

a）纯种分离;b）通过寄主体进行复壮；纯种的分离方法

平板划线分离法

菌落纯

平板涂布分离法

平板倾注分离法

用“分离小室”进行单细胞分离

细胞纯

显微操纵器进行单细胞分离

菌丝尖端切割法进行单细胞分离稀释分离法显微操作：单细胞分离（二）菌种的复壮2.有意识地利用微生物会发生自发突变的特性，在日常的菌种维护工作中不断筛选“正变”个体(广义复壮，积极措施)

。举例：产链霉素放线菌菌种分离（从退化菌种中筛选）

取工业发酵液（含孢子）样品1环放入带玻璃珠的装有10ml无菌水的小三角瓶中，摇匀

采用稀释法制平板，获取单菌落

斜面保藏

高产菌恢复根据高产菌的特点，选择目的菌落

放大培养，发酵液性能测试三、菌种保藏的原理和方法菌种保藏的意义菌种是从事微生物学以及生命科学研究的基本材料，特别是利用微生物进行有关生产如抗生素、氨基酸、酿造等工业，更离不开菌种。所以菌种保藏是进行微生物学研究和微生物育种工作的重要组成部分。其任务首先是使菌种不致死亡，同时还要尽可能设法把菌种的优良特性保持下来而不致向坏的方面转化。三、菌种保藏的原理和方法国内菌种保藏机构

1979年7月，我国成立了中国微生物菌种保藏管理委员会(ChinaCommitteeforCultureCollectionofMicroorganisms．CCCCM)。并确定了与普通、农业、工业、医学、抗生素和兽医等微生物学有关的六个菌种保藏管理中心。中国微生物菌种保藏管理委员会（CCCCM）下设几个中心：1）中国工业微生物菌种保藏管理中心（ChinaCenterofIndustrialCultureCollection,CCICC)：负责全国工业生产与研究应用微生物菌种的收集、鉴定、保藏与供应等职责。现藏工业微生物菌种1750余株。国内菌种保藏机构2）林业微生物菌种保藏中心

1985年成立，由林科院负责，侧重林业微生物的菌种保藏，现保藏菌种690余株；国内菌种保藏机构3）中国科学院典型培养物保藏管理中心1996年成立，下设9个库：中国普通微生物保藏管理中心（CGMCC）；中国病毒保藏中心（CCGVCC）；细胞库；昆明细胞库；基因库；植物离体种质库；稀有濒危特有植物种质库；海洋生物种质库。现藏培养物16000个株系，其中菌株13000株。国内菌种保藏机构1）美国典型菌种保藏中心（ATCC）

位于马里兰州，现藏细菌8000株，丝状真菌4400株，酵母菌606株及其他菌种千余株。保藏方法主要以冷冻干燥和液氮超低温冻结法。2）荷兰真菌中心收藏所（CBS）位于荷兰巴尔恩市，现藏细菌1000株，丝状真菌13000株，酵母菌3500株。国外菌种保藏机构3）英国的国立标准菌种收藏所（NCTC）

英联邦真菌研究所（CMI）4）冷泉港研究室（CSH）美国5）日本东京大学应用微生物研究所（IAM）6）日本大阪发酵研究所（IFO）……国外菌种保藏机构菌种保藏的原理微生物菌种保藏，原理基本一致，即采用低温、干燥、缺氧、缺乏营养、添加保护剂或酸度中和剂等方法，挑选优良纯种，最好是它们的休眠体，使微生物生长在代谢不活泼，生长受抑制的环境中。菌种保藏的原理

菌种保藏主要是根据菌种的生理生化特点人工创造条件使孢子或菌体的生长代谢活动尽量降低，以减少其变异。使菌种处于“体眠”状态，抑制其繁殖能力。一种好的保藏方法首先应能长期保持菌种原有的优良性状不变，同时还需考虑到方法本身的简便和经济，以便生产上能推广使用。理想的菌种保藏方法注意事项(1)

经长期保藏后菌种存活健在；(2)

保证高产突变株不改变表型和基因型，特别是不改变初级代谢产物和次级代谢产物生产的高产能力。(3)菌种保藏的方法经济。菌种保藏在一定时间内使菌种不死、不变、不乱基本要求：基本方法：生活态休眠态培养基传代培养寄主传代培养冷冻干燥斜面、平板液氮、低温冰箱沙土管、冷冻真空干燥保藏方法

7种常用方法

（1）斜面冰箱保藏法（2）半固体冰箱保藏法（3）石蜡油封藏法（4）甘油悬液保藏法（5）沙土管保藏法（6）冷冻干燥保藏法（7）液氮保藏法常用方法

由于微生物的多样性，不同的微生物往往对不同的保藏方法有不同的适应性，迄今为止尚没有一种方法能被证明对所有的微生物均适宜。对于一些比较重要的微生物菌株，则要尽可能多的采用各种不同的手段进行保藏，以免因某种方法的失败而导致菌种的丧失。将菌种定期在新鲜琼脂培养基上传代，然后在一定的生长温度下生长和保存的传代保藏方法。此法最为简单和经济，且不要求任何特殊的设备。但此方法易发生培养基干枯、菌体自溶、基因突变。

