基因工程的基本操作程序课件 【备课精讲精研】 高二下学期生物人教版选择性必修3

第3章基因工程第2节基因工程的基本操作程序PCR扩增仪

1997年，我国政府首次批准商业化种植转基因抗虫棉。到2015年，我国已育成转基因抗虫棉新品种100多个，减少农药用量40万吨，增收节支社会经济效益450亿元。你知道转基因抗虫棉抗虫的机制是什么吗？

从社会中来转基因抗虫棉(使棉铃虫死亡，左)与非转基因抗虫棉(右)培育转基因抗虫棉一般需要哪些步骤？培育转基因抗虫棉的简要过程：提取棉花细胞(含抗虫基因)苏云金芽孢杆菌抗虫基因与运载体DNA拼接导入普通棉花(无抗虫特性)棉花植株(有抗虫特性)目的基因的筛选与获取基因表达载体的构建将目的基因导入受体细胞目的基因的检测与鉴定有了目的基因，我们才能赋予一种生物以另一种生物的遗传特性。使目的基因在受体细胞中稳定存在，并可进行遗传、表达和发挥作用。载体进入受体细胞稳定表达，才能实现一种生物的基因在另一种生物中的转化。才能确定目的基因是否真正在受体细胞中稳定遗传和正确表达。前提核心关键保证01基因工程的基本操作程序①定义：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状的或获得预期表达产物的基因。目的基因受体细胞目的基因主要是指编码蛋白质的基因抗逆性基因生产药物基因毒物降解基因工业用酶基因一.目的基因的筛选与获取1.目的基因非编码区非编码区启动子：RNA聚合酶的识别和结合位点开始转录编码区（1）原核生物基因终止子：终止转录非编码区

组成：编码区上游与编码区下游

功能：不能编码蛋白质，调控遗传信息的表达启动子：RNA聚合酶结合位点转录起始的信号终止子：终止RNA的合成编码区：编码蛋白质的合成2.基因的结构一.目的基因的筛选与获取非编码区非编码区编码区与RNA聚合酶结合位点外显子内含子12345加工mRNA前体成熟mRNA不能编码蛋白质的序列=内含子+非编码区序列12345启动子终止子一.目的基因的筛选与获取（2）真核生物基因转录2.基因的结构编码序列=外显子转基因抗虫棉目的基因——Bt基因苏云金芽孢杆菌产生Bt基因伴胞晶体蛋白(Bt抗虫蛋白)表达破坏鳞翅目昆虫的消化系统杀死棉铃虫棉花细胞导入抗虫棉培育一.目的基因的筛选与获取基因海洋目的基因如何筛选相关的已经结构和功能清晰的基因筛选①筛选方法之一一.目的基因的筛选与获取3.筛选合适目的基因苏云金杆菌制成杀虫剂掌握目的基因的功能掌握目的基因的结构防治棉花害虫发现杀虫作用与Bt基因有关掌握Bt基因的序列深入了解Bt基因的表达产物(Bt抗虫蛋白)Bt基因是培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因。②Bt基因的筛选一.目的基因的筛选与获取3.筛选合适目的基因测序技术序列数据库(如GenBank)序列比对工具(如BLAST)测定核酸和蛋白质序列以碱基顺序或氨基酸残基顺序为基本内容的分子生物信息数据库把感兴趣的序列跟已经存在的序列数据库进行比较的工具。通过比对识别相关的序列，从而能获得目的基因和蛋白质的功能。③筛选目的基因的技术手段一.目的基因的筛选与获取3.筛选合适目的基因目的基因获取方法一.目的基因的筛选与获取4.目的基因的筛选与获取方法人工合成目的基因的核苷酸序列已知利用PCR获取和扩增目的基因从基因文库中获取①PCR的含义PCR是聚合酶链式反应的缩写。根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制。②PCR的原理常用方法目的基因的核苷酸序列未知PCR技术：PCR是______________

_的缩写，是一项根据___________的原理，在___

_提供参与DNA复制的___

____与__

_______，对___________________

_进行______

__的技术；聚合酶链式反应DNA半保留复制体外各种组分反应条件目的基因的核苷酸序列大量复制全称聚合酶链式反应DNA半保留复制体外（PCR扩增仪/PCR仪）对目的基因的核苷酸序列进行大量复制可以在短时间内大量扩增目的基因一.目的基因的筛选与获取4.利用PCR获取和扩增目的基因原理操作环境目的优点：①DNA复制所需的基本条件:参与的组分在DNA复制中的作用

