第3章蛋白质通性纯化和表征

第3章蛋白质的通性、纯化和表征生物化学.第一篇生物分子的结构和化学生物化学.第一篇生物分子的结构和化学本章主要内容一.蛋白质的酸碱性质二.蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀三.蛋白质分离纯化的一般原则四.蛋白质的分离纯化方法五.蛋白质相对分子量质量的测定六.蛋白质的含量测定与纯度鉴定一、蛋白质的酸碱性质生物化学.第一篇生物分子的结构和化学第三章蛋白质的通性，纯化和表征1.1蛋白质的两性解离与等电点蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，氨基酸残基侧链中某些基团，在一定的溶液pH条件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团从而使蛋白质带电。蛋白质与氨基酸一样具有两性解离的性质，因而也具有特定的等电点。

蛋白质两性解离pH=pI

净电荷=0

pH<pI净电荷为正pH>pI净电荷为负PrCOOHNH3++H++

OH-+H++

OH-PrCOO-NH2PrCOO-NH3+蛋白质等电点：对某一种蛋白质来说，在某一pH，它所带的正电荷和负电荷恰好相等，也即净电荷为零，这一pH称为蛋白质的等电点。蛋白质的等离子点：没有其他盐类干扰时，蛋白质质子供体基团解离出来的质子数与质子受体基团结合的质子数相等时的pH称为等离子点。等离子点是每种蛋白质的一个特征常数。蛋白质的等电点和等离子点生物化学.第一篇生物分子的结构和化学第三章蛋白质的通性，纯化和表征当溶液pH=pI时，蛋白质粒子净电荷为零，在电场中不移动；当溶液pH＞pI时，蛋白质粒子带负电荷，在电场中向正极移动；当溶液pH＜pI时，蛋白质粒子带正电荷，在电场中向负极移动。1.2在不同的pH环境下，蛋白质的电学性质不同生物化学.第一篇生物分子的结构和化学第三章蛋白质的通性，纯化和表征2.1.分散体系

一种物质以极小的颗粒（分散相）分散在另一种物质（分散介质）中所组成的体系。分散相质点半径<1nm:真溶液分散相质点半径介于1-100nm:胶体溶液分散相质点半径>100nm:悬浊液分散系二、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀2.2胶体溶液保持稳定的条件：①分散相质点大小分子直径在1-100nm范围内，这种大小的质点在动力学上是稳定的。②分散相质点带同种净电荷，相互排斥，不易聚集成大颗粒而产生沉淀。③分散相质点能与溶剂形成溶剂化层，例如与水形成水化层，相互间不易靠拢而聚集。+++++++带正电荷的蛋白质－－－－－－－－带负电荷的蛋白质在等电点的蛋白质水化膜++++++++带正电荷的蛋白质－－－－－－－－带负电荷的蛋白质不稳定的蛋白质颗粒酸碱酸碱酸碱脱水作用脱水作用脱水作用溶液中蛋白质的聚沉蛋白质分子相互聚集而从溶液中析出的现象称为沉淀。Ⅰ可逆沉淀（非变性沉淀）：温和条件，改变溶液pH或蛋白质所带电荷蛋白质结构和性质没有变化适当条件下可重新溶解例如：等电点沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法等2.4.蛋白质的沉淀

II.不可逆沉淀（变性沉淀）强烈沉淀条件破坏蛋白质胶体溶液稳定性也破坏蛋白质结构和性质沉淀不能再重新溶解如加热沉淀、强酸/碱沉淀、重金属盐和生物碱沉淀等2.5.1盐析定义：向蛋白质溶液中加入大量的中性盐[(NH4)2SO4、Na2SO4、NaCl等]，以破坏蛋白质的胶体性质，使蛋白质从溶液中沉淀析出，称为盐析。作用机制:中和电荷的同时破坏水化膜。优点:盐析沉淀蛋白质通常不会引起蛋白质的变性。2.5.蛋白质沉淀方法如:甲醇、乙醇、丙酮等有机溶剂沉淀可引起蛋白质变性

2.5.2有机溶剂沉淀法2.5.3重金属盐沉淀法当溶液的PH＞PI时，蛋白质颗粒带负电荷，它容易与重金属盐（氯化高汞、硝酸银、醋酸铅等）中的重金属离子（Hg2+、Cu2+、Ag2+）结合成不溶性盐而沉淀。2.5.4生物碱试剂和某些酸类沉淀法pH小于等电时，蛋白质带正电荷，易与生物碱试剂和酸类的负离子生成不溶性沉淀。生物碱试剂：单宁酸、苦味酸、钨酸酸类：三氯乙酸、磺基水杨酸和硝酸。原理调节两性生化物质溶液的pH值，以达到某一生化物质的等电点，使其从溶液中沉淀析出而实现分离的技术称为等电点沉析技术。2.5.5等电点沉淀法反应名称试剂颜色反应有关基团有此反应的Pr或aa双缩脲反应NaOH、CuSO2紫红色二个以上肽键所有蛋白质米伦反应HgNO3、Hg(NO3)及HNO3、HNO2混合物红色

Tyr黄色反应浓HNO3黄色、橘色

Tyr、Phe乙醛酸反应乙醛酸试剂沿管壁慢加浓H2SO4两液层间出现紫色环

Trp坂口反应Sakaguch反应)α-萘酚、N