斜面保藏法斜面保藏法因此要求在基本培养基上传代为好，目的是能淘汰突变株；同时转接菌量应保持较低水平。斜面培养物应在密闭容器中于4℃保藏，以防止培养基脱水并能降低代谢活性。保存期2个月到6个月穿刺保藏法斜面保藏法的改进常用于好气性细菌的保藏，真菌、放线菌等1~2cm高的穿刺培养物上覆盖2~3mm的液体石蜡矿物油保藏法将琼脂斜面、穿刺或液体培养物浸入矿物油中于室温下保藏，此方法简便有效。可用于丝状真菌、酵母、细菌和放线菌的保藏。特别对难于冷冻干燥的丝状真菌和难以在固体培养基上形成孢子的担子菌等的保藏更为有效。矿物油保藏法操作要点是首先让待保藏菌种在适宜的培养基上生长，然后注入经170℃下灭菌1-2h的矿物油，斜面矿物油的用量以高出培养物1cm为宜。注意某些菌株在液体石蜡下仍生长十分明显，如某些假丝酵母同化液体石蜡，也有的对液体石蜡保藏敏感。沙土管干燥保藏法适用于丝状真菌、放线菌或芽孢细菌的保藏一般沙过80目，土过100目，按1~2：1混合，高度约1cm。也可用硅胶、磁珠或多孔玻璃珠代替。接种后真空抽干封口。保存期1年左右。

真空冷冻干燥保藏法

冷冻干燥的基本方法：是通过在减压条件下使冻结的细胞悬液中的水分升华，使培养物干燥。此法是微生物菌种长期保藏的最为有效的方法之一。冷冻干燥过程中必须使用冷冻保护剂，目前国内常用脱脂乳和蔗糖，国外尚有运用动物血清等的。

冻干保藏

大部分微生物菌种可以在冻干状态下保藏10年之久而不丧失活力。而且经冻干后的菌株无需进行冷冻保藏，便于运输。冷冻保藏种类

一、普通冷冻保藏技术(-20℃)二、超低温冷冻保藏技术(-60一-80℃)三、液氮冷冻保藏技术普通冷冻保藏技术(-20℃)将液体培养物或从琼脂斜面培养物收获的细胞接到试管或指管内，用橡胶塞严格封好，置于-20℃冰箱中保存。用此方法可以维持若干微生物的活力1—2年。普通冷冻保藏技术(-20℃)将液体培养物或从琼脂斜面培养物收获的细胞接到试管或指管内，用橡胶塞严格封好，置于-20℃冰箱中保存。用此方法可以维持若干微生物的活力1—2年。注意经过一次解冻的菌株培养物不宜再用来保藏。保藏过程中应注意控制保藏温度，培养瓶或试管应严格密封。这一方法虽简便易行，但不适宜多数微生物的长期保藏。普通冷冻保藏技术(-20℃)超低温冷冻保藏技术(-60一-80℃)要求长期保藏的微生物菌种在超低温冷藏柜中保藏菌种的一般方法是：

1．离心收获对数生长中期至后期的微生物细胞；

2．用新鲜培养基重新悬浮所收获的细胞；

3．加入等体积的20％甘油或10％二甲亚砜；

4．混匀后分装入冷冻指管或安瓿中，于-70℃超低温冰箱中保藏。

超低温冷冻保藏技术(-60一-80℃)如果待保藏菌种生长在斜面上，则可用含10％甘油的新配制液体培养基洗涤收获。冷冻速度一般控制在1-2℃／min。若干细菌和真菌通过此保藏方法保藏5年而活力不受影响。液氮冷冻保藏法

冷冻保护剂

在液氮冷冻保藏中，最常用的冷冻保护剂是二甲亚砜和甘油，最终使用浓度一般为甘油10％、二甲亚砜5％。所使用的甘油一般用高压蒸汽灭菌，而二甲亚砜最好为过滤灭菌。液氮冷冻保藏法

冷冻保护剂

保护剂的作用可能是在冷冻干燥的脱水过程中代替结合水而稳定细胞成分(细胞膜)的构型，防止细胞膜因为冻结而破坏。保护剂还可以起支持作用，使膜疏松地固定在上面。原理用液氮能长期保存菌种。这是因为液氮的温度可达-196℃，远远低于其新陈代谢作用停止的温度(-130℃)，所以此时菌种的代谢活动已停止，化学作用亦随之消失。不同菌种保藏方法比较不同菌种保藏方法比较基因工程菌的保藏当培养基中加入抗生素时，抗生素提供了一有利于携带质粒的细胞群体的极有用的生长选择压。而且在运用基因工程菌进行发酵时，抗生素的加入可帮助维持质粒复制与染色体复制的协调。基因工程菌应保藏在含低浓度选择剂的培养基中。微生物活力和稳定性测定

成功的菌种长期保藏方法之有价值的指标包括在保藏6个月、1年或更长时间后存活百分率(或存活单位)、细胞群体的形态学特征或一些特别的生化特征应在菌种保藏前后保持同一性；以及实验室中、中试车间中和生产发酵中产品滴度的稳定性，后者极为重要。液氮冷冻保藏技术

