基因表达与蛋白质纯

基因表达与蛋白质纯化技术探讨读书报告2010年9月30日主要内容基因表达体系及优劣势大肠杆菌中表达蛋白质及纯化方法可能碰到的问题什么是基因表达呢？基因表达(geneexpression)是指储存遗传信息的基因经过一系列步骤表现出其生物功能的整个过程。典型的基因表达是基因经过转录、翻译，产生有生物活性的蛋白质的过程。基因表达体系

1.

原核体系2.

真核体系

大肠杆菌(Escherichiacoli)

E.coli

是重要的原核表达体系。在重组基因转化入E.coli菌株以后，通过温度、诱导剂用量以及诱导时间的控制，诱导其在宿主菌内表达目的蛋白质，将表达样品进行SDS以检测表达蛋白质大肠杆菌(Escherichiacoli)遗传背景清楚，基因工程操作方便，商品化表达载体种类齐全，表达效率高；基本不分泌蛋白，易形成包含体(无正确折叠的立体结构)，无加糖等修饰枯草杆菌(Bacillussubtilis)分泌蛋白质能力强，一般有天然立体结构；无加糖修饰功能，培养液中蛋白酶活性高，重组蛋白易受蛋白酶的水解；质粒不稳定，尚无商品化的表达载体其他乳酸菌(Lacticacidbacteria)沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)苏云金杆菌

(Bacillusthuringiensis)真核表达真核细胞表达体系酵母细胞昆虫细胞哺乳动物细胞/组织植物细胞/组织酵母细胞可生产分泌型蛋白；有天然立体结构，有加糖修饰功能；可进行染色体整合型基因表达;糖链与哺乳动物加工的不一致，培养上清多糖浓度高;商品化表达体系：

酿酒酵母（Saccharomycecerevisiae）;

毕氏酵母(Pichiapastoris);

裂殖酵母（Schizosaccharomycepombe）昆虫细胞可以病毒感染的型式在成虫中生产，也可在体外培养细胞中生产蛋白;适合分泌型和膜蛋白的表达，有加糖修饰；糖链有所区别，表达量有限；作为药物宿主细胞未被FDA认可CHO细胞可进行分泌表达，有天然立体结构，加糖方式与人体蛋白质完全一致；表达量不够高，培养成本较高植物组织植物可大面积种植，可以廉价大规模生产；转基因植物制作费时，表达的组织特异性较难控制；表达量较难提高，分离纯化不方便动物乳腺组织分泌生产有天然立体结构和活性的蛋白质至乳汁，产量高，分离纯化方便，特别适合药用蛋白的生产；转基因动物制作花费巨大，实验周期长原核表达与真核表达的区别1、载体的区别

整合机制

2、表达产物的区别

蛋白修饰的程度

区别表达类型

载体载体举例产物原核表达一般简单，质粒不整合到大肠杆菌的DNA而是自己复制表达pET系列产物一级结构正确，但折叠不一定正确，没有糖基化和磷酸化等修饰真核表达一般由宿主细胞匹配的整合机制的载体整合载体在基因组上表达酵母

Y系列产物一般修饰的比较好，糖基化等完全，更接近天然蛋白体系选择研究基因功能:

大肠杆菌,裂殖酵母,昆虫细胞,CHO细胞多肽药物生产:

大肠杆菌,毕氏酵母,CHO细胞,乳腺组织疫苗:

大肠杆菌,酵母,

大多数沿用细胞培养产物进行灭毒单抗生产:

杂交瘤细胞工业酶生产:

各种微生物

在大肠杆菌中表达

外源基因

获得目的基因→准备表达载体→将目的基因插入表达载体中（测序验证）

→转化表达宿主菌→诱导靶蛋白的表达→表达蛋白的分析→扩增、纯化、进一步检测原核表达一般程序

（一）获得目的基因

1、通过PCR方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR循环获得所需基因片段。

2、通过RT-PCR方法：用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA，以mRNA为模板，逆转录形成cDNA第一链，以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。原核表达操作步骤

