卵泡发育中miRNAs的作用探讨,医学遗传学论文

卵泡发育中miRNAs的作用探讨,医学遗传学论文摘要：人们已在卵泡发育的不同阶段和不同细胞中均检测到小RNA(miRNAs)的存在，并在成熟卵泡的卵泡液中也发现外泌体miRNAs。miRNAs不仅介入调控正常的卵泡发育经过，其异常调控可以导致一些卵巢疾病的发生。为进一步系统说明miRNAs对卵泡发育的调控机制，寻找能够预测卵母细胞发育质量的外泌体miRNAs,本文从颗粒细胞发育、卵母细胞发育和激素合成等方面总结了miRNAs对卵泡发育的调控作用。本文关键词语:小RNA;卵泡发育;颗粒细胞;卵母细胞;激素合成;Abstract：Inrecentyears,microRNAs(miRNAs)havebeendetectedatdifferentstagesoffolliculardevelopmentandindifferentcellsoffollicles.Extracellularvesicle(EV)-derivedmiRNAshavealsobeendetectedinthefollicularfluidofmaturefollicles.miRNAsparticipateintheregulationofnormalfolliculardevelopment,andtheregulationdisordermayleadtotheoccurrenceofsomeovariandiseases.InordertofurthersystematicallyelucidatetheregulatorymechanismofmiRNAsonfolliculardevelopmentandfindsuitableEV-derivedmiRNAsthatcanpredictoocytedevelopment,wereviewedthefunctionsofmiRNAsinfolliculardevelopmentfromtheperspectivesofgranulosacelldevelopment,oocytedevelopment,andhormonesynthesis.Keyword：microRNAs;folliculardevelopment;granulosacell;oocyte;hormonesynthesis;Fund：SupportedbytheScientificandTechnologicalResearchProjectofJilinProvince(20200201832JC);theHealthResearchProjectfortheTrainingofYoungTalentsofJilinProvince(2021Q047);theScientificandTechnologicalInnovationProjectofJilinCity(202131721);theScientificandTechnologicalResearchProjectsoftheEducationDepartmentofJilinProvinceDuringthe“ThirteenthFive-YearPlan〞Period(JJKH20221065KJ,JJKH20200454KJ);theScientificandTechnologicalDevelopmentProjectofTraditionalChineseMedicineofShandongProvince(2022-0463);UndergraduateTrainingProgramforInnovationandEntrepreneurshipofJilinProvince(dc202252,dc202254);高通量测序技术的飞速发展为研究非编码RNA提供了极大便利，鉴于非编码RNA在生殖系统发育调控中的重要作用，关于其调控机制的说明也成为当前的研究热门，引起了人们极大的关注[1,2]。非编码RNA包括小RNA(microRNAs,miRNAs)、长链非编码RNA(longnon-codingRNAs,IncRNAs)和环状RNA(circularRANs,circRNAs)3大类，华而不实以miRNAs的研究最为广泛[3]。miRNA于1993年被发现，是一种内源性22～24nt大小的单链非编码RNA[4]。成熟的miRNAs与Argonaute1(AGO1)等其他蛋白质一起组成RNA诱导的沉默复合物(RNA-inducedsilencingcomplex,RISC),miRNA通过其5’端的种子序列与靶mRNA3’非编码区(3’UTR)完全或不完全的互补结合，可以通过辨别靶mRNA的开放阅读框，将与之结合的AGO蛋白定位到靶mRNA上，导致靶mRNA降解、基因沉默或翻译抑制，进而调控靶基因表示出，影响细胞增殖、分化和凋亡[5,6]。