解旋酶DNA母链4种脱氧核苷酸DNA聚合酶引物提供DNA复制的模板合成DNA子链的原料打开DNA双链催化合成DNA子链使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸（体外用耐高温的DNA聚合酶）（体外用高温代替）（2种）引物是一小段能与__________的一段碱基序列__________的____________DNA母链互补配对短单链核酸3’5’DNA母链3’5’DNA母链3’5’引物3’5’引物一.目的基因的筛选与获取4.利用PCR获取和扩增目的基因子链延伸子链延伸耐高温的DNA聚合酶（Taq酶）DNA模板引物（2种）稳定的缓冲溶液（一般添加Mg2+）②PCR条件:一.目的基因的筛选与获取四种脱氧核苷酸激活真核细胞和细菌的DNA聚合酶4.利用PCR获取和扩增目的基因3’5’3’5’3’5’3’5’A.变性

当温度上升到90℃以上时，双链DNA解聚为单链B.复性当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合C.延伸当温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链③PCR反应过程3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’一.目的基因的筛选与获取4.利用PCR获取和扩增目的基因第一轮循环的产物作为第二轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第二轮循环的产物；第二轮循环的产物作为第三轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第三轮的产物；第二轮循环的产物第三轮的产物完成以后，常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物③PCR反应过程一.目的基因的筛选与获取一.目的基因的筛选与获取③PCR反应过程比较项目细胞内DNA复制PCR技术区别解旋方式解旋酶催化边解旋边复制DNA在高温下变性解旋全部解旋后在复制场所主要在细胞核内细胞外(主要在PCR扩增仪内)酶解旋酶、DNA聚合酶等耐高温的DNA聚合酶温度细胞内温和条件控制温度，需在不同温度下进行结果合成整个DNA分子扩增特定的DNA片段或基因联系①模板:均需要脱氧核苷酸双链作为模板②原料:均为四种脱氧核苷酸③酶:均需DNA聚合酶④引物:都需要引物，使DNA聚合酶从引物的3‘端合成子链

将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。①基因组文库：含有一种生物的全部基因。②部分基因文库：只包含了一种生物的部分基因，如：cDNA文库。（1）基因文库类型：一.目的基因的筛选与获取④构建基因文库来获取目的基因（1）基因文库类型：提取某种生物的全部DNA许多一定大小的DNA片段导入受体菌中储存用适当的限制酶切将DNA片段与载体连接基因组文库①基因组文库的构建模式图某种生物特定发育时期的mRNA单链互补DNA双链DNA片段

反（逆）转录酶DNA聚合酶cDNA文库成熟mRNA与载体连接导入受体菌中储存（1）基因文库类型：②部分基因文库的构建模式图基因组DNA文库与cDNA文库的比较

文库类型cDNA文库

基因组文库

文库大小基因中启动子（具有启动作用的DNA片段）基因中内含子(位于编码蛋白质序列的非编码DNA片段）

基因多少

物种间的基因交流小大无有无有某种生物的部分基因某种生物的全部基因可以部分基因可以①

;②

。二.基因表达载体的构建1.目的使目的基因在受体细胞中稳定存在,并且可以遗传给下一代使目的基因能够表达和发挥作用——核心步骤2.组成

当诱导物存在时，可以激活或抑制目的基因的表达。（1）启动子：一段有特殊序列结构的____片段。DNA①本质：②位置：位于基因的____，紧挨____________。上游转录的起始位点RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA，最终表达出人类需要的蛋白质。诱导型启动子：（启动子≠起始密码）终止子启动子目的基因标记基因复制原点基因表达载体（2）终止子：①本质：一段有特殊序列结构的____片段。DNA②位置：位于基因的_____。下游③功能：使转录在所需要的地方停下来。（3）标记基因：①作用：便于重组DNA分子的筛选。（4）目的基因：②常见类型：抗生素抗性基因、荧光蛋白基因等。如Bt基因,能控制表达所需要的特殊性状。（5）复制原点：DNA复制的起始位点。注意：目的基因必须插入到

与

之间。启动子终止子（终止子≠终止密码）二.基因表达载体的构建2.组成辨析：“启动子与终止子”和“起始密码子与终止密码子”启动子与终止子位于DNA分子中，作用：起始和终止转录过程。起始密码子与终止密码子位于mRNA分子中，作用：起始和终止翻译过程。二.基因表达载体的构建【思考1】重组DNA分子限制酶目的基因限制酶切割位点获取目的基因DNA连接酶基因表达载体构建模式图限制酶启动子限制酶切割位点终止子标记基因复制原点质粒同种限制酶或能产生相同末端的限制酶？二.基因表达载体的构建3.过程启动子首端RNA聚合酶转录终止子尾端RNA聚合酶转录标记目的基因基因表达载体的组成：二.基因表达载体的构建【小结】第三步：将目的基因导入受体细胞基因表达载体受体细胞导入转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。动物植物微生物（一）导入植物细胞农杆菌转化法花粉管通道法(常用)