（二）构建重组表达载体

1、载体酶切：将表达质粒用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。

2、PCR产物双酶切后回收，在T4DNA连接酶作用下连接入载体。

1、将连接产物转化大肠杆菌DH5α，根据重组载体的标志（抗Amp或蓝白斑）作筛选，挑取单斑，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。

2、测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确，进入下步操作。否则应筛选更多克隆，重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点。

3、以此重组质粒DNA转化表达宿主菌的感受态细胞。（三）获得含重组表达质粒的表达菌种

1、挑取含重组质粒的菌体单斑至2mlLB（含Amp50μg/ml）中37℃过夜培养。

2、按1∶50比例稀释过夜菌，一般将1ml菌加入到含50mlLB培养基的300ml培养瓶中，37℃震荡培养至（最好0.6，大约需3hr）。

3、取部分液体作为未诱导的对照组，余下的加入IPTG诱导剂至终浓度0.4mM作为实验组，两组继续37℃震荡培养3hr。

4、分别取菌体1ml，离心12000g×30s收获沉淀，用100μl1%SDS重悬，混匀，70℃10min。

5、离心12000g×1min，取上清作为样品，可做SDS等分析。（四）诱导表达

重组蛋白可在E.coli、酵母、昆虫和哺乳动物细胞等体系中得到高效表达，其表达形式一般可分为：（1）细胞外的分泌表达；（2）细胞内可溶性表达；（3）细胞内不溶性表达，即产物以包涵体的形式存在。

重组蛋白的表达形式

SDS

（秦伟等，水稻密码子优化的cry2A*基因在大肠杆菌中的表达及其表达产物的纯化，生物工程，2008）

SDS

（秦伟等，水稻密码子优化的cry2A*基因在大肠杆菌中的表达及其表达产物的纯化，生物工程，2008）

SDS

（秦伟等，水稻密码子优化的cry2A*基因在大肠杆菌中的表达及其表达产物的纯化，生物工程，2008）

SDS

（秦伟等，水稻密码子优化的cry2A*基因在大肠杆菌中的表达及其表达产物的纯化，生物工程，2008）

SDS

（秦伟等，水稻密码子优化的cry2A*基因在大肠杆菌中的表达及其表达产物的纯化，生物工程，2008）按蛋白质类型分单纯表达:pJLA系列,用NcoI/NdeI导入AUG的载体融合表达:融合各种tag,GST,CBD,MAL,GFP,etc

分泌表达:pel/ompT分泌肽按启动子分lac及衍生的tac,trc,pac,rac等启动子IPTG诱导lamdaphagePL和PR

启动子热诱导T7启动子IPTG诱导T5启动子IPTG诱导ara启动子阿拉伯糖诱导大肠杆菌表达载体分类pJLA50X系列;pcDNAII;etcpET系列

(T7promoter,Novagen公司)pQE系列

(T5promoter,Qiagen公司)pMAL系列(周质表达,BioLabs公司)pGEX系列(GST融合表达,Pharmacia公司)pBAD系列

(Arabinose诱导型)常用表达载体pTYB系列(CBD融合,可以自我切割,BioLabs)ProteinAGST（glutathioneS-transferase）CBD(chitin-bindingdomain,BioLabs;cellulose-bindingdomain,Novagen)calmodulin-bindingdomain,Stratagene)MBP(maltose-bindingprotein)GFP(greenfluorescenceprotein)Thioredoxin**帮助二硫键形成Dsb(periplasmaenzymeDsbA,DsbC)**二硫键的形成与SUMO(smallubiquitin-relatedmodifier)KSI(ketosteroidisomerase)基本上全部沉淀各种融合蛋白表达载体帮助可溶化帮助分泌到周质可用亲和层析纯化His-tag(6-8Histidine)T7-tag(MASMTGGQQMG)HSV-tag(QPELAPEDPED)S-tag(KETAAKFERQHMDS)VSV-G-tag(TTDIEMNRLGK)HA-tag(YPYDVPDYA)Flag-tag