卵泡发育是一个高度精到准确、有序和周期性经过，从原始卵泡激活开场，逐步激发周围健康小卵泡的生长及优势卵泡的选择，并伴随着一系列卵母细胞和周围体细胞(尤其是颗粒细胞)的分化。通过生物信息学分析，Zhang等[7]在优势卵泡的生长和选择经过中，挑选出15个介入调控的miRNAs和139个相关的信号通路。这些miRNAs和相关的信号通路调控卵泡发育经过中的细胞增殖、分化、激素合成和卵母细胞的成熟及排卵等一系列重要事件，影响着卵泡发育的结局[8,9]。本文总结了miRNAs在卵巢颗粒细胞增殖与凋亡、卵母细胞发育和激素合成等方面的调控作用，以期为说明其在生殖发育机制和生殖疾病机理的调控作用奠定基础。miRNAs在颗粒细胞发育中的调控作用卵泡发育经过伴随着颗粒细胞的快速增殖和分化，颗粒细胞在卵泡发育经过中起着重要的营养支持作用，可通过旁分泌以及与卵母细胞间的缝隙连接，为卵母细胞输送营养物质，调节卵母细胞的生长和成熟，并通过分泌大量性激素维持卵泡的正常功能。因而，颗粒细胞的正常发育是卵泡发育的基础。研究发现，颗粒细胞的增殖和凋亡受多种因素，如生长因子、激素、凋亡蛋白和氧化复原酶类等的调控[10,11],而miRNAs则通太多种途径调控这些蛋白和激素等物质的合成，进而调控颗粒细胞的发育[12]。生长因子途径在颗粒细胞的生长发育经过中存在着一类重要的生长因子-转化生长因子β(transforminggrowthfactor-β,TGF-β)[13],研究发现这类生长因子通路受miR-10a和miR-10b调控[14]。miR-10家族可调控TGF-β通路中的很多关键基因，如促卵泡激素(follicle-stimulatinghormone,FSH)、纤维母细胞生长因子9(fibroblastgrowthfactor9,FGF9)、激活素A、骨形态发生蛋白(bonemorphogeneticproteins,BMP)4和BMP15的表示出，进而影响颗粒细胞的增殖和分化[14]。miR-125b则通过靶向作用于骨形态发生蛋白受体1B(bonemorphogeneticproteinreceptor1B,BMPR1B)mRNA,影响BMPR1B蛋白的表示出，改变Bcl-2/Bax比值[15],诱导颗粒细胞凋亡。Chi-miR-4110和miR-424/503靶向作用于TGF-β信号通路中的Smad2和Smad7基因mRNA,促进颗粒细胞凋亡[16,17]。同时有研究发现，激活素A的表示出可负反应下调miR-424/503和miR-10家族的表示出，协同调控颗粒细胞的增殖[17]。且Smad4可以结合于miR-143的启动子区，负反应下调miR-143的表示出，逆转miR-143介导的颗粒细胞凋亡和卵泡闭锁[18]。激素受体途径卵泡刺激素受体(follicularstimulatinghormonereceptor,FSHR)在调控哺乳动物卵泡发育经过中发挥重要作用。在卵巢卵泡闭锁经过中，FSHR表示出下调，敲除FSHR可导致颗粒细胞凋亡和卵泡闭锁[19],但其详细作用机制尚不明确。通过研究miRNAs在颗粒细胞发育中的作用，发现FSHR是miR-143的重要作用靶点，在卵泡闭锁期间miR-143的表示出上调，其通过靶向作用于FSHR,降低了细胞内信号分子，如蛋白激酶A(proteinkinaseA,PKA)、苏氨酸蛋白激酶(serine/threoninekinase,AKT)和磷酸化AKT(phosphorylatedAKT,P-AKT)的表示出水平，影响细胞的代谢活动，加速颗粒细胞凋亡，促进卵泡凋亡[18,20]。miRNAs可通过促性腺激素受体途径介入调控颗粒细胞和卵泡的发育。凋亡因子途径在卵泡发育的不同阶段，会有99%以上的卵泡闭锁退化。卵泡闭锁主要是由颗粒细胞凋亡引起的，很多促凋亡因子介入调控了这一经过[21,22],叉头框转录因子O1(forkheadboxtranscriptionfactorO1,FoxO1)是华而不实一类重要的促凋亡调控因子[23,24]。研究发现miR-181a可靶向抑制FoxO1的去乙酰化酶沉默信息调节因子1(silentinforma-tionregulator1,SIRT1)的表示出，促进FoxO1乙酰化，加强FoxO1表示出，进而促进颗粒细胞的凋亡。Zhang等[25]研究发现，利用过氧化氢处理颗粒细胞可增加颗粒细胞中miR-181a的表示出，并通过FoxO1通路促进颗粒细胞的凋亡，但假如敲除miR-181a,则阻止了过氧化氢诱导的颗粒细胞凋亡。可见，miRNAs在颗粒细胞凋亡和卵巢老化经过中起重要的调控作用。miRNAs在卵母细胞发育中的调控作用在卵泡发育经过中，卵母细胞逐步具备了完成减数分裂成熟和支持后续早期胚胎发育的能力。