(二)液氮冷冻保藏微生物菌种的步骤

1．待冷冻保藏菌种悬液的制备

(1)从生长斜面制备菌悬液：每一斜面加入5ml含10％甘油的营养液体培养；用巴氏吸管吹吸斜面制成孢子及菌体细胞悬液；0.5～lmL分装玻璃安瓿或液氮冷藏专用塑料瓶。

液氮冷冻保藏技术

(2)从浸没培养物制备菌悬液：在浸没培养液中加入等体积20%无菌甘油；轻轻振荡混匀培养液，如果菌体絮凝较紧，则需先用玻璃珠打散；0.5-lml分装玻璃安瓿或液氮冷藏专用塑料瓶，玻璃安瓿用酒精喷灯封口；将所有封好的安瓿置于5℃冰箱中3min，以使细胞和悬浮培养基之间达到平衡。液氮冷冻保藏技术

2．控速冷冻(1)将安瓿或液氮瓶置于铝盒或布袋中，然后置于一较大的金属容器中；(2)将此金属容器置于控速冷冻机的冷冻室中；(3)以1-2℃/min的致冷速度降温，直到温度达到相对温度之上几度的细胞冻结点(通常为-30℃)；(4)补加一定量的液氮至系统中，使细胞在冻结点时尽可能快地发生相变；(5)细胞冻结后，将致冷速度降为1℃/min，直到温度达-50℃；(6)将安瓿迅速移入液氮罐中于液相(-96℃)或气相(-156℃)中保存。如果无控速冷冻机，则一般可将安瓿或液氮瓶置于一70℃冰箱中冷冻4h，然后迅速移入液氮罐中保存。液氮冷冻保藏技术

液氮冷冻保藏技术

(三)复苏1．从液氮罐中取出所需的安瓿，立即置于冰浴中；2．迅速将安瓿置于37-40℃水浴中，并轻轻摇动以加速解；液氮冷冻保藏技术

(三)复苏3．用巴氏吸管将安瓿中贮存培养物移接入含有2m1无菌液体培养基的试管中，用同一支吸管反复抽吸数次，然后取0.1-0.2ml(约4、8滴)转接入琼脂斜面上。冻干保藏

操作步骤1．启动冷冻干燥器的致冷单元。当冷凝器的温度达到-40℃时启动真空泵，使真空度达到2.67～4.00Pa。2．将冷冻槽置于歧管之下方。槽中装入2／3体积的异丙醇，然后插入温度计及可调温控仪降温探头．打开降温探头控制醇浴温度在-40℃，这一过程约需30min。3．每支斜面加入2mL20％的脱脂乳，然后用巴氏吸管将斜面上的菌苔吹打下制成孢子或菌体均悬液，加入40％的脱脂乳，最终细菌菌株浓度一般要求在106CFU／m1。冻干保藏

4．取下安瓿上的棉塞，然后用lml移液管分装安瓿(0.2ml／瓿)，重新塞好棉塞。5．轻轻振荡安瓿，以使细胞重新悬浮。将安瓿与歧管相联后迅速置于醇浴中，然后调节温控装置。使细胞悬液迅速冻结。6．15min后，将歧管与真空泵相通。7．维持-40℃的醇浴温度90-120min，然后调节温控装置。使醇浴温度上升至-10℃，维持2h。8．关掉可调温控装置的降温探头，让醇浴温度上升至室温(25℃)。冻干保藏

9．在冷冻干燥的最初4h内应定期测真空度，在安瓿置于真空下后1h内，真空度必须达到13.33Pa，并于菌悬液接近干燥时逐渐降到2.67～4.0Pa。10．在真空状态下，让安瓿保存在冷冻干燥机中至少16h以获得完全干燥。11．干燥后，在2.67～4.00Pa的真空度下封瓶．12．在所有安瓿都封盖好后，撤去真空。13．关闭真空泵，冷凝器。冻干菌种的保藏与再生1．保藏：冷冻干燥后的培养物在低于5℃下保藏。较低的保藏温度(-20～-70℃)对于培养物的长期稳定更好。冻干保藏

冻干菌种的保藏与再生2．复苏：(1)在超净工作台中用70％酒精棉球擦洗安瓿，然后用砂轮在安瓿中锉一道沟。(2)用无菌纱布或无菌毛巾包好安瓿，然后用手掰开安瓿．冻干保藏

冻干菌种的保藏与再生2．复苏：(3)在安瓿中加入0.5～1ml营养液体培养基，慢慢旋转安瓿，使冻干菌种复水。然后将此转接到一含有再生培养基的无菌试管中，或直接接种琼脂斜面或涂布平板。冻干保藏

冻干菌种的保藏与再生2．复苏：(4)在指管中冻干的菌种通常为絮粉状，可以将此直接振落入盛有l～2ml液体培养基的试管中，轻轻振荡5～l0min，然后用此悬液接种适宜的再生培养基。冻干保藏

常见菌种的保藏方法（1）