(DYKDDDDK)Myc-tag(EQKLISEEDL)各种用于抗体识别的标记DTT:intein的↓Cys

溴化氰:Met↓Thrombin:LVPR↓GSFactorXa:IEGR↓Enterokinase:DDDDK↓PreScissionTMprotease:

LEVLFQ↓GPGenenaseI

TMPGAAHY↓TEVprotease:

ENLYFQ↓G融合蛋白的专一性切割BL21(DE3)/pLysS:自身表达T7RNApolymerase

适用pET系列等带T7启动子的载体M15/SG13009:自身表达T5RNApolymerase

适用pQE系列等带T5启动子的载体BL21TrxB(DE3):thioredoxinreductase突变

Origami:thioredoxinreductase/glutathionereductase双突变适合带thioredoxinreductase的融合表达载体,帮助形成更多的二硫键BR21CodonPlusRIL:富含AT的真核生物基因的表达BR21CodonPlusRP:富含GC的真核生物基因的表达特殊的表达用菌株NovagenStratageneInvitrogenBioLabsQiagenPharmaciaPromegaClontechRocheGibco/BRL重要的原核表达质粒提供商如果所表达的蛋白质有二硫键并需要正确的立体结构,尽可能进行可溶性表达;如果所表达的蛋白质没有二硫键或只用来制备抗血清,采用包含体表达比较好;如果希望表达的多肽的分子量小于10kDa,一定要进行融合表达采用MBD融合采用GST融合采用CBD融合采用thioredoxin融合采用Origami等宿主菌降低菌体培养的速度

温度(15-30℃),

降低转速

让表达产物可溶化采用CBD融合(pET36/37)采用Dsb融合(pET39/40)采用带pelB/ompT引导肽的载体

(pET12/20/22)采用带MBD融合(pMAL载体,Biolabs)采用带SUMO融合

(pETSUMO,Invitrogen)让蛋白质分泌到间质去纯化方便:先用EDTA/蔗糖溶液处理,然后5mMMgSO4洗出透析法:简单;但费时,费缓冲液,蛋白质浓度不能过高(容易产生沉淀)快速稀释法:

最常用的小规模复性方法;但比较费时,费缓冲液,蛋白质的浓度不能高(容易产生沉淀)超滤透析法:比较省缓冲液,处理量大;但费时,要控制好蛋白质浓度凝胶过滤法:

快速,可重复性高,不会产生沉淀,操作复杂一点

亲和层析复性法,水相二相法,etc包含体来源蛋白质的复性原核表达优化策略—如何避免包涵体表达延长表达时间（过夜），低温培养（25－30）诱导条件的优化某些氨基酸的取代共表达分子伴侣，硫氧还原蛋白的融合表达或与目标蛋白的共表达蛋白毒性，稳定性分析，更换宿主菌(利用硫氧还蛋白还原酶缺陷菌株作为宿主菌)。■培养基中可加葡萄糖，通常用2%的浓度。■在培养过程中，要保持细菌摇瓶有良好的通气条件，充足的氧流量可以减少包涵体的形成重组蛋白的纯化方法

1.

层析技术

2.电泳技术

Ni-NTA亲和层析

His标签蛋白的纯化流程

表达量不够高；包含体在8M尿素中不能溶解；重组蛋白在大肠杆菌中表达的分子量偏小；带His-tag重组蛋白不吸附到Ni-chelating树脂上；Ni-chelating分离纯化的效果不好；GST融合蛋白不吸附到glutathione-Sepharose上；包含体来源的采用透析法或稀释法复性时全部沉淀；Ni-chelating错用DTT后发生黑色沉淀该怎么办？贵重的亲和层析树脂经常发生结块该怎么办？某些表达载体的表达效率在放大培养时无法提高经常碰到的问题

尝试不同表达载体，特别是N端有融合蛋白的载体是不是忘了加还原剂（DTT或巯基乙醇）？是不是在－20℃冻存过