卵母细胞的发育成熟，受颗粒细胞增殖和凋亡的调控。在卵母细胞发育的前期，颗粒细胞快速增殖，为卵母细胞的生长提供丰富的营养物质；但在初级卵母细胞完成第1次减数分裂前，卵母细胞的发育已经完成，颗粒细胞在激素和促凋亡因子等作用下，发生凋亡退化，逐步失去了与卵母细胞之间的联络，此时假如颗粒细胞凋亡退化异常，将会影响卵母细胞完成第1次减数分裂。近年研究表示清楚，miRNAs表示出于卵泡发育的不同阶段，包括原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡和成熟卵泡，介入调控整个卵泡的发育和卵母细胞的成熟经过[26]。人们已在卵母细胞发育的不同阶段发现了miRNAs表示出形式的差异。Xiong等[27]对GV期和MⅡ期卵母细胞进行了高通量测序，结果显示：MⅡ期卵母细胞中有47个miRNAs表示出上调，28个miRNAs表示出下调，在表示出上调的let-7i、miR-10b、miR-10c、miR-342、miR-143、miR-146b和miR-148等miRNAs中，miR-342的表示出水平升高了9.25倍。为进一步说明这些在GV期和MⅡ期卵母细胞中差异表示出的miRNAs的调控作用，Song等[28]研究了7个差异表示出的miRNAs调控的信号通路和靶基因，结果发现：miR-21、miR-27b-3p、miR-10a-5p、miR-10b-5p介入了猪卵母细胞脂肪酸代谢的调控，miR-27b-3p调控着GV期和MⅡ期卵母细胞中过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisomeproliferator-activatedreceptor-γ,PPARγ)的表示出，在卵母细胞的体外成熟液中添加PPARγ冲动剂，可显着提高卵母细胞的成熟率和早期胚胎的发育能力。在卵母细胞体外成熟经过中，显微注射miR-130b前体或抑制剂能降低靶基因SMAD5和MSK1的表示出，显着降低第一极体的排出和卵母细胞进入第二次减数分裂中期的比例[29];相反miR-130b的过表示出则可明显增加颗粒细胞的数量，促进颗粒细胞增殖，进而抑制卵母细胞成熟[29]。miR-378则在卵泡发育的早期通过降低BMP15和GDF9的表示出，减弱卵母细胞和颗粒细胞的互相作用，进而降低卵母细胞成熟率[30]。因而，在卵母细胞发育的不同阶段，会遭到不同类型miRNAs的精到准确调控，miRNAs的调控异常将直接影响卵母细胞成熟和卵巢功能。最近人们在动物和人类卵泡液中检测到一类重要物质-外泌体miRNAs(extracellularvesiclecontainingmiRNA,EV-miRNAs)[31],该物质会通过细胞和细胞之间的传递，完成细胞间的沟通[32]。daSilveira等[33]将含有miRNAs的外泌体添加到卵母细胞的成熟培养液和早期胚胎的培养液中，显着提高了胚胎细胞中bta-miR-631的表示出水平，改变了胚胎中DNA的甲基化和羟甲基化水平，产生了不同的囊胚发育率。EV-miRNAs介入调控了卵母细胞的成熟和支持后续胚胎发育能力的获得。在卵母细胞成熟经过中，卵泡液中miRNAs的表示出随着雌性年龄和卵泡发育阶段的变化而变化。daSilveira等[34]在青年马(3～10岁)不同发育阶段的卵泡液中发现了26个miRNAs的差异表示出，而在老年马(20～26岁)不同发育阶段的卵泡液中发现了55个miRNAs的差异表示出，这些差异表示出的miRNAs包括miR-23a、miR-222、miR-24、miR-132、miR-320、miR-520c-3p、miR-222和miR-181a等，它们介入调控着卵泡雌激素合成、FSH循环水平、TGF-β信号通路、WNT信号通路和排卵等经过，这些经过与卵母细胞的发育、卵巢的老化和衰老密切相关。Diez-Fraile等[35]比拟了年轻女性(31岁)和中老年女性(38岁)卵泡液中EV-miRNAs的表示出，结果发现：miR-21-5p仅在年轻女性的卵泡液中分离到，可靶向作用于TGF-β信号通路；而miR-134、miR-190b和miR-99b-3p仅在中老年女性卵泡液中发现，可能与低质量的卵母细胞密切相关。固然EV-miRNAs的表示出类型和水平在马和人都存在物种的差异，但它们都介入了调控卵泡发育的重要活动和重要信号通路，在卵泡发育和卵母细胞成熟中发挥了重要作用。除此之外研究发现，EV-miRNAs与MⅡ期卵母细胞的质量密切相关，其表示出变化影响着体外受精的结果[36]。