①导入方法1.花粉管通道法：我国科学家独创②受体细胞：体细胞子房花粉柱头花粉管精子卵细胞胚囊三、将目的基因导入受体细胞用微量注射器将含有目的基因的DNA溶液直接注入子房中花粉管通道法子房注射花柱滴加在植物授粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加到花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。花粉管通道法的过程：三、将目的基因导入受体细胞萌发的花粉管花柱子房胚囊卵细胞方法1花粉管通道法优点柱头①利用植物授粉后形成的天然花粉管通道，将外源基因携带进入胚囊，此时的受精卵未形成细胞壁，且正在进行活跃的DNA复制，容易将外源DNA片段整合到受体基因组中。②操作简单、技术成本低，免去了组织培养以及诱导再生植株的全套人工培养过程。三、将目的基因导入受体细胞①农杆菌特点：a.能在自然条件下侵染___________和_________，而对大多数___________没有侵染能力；双子叶植物裸子植物单子叶植物b.农杆菌细胞内含有______，当它侵染植物细胞后，能将______上的______（___________）转移到被侵染的细胞，并且将其_________________________；Ti质粒Ti质粒T-DNA可转移的DNA整合到该细胞的染色体DNA上

将目的基因插入_____________中，通过农杆菌的_____作用，就可以使目的基因___________②利用农杆菌进行转化的思路：Ti质粒的T-DNA转化进入植物细胞三、将目的基因导入受体细胞方法2农杆菌转化法（最常用）Ti质粒T-DNA农杆菌③农杆菌转化法的过程：T-DNA目的基因构建表达载体含目的基因的重组Ti质粒转入农杆菌含重组Ti质粒的农杆菌导入植物细胞表现出新性状的植物植物细胞将目的基因插入染色体DNA中植物组织培养三、将目的基因导入受体细胞两次拼接：第一次拼接是第二次拼接(非人工操作)指两次导入：第一次导入是将第二次导入(非人工操作)是提醒：农杆菌转化法中的两次拼接、两次导入三、将目的基因导入受体细胞将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上；被插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞染色体的DNA上。含目的基因的Ti质粒重新导入农杆菌；指含目的基因的T-DNA导入受体细胞。

④转化的具体方法：a.可以将新鲜的从叶片上取下的圆形小片_______________，然后_____________，并__________；与农杆菌共培养筛选转化细胞再生成植株b.可以将____直接浸没在________________中一段时间，然后培养植株并获得____，再进行_____、_____等；花序含有农杆菌的溶液种子筛选鉴定三、将目的基因导入受体细胞随着转化方法的突破，用农杆菌侵染水稻、玉米等多种单子叶植物也取得成功。——显微注射法1.受体细胞：受精卵(因为受精卵容易表现出全能性)2.过程：构建基因表达载体并提纯利用显微注射将基因表达载体注入动物的受精卵中早期胚胎培养胚胎移植获得具有新性状的动物（二）导入动物细胞三、将目的基因导入受体细胞——Ca2+处理法1.受体细胞：

常用原核生物作为受体细胞，其中以大肠杆菌最广泛。2.原核生物的优点:

繁殖快、单细胞、遗传物质相对较少、易于培养。3.一般过程:Ca2+处理大肠杆菌使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态将重组的基因表达载体导入其中（Ca2+的作用：增加细胞壁的通透性）（感受态细胞）（三）导入微生物细胞Ca2+感受态细胞吸收三、将目的基因导入受体细胞实例：利用转基因大肠杆菌生产药物注意：原核生物作为受体细胞产生的真核生物的蛋白质通常没有生物活性（无内质网和高尔基体加工），需要在体外进行再加工。三、将目的基因导入受体细胞种类项目植物细胞动物细胞微生物细胞常用方法农杆菌转化法；花粉管通道法显微注射法Ca2＋处理法受体细胞体细胞受精卵原核细胞转化过程目的基因插入Ti质粒的T-DNA上→导入植物细胞→整合到受体细胞DNA中→表达目的基因表达载体提纯→取受精卵→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物Ca2＋处理细胞→感受态细胞→表达载体与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子【小结】三.将目的基因导入受体细胞检查目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性；2.检测内容及方法:四.目的基因的检查与鉴定1.目的:（一）分子水平的检测①检测目的基因是否导入如：检测棉花的染色体DNA上是否插入了Bt基因或检测Bt基因——通过PCR等技术检测提取棉花细胞DNA用与Bt基因相关的引物进行PCR扩增对扩增产物进行检测四.目的基因的检查与鉴定②检测目的基因是否转录如：检测Bt基因是否翻译出mRNA提取棉花细胞mRNA逆转录产生DNA对扩增产物进行检测用与Bt基因相关的引物进行PCR扩增——通过PCR等技术检测（一）分子水平的检测③检测目的基因是否翻译如：检测Bt基因是否翻译成Bt抗虫蛋白从棉花中提取蛋白质用相应抗体进行抗原-抗体杂交检测——通过抗原-抗体杂交检测检测目的基因是否表现出相应的性状如：检测抗虫棉是否具有抗虫性状采摘抗虫棉叶片饲喂棉铃虫观察棉铃虫存活情况四.目的基因的检查与鉴定（二）个体水平的检测个体生物学水平的鉴定具体方法举例转基因生物鉴定方法成功标志抗虫植物抗病毒（菌）植物抗盐植物抗除草剂植物获取目的基因产物的转基因生物饲喂害虫（抗虫接种实验）害虫死亡病毒（菌）接种实验未染病盐水浇灌正常生长喷洒除草剂正常生长提取细胞产物与天然产品进行功能活性比较功能、活性正常四.目的基因的检查与鉴定筛选和获取目的基因获取质粒、噬菌体等载体构建基因表达载体将含有目的基因的表达载体导入受体细胞检测和鉴定目的基因是否稳定维持和表达其遗传特性基因工程的基本操作流程图筛选和获取目的基因1.利用PCR获取和扩增目的基因2.人工合成目的基因3.通过构建基因文库获取目的基因第一步：目的基因的筛选与获取构建基因表达载体1.用限制酶切割载体和含有目的基因的DNA片段2.用DNA连接酶连接第二步：基因表达载体的构建将含有目的基因的表达载体导入受体细胞1.导入植物细胞：花粉管通道法；农杆菌转化法2.导入动物细胞：显微注射法3.导入原核细胞：用Ca2+处理受体细胞第三步：将目的基因导入受体细胞检测和鉴定目的基因是否稳定维持和表达其遗传特性1.分子水平检测①检测目的基因是否导入（PCR等技术检测）②检测目的基因是否转录（PCR等技术检测）③检测目的基因是否翻译（抗原-抗体检测）2.个体水平检测第四步：目的基因的检测与鉴定探究•实践：DNA片段的扩增及电泳鉴定1.实验原理（1）利用PCR在体外进行DNA片段扩增的原理①PCR利用了DNA的_________原理，通过_________来控制DNA双链的解聚与结合，PCR仪实质上就是一台能够________________的仪器，一次PCR一般要经历___次循环；热变性调节温度自动调控温度30②PCR扩增DNA片段还利用了_________________的原理；DNA半保留复制基因工程的基本操作程序（2）DNA片段电泳鉴定的原理①DNA分子具有_____________，在一定的___下，这些基团可以带上正电荷或负电荷，在_____的作用下，这些________会向着__________________的电极移动，这个过程就是_____；可解离的基团pH电场带电分子电泳与它所带电荷相反②PCR的产物一般通过_______________来鉴定；③在凝胶中DNA分子的迁移速率与___________、________________和_____等有关（迁移速率与之呈负相关）④凝胶中的DNA分子通过_____，可以在波长为________的______下被检测出来。琼脂糖凝胶电泳凝胶的浓度染色300nm紫外灯DNA分子的大小构象基因工程的基本操作程序2.材料用具①PCR仪（自动控温，实现DNA的扩增）②微量离心管（实际上是进行PCR反应的场所）③微量移液器（用于向微量离心管转移PCR配方中的液体）④一次性吸液枪头（微量移液器吸取一种试剂更换一次枪头）⑤电泳装置（包括电泳仪、电泳槽等）基因工程的基本操作程序10倍浓缩的扩增缓冲液（含Mg2+）5μL20mmol/L的4种脱氧核苷酸的等量混合液（实为dNTP）1μL20μmol/L的引物Ⅰ2.5μL20μmol/L的引物Ⅱ2.5μLH2O28～33μL1-5U/μL的TaqDNA聚合酶（即耐高温的DNA聚合酶）1～2U模板DNA（用量为1pg-1μg）5～10μL总体积50μL⑧PCR反应体系的配方⑥4种脱氧核苷酸等量混合液、2种引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA、扩增缓冲液、无菌水。⑦电泳缓冲液、凝胶载样缓冲液、琼脂糖和核酸染料等基因工程的基本操作程序3.方法步骤基因工程的基本操作程序PCR反应体系的配方10倍浓缩的扩增缓冲液5μL20mmol/L的4种脱氧核苷酸的等量混合液1μL20μmol/L的引物Ⅰ2.5μL20μmol/L的引物Ⅱ2.5μLH2O28～33μL1～5U/μL的TaqDNA聚合酶1～2U模板DNA5～10μL总体积50μL注：模板DNA的用量为1gp～1μg①移液：用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分（1）DNA片段的扩增3.方法步骤基因工程的基本操作程序循环程序变性复性延伸预变性94℃，5min30次94℃，30s55℃，30s72℃，1min最后1次94℃，1min55℃，30s72℃，1min②离心：待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子，将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部（提高反应速率）

使DNA充分变性，以利于引物更好地和模板结合。③反应：参照上表的参数，设