Martinez等[37]收集了126名进行体外受精女性的卵泡液，分析了卵泡液中EV-miRNAs的表示出水平，结果发现：与正常受精组的卵母细胞相比，未受精卵母细胞的卵泡液样本中Hsa-miR-92a和Hsa-miR-130b的表示出显着升高；卵泡液中Hsa-miR-888的过度表示出，以及Hsa-miR-214和Hsa-miR-454的表示出下降与D3的胚胎质量密切相关。对含有成熟卵母细胞的单个卵泡的卵泡液进行样本分析发现，miR-663B在人卵泡液中的表示出水平与活囊胚的构成率呈显着负相关[38]。通过胞浆内单精子显微注射研究发现，来自高水平Hsa-miR-320a和Hsa-miR-197卵泡液的卵母细胞可获得高质量发育的胚胎[39]。卵泡液中miRNAs的类型和表示出水平在一定程度上与卵母细胞的成熟质量有关，而卵母细胞的发育质量直接决定后期胚胎的发育状况。假如miRNAs能成为体外受精后胚胎发育潜能的客观评价指标，将大大提高辅助生殖技术的成功率，减少多胎的发生率。miRNAs对卵泡合成和分泌性激素的调控作用在卵泡发育成熟经过中分泌多种激素，包括雌激素、孕激素和少量雄激素，这些激素调控颗粒细胞的增殖与分化、卵母细胞的发育成熟及排卵[40,41]。研究发现，这些激素的合成受miRNAs调控，miR-320a可靶向作用于转录因子RUNX2的3’UTR,通过调节CYP11A1和CYP19A1的表示出，加强颗粒细胞中类固醇激素的合成[42]。雌激素的合成受FSH和促黄体生成激素(luteinizinghormone,LH)的调控，在颗粒细胞和卵泡膜细胞上分别有FSH受体(FSHreceptor,FSHR)和LH受体(LHreceptor,LHR)的表示出。LHRmRNA的稳态水平是通过LHRmRNA结合蛋白(LHRmRNAbindingprotein,LRBP)控制其降解速度来维持的。Menon等[43]研究显示，miR-122调控LRBP的表示出，间接决定了细胞中LHRmRNA的水平。在排卵前，为应对LH峰的出现，LHRmRNA表示出会随着miR-122和LRBP水平的降低而降低。miRNAs根据卵泡发育的需要，精到准确地调控卵巢激素的合成和分泌。卵泡对雌激素的合成也受促肾上腺皮质激素释放激素(corticotropin-releasinghormone,CRH)信号通路的调控，Yu等[44]发现该调控通路需要miR-375的参与，CRH通过激活胞内PKA-p38MAPK信号通路，促进miR-375表示出，miR-375结合到特异性蛋白1(specificityprotein1,SP1)mRNA的3’UTR区，抑制SP1蛋白的表示出，下调了Cyp19a1转录，进而抑制了颗粒细胞中E2的合成。Wang等[45]发现，miR-764-3p可通过影响类固醇生成因子-1(steroidogenicfactor-1,SF-1)mRNA的稳定性，抑制SF-1的表示出，进而抑制了SF-1下游的靶基因Cyp19a1的表示出，影响E2的合成。Dai等[46]研究显示，miR-133b是通过结合到Foxl2mRNA的3’UTR区，降低了Foxl2的表示出水平，抑制了Foxl2结合到类固醇激素合成急性调节蛋白(steroidogenicacuteregulatoryprotein,StAR)和Cyp19a1基因的启动子区，降低了StAR和Cyp19a1的表示出，进而影响E2的合成。当前人们已经发现，不同类型的miRNAs通过不同的信号通路，精到准确调控着卵泡激素的合成，但详细哪条通路起了主要作用或是这些通路之间是怎样互相作用调控着激素合成还不清楚，尚需进一步展开研究。miRNAs对卵泡发育障碍性疾病的调控作用卵泡发育障碍性疾病是造成雌性/女性不孕的重要原因，也是生殖医学/生殖生物学的研究重点，越来越多的研究表示清楚，miRNA在常见卵泡发育障碍性疾病，如多囊卵巢综合征(polycysticovarysyndrome,PCOS)和卵巢早衰(prematureovarianfailure,POF)中发挥作用。PCOS的特征是卵巢多囊样改变、不排卵和高雄激素血症。Naji等[47]研究发现，在PCOS患者颗粒细胞中miR-93和miR-21水平显着升高，且游离睾酮和游离雄激素指数与miR-93和miR-21的表示出呈正相关，miRNA作为雄激素合成通路的中间调控因子，其异常升高引起了患者的高雄激素血症。MiR-320a在PCOS患者颗粒细胞中的表示出显着下调，其靶向作用于雌激素合成的转录调控因子RUNX2,显着降低了CYP11A1和CYP19A1的表示出，导致颗粒细胞中雌激素合成显着减少[42]。除此之外，在PCOS患者的颗粒细胞中也发现了miR-323-3p水平下调。MiR-323-3p可靶向作用于胰岛素样生长因子1(insulin-likegrowthfactor1,IGF-1)mRNA,抑制IGF-1的表示出，进而下调雄激素受体、抗苗勒氏管激素Ⅱ型受体、细胞色素P45019A、表皮生长因子受体和锌指蛋白转录因子GATA-4的表示出水平，导致患者体内雌激素合成减少，雄激素水平显着升高，出现高雄激素血症[39]。miR-27a-3p则通过作用于cAMP反响元件结合蛋白1,下调Cyp19a1的表示出，导致雄激素和雌激素表示出水平失调，促进了颗粒细胞的凋亡[48]。因而，颗粒细胞miRNA调控紊乱，将会引起激素失调，颗粒细胞凋亡，与PCOS的发生密切相关。POF是指卵巢功能衰竭、卵巢中卵母细胞数量显着减少所导致的40岁之前闭经的现象，其特点是颗粒细胞功能紊乱、雌激素水平降低，促性腺激素水平升高，但详细发生机制尚不清楚。Chen等[49]在POF患者血浆和卵巢颗粒细胞中发现miR-146a的表示出显着升高，miR-146a可靶向调控白细胞介素受体相关激酶和肿瘤坏死因子受体相关因子6的表示出，通过caspase级联反响促进颗粒细胞凋亡，导致卵泡闭锁。Cho等[50]研究发现，miR-146a单核苷酸多态性会改变FOXO3、FOXL2和CCND2的mRNA水平，使其靶基因表示出异常，进而导致颗粒细胞功能紊乱，卵巢卵泡发育缺陷。MiR-938可靶向结合到促性腺激素释放激素受体(gonadotropin-releasinghormonereceptor,GnRHR)mRNA上，调控着促性腺激素的循环水平，进而影响卵巢卵泡发育。miR-938GA多态性可引起GnRHR表示出的异常调控，造成卵泡发育受阻，出现POF[51]。当前已发现多种miRNA介入了POF发生的调控，这些miRNAs作为POF的诊断、靶向治疗或预后标志物的选择具有潜在的应用价值，对于说明POF的发生机制也是至关重要。将来瞻望随着对miRNAs研究的不断深切进入，人们逐步认识到miRNAs作为细胞活动的关键调控分子，不管是在正常生理状态还是病理状态下都广泛表示出，其调控卵泡细胞的增殖、分化和凋亡，影响卵巢正常的生理和病理经过，将来需要进一步说明其在卵泡发育中的调控机制。miRNAs具有高度保守性和稳定性，因而进一步挖掘miRNAs在生殖领域作为检测标志物的研究，以其进行卵巢疾病的诊断和治疗并作为辅助生殖技术选择优质卵母细胞和胚胎的客观标准，将对筛查和治疗卵巢疾病、提高受孕率和减少多胎发生率都具有重要意义。以下为参考文献[1]徐源,孙铁成,张爱玲,等卵巢miRNA研究进展[J]畜牧兽医学报,2020,45(4):509-516.DOl:10.11843/jissn.0366-6964.2020.04.001.[2]马亚仙，何明静,程冉,等.MicroRNA与多囊卵巢综合征发病机制的研究进展[J]实用妇产科杂志,2021,32(3)-177-180DOI:CNKI:SUN:SFCZ0.2021-03-011.[3]郭倩，朱宁，卜萌萌,等基于微小RNA架构的新型随机短发夹RNA文库构建([J].中国医学科学院学报,2021,39(4):518-524.D0l:10381jissn.1000-503X.2021.04.010.[4]SempereLF.Celebrating25yearsofmicroRNAresearch.fromdiscoverytoclinicalapplication[J]IntJMolSci,2022,20(8);1987-1996.DOl:10.3390/jmns20081987.[5]能霞辉,陈梅红MicroRNA介入的调控网络[J].医学分子生物学杂志，2007,4(4):367-370.DOl:10.3870/jissn.1672-8009.2007.04.022.[6]LiLS,SongYL,ShiXR,etal.ThelandscapeofmiRNAeditinginanimalsanditsimpactonmiRNAbiogenesisandtargeting[J].GenomeRes,2021,28(1):132-143.DOl:10.1101/gr.224386.117.[7]ZhangBY,ChenL,FengGD,etal.MicroRNAmediatingnetworksingranulosacellsassociatedwithovarianflliculardevelopment[J].BiomedResInt,2021,7:4585213.DOl:10.1155/2021/4585213.[8]YerushalmiGM,Salmon-DivonM,YungY,etal.CharacterizationofthemiRNAregulatorsofthehumanovulatorycascade[J].SciRep,2021,8(1):15605.D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