移植排斥反应的预测、诊断试剂盒的开发生产

PAGEPAGE34EvaluationWarning:ThedocumentwascreatedwithSpire.Docfor.NET.项目建议书项目领域：：生物技术项目名称：：移植排斥反反应的预预测、诊诊断试剂剂盒的开开发生产产单位：陕西瑞奇生生物科技技有限公公司基本信息1..项目负负责人基基本情况况姓名胡军性别男出生年月1962..10学历研究生学位博士获得最终学位院校第四军医大大学所学专业移植免疫学学现从事专业业移植免疫学学职称讲师职务务/主要工作经经历1982--19889年，在在河南省省确山县县卫生防防疫站从从事流行行病防治治工作。1989--19992年，在第四军医大学微生物学教研室病毒及其免疫专业读硕士学位。1992--19996年在在第四军军医大学学微生物物学教研研室从事事病毒及及其免疫疫和移植植免疫的的研究工工作。1996--19999年，在在第四军军医大学学西京医医院心血血管病研研究所移移植免疫疫学专业业读博士士学位。1999--20001年在第第四军医医大学西西京医院院心血管管病研究究所从事事移植免免疫学研研究。2001年年至今，从从事生物物技术产产品的开开发研究究，主要要从事移移植免疫疫学产品品的开发发工作。主要工作成成绩从事过的主主要重大大项目情情况、研研究成果果和获知知识产权权情况（不不限字数数）1、军队重重大课题题《心肺肺联合移移植临床床研究》220022.055-20005..12主要参参加者。项项目进展展顺利。2、《心脏脏移植临临床与基基础研究究》项目目的主要要参加者者，已获获得陕西西省科技技进步一一等奖。3、已获得得国家发发明专利利一项，已申请的发明专利一项，准备申请的专利两项。2.项目基基本信息息项目内容摘摘要（限限5000字）：：器官移移植排斥斥反应预预测、诊诊断产品品的开发发生产器官移植是是临床上上发展最最迅速的的一个领领域，据据权威机机构预测测，到二二十一世世纪中叶叶，外科科手术的的一半都都将是器器官置换换。世界界上已有有70多多万人接接受了器器官移植植，而且且这个数数字还在在以每年年5万多多例的速速度增加加，但临临床上对对器官移移植病人人的选择择及移植植后排斥斥反应的的无创诊诊断、监监测手段段等尚未未建立起起来；这严重重制约了了器官移移植的发发展和水水平的提提高。本项目把基基因工程程技术和和传统免免疫学方方法及新新建立的的免疫学学方法结结合起来来，制备备世界通通用的HHLA抗抗原标准准细胞，为为器官移移植前的的供、受体搭搭配，移移植后排排斥反应应的预测测、诊断断提供快快捷、敏敏感、特特异、可可靠、无创的科科学检测测方法，该该方法目目前已用用于临床床心脏移移植的排排斥反应应的诊断断，经过过大量的的临床活活检对照照有很好好的一致致性，该该方法的的最佳反反应条件件也已基基本建立立，目前前只需制制备出通通用检测测试剂盒盒生产所所需的原原材料即即可进行行产品的的大规模模生产。该该项目的的成功填填补了世世界器官官移植领领域的空空白，对对急性排排斥反应应的早发发现、早早诊断、早早治疗，明明显提高高移植患患者的生生存质量量，延长长存活期期限均具具有革命命性的重重要作用用。不但但具有广广泛的社社会效益益，而且且还具有有巨大的的经济效效益。该该试剂盒盒的出现现会大力力推动器器官移植植领域的的发展，终终将使全全球器官官移植的的总体水水平有明明显提高高。本项目原材材料的制制备使用用的技术术是目前前最先进进的基因因工程技技术；其其所用的的混合淋淋巴细胞胞培养方方法是目目前免疫疫学专家家公认的的，反映映机体细细胞免疫疫状态最最好的体体外模型型；所用用的混合合淋巴细细胞反应应抑制试试验是我我们近期期才新建立的的一个细细胞免疫疫学检测测的新方方法，并并已申请请专利，故故本项目目产品短短期内被被其他更更先进的的技术和和方法所所取代的的可能性性不大。所所使用的的主要原原材料和和主要技技术均立立足国内内，采购购渠道通通畅。器官移植排排斥反应应预测、诊诊断、监监测领域域在世界界上属于于一个尚尚未开发发的领域域,尚未未有与排排斥反应应诊断有有关的试试剂盒推推出,我们申申请国内内外专利利后可保保护200年。目目前排斥斥反应预预测试剂剂盒已获获国家发发明专利利，正在在申请美美、日、德德、英、印印五国的的专利；；排斥反反应诊断断试剂盒盒已申请请国家发发明专利利。本产产品的出出现将抢抢占全球球器官移移植领域域产品的的至高点点。本项目产品品以出口口为主，市市场约44-5亿亿美元//年（市市场上无无同类竞竞争产品品）。预预计总投投资约550000万元人人民币，首首期投资资需10000--15000万元元人民币币。投资资到位后后18--24个个月可具具备批量量投产条条件，生生产能力力为年产产80万万套，投投产一年年后年产产1500万套。届届时，年年销售收收入200亿元人人民币，税税收3亿亿元人民民币，净净利润88亿元人人民币。产产品上市市后一年年可收回回全部投投资。二、项目情情况1、研究的的目的及及意义、应应用需求求、研究究开发的的必要性性（不限限字数）1.1项目目研究的的目的、意意义针对危害人人类健康康的各器器官的终终末期疾疾病，器器官移植植是目前前唯一的治疗手手段。器官移移植术前前排斥反反应的预预测、术术后排斥斥反应的的监测与与诊断，以以及最大大限度地地减少甚甚至避免免病理排排斥反应应的发生生等是临临床器官官移植急急需解决决的问题题，也是是国内外外共同关关注的热热点和难难点问题题。本项项目通过过基因工工程技术术和细胞胞工程技技术，建建立HLLA抗原原标准细细胞检测测平台，为为器官移移植前的的供受体体搭配、移移植后排排斥反应应的预测测、监测测、诊断、预预防和技技术服务务保障提提供快捷捷、敏感感、特异异、可靠靠、无创的科科学检测测方法。该项目目的成功功填补了了世界器官官移植领领域的空空白，对对排斥反反应的早早发现、早早诊断、早早治疗，明明显提高高移植患患者的生生存质量量，延长长存活期期限均具具有革命命性的重重要作用用。不但但具有广广泛的社社会效益益，而且且还具有有巨大的的经济效效益。该该试剂盒盒的出现现会大力力推动器器官移植植领域的的发展，终终将使全全球器官官移植的的总体水水平有明明显提高高。由于该项目目填补了了世界器官官移植领领域的空空白，它它的出现现将抢占占全球器器官移植植领域产产品的至至高点。将使我国在世界生物技术产品领域拥有一席之地。为我国生物技术的产业化发展开辟一个新领域，对促进我国生物技术产业向多元化发展具有重要意义。1.2应用用需求及及研究开开发的必必要性器官移植是是目前临临床上发发展最迅迅速的一一个领域域,有有人预测测,到到二十一一世纪中中叶,外科手手术的一一半都将将是器官官置换..目前前世界上上已有770多万万人接受受了器官官移植,,而且且这个数数字还在在以每年年近5万的的速度增增加,但目前前临床上上对器官官移植病病人的选选择都是是通过HHLA抗抗原配型型来比较较供受体体差异的的大小，这这种比较较只是对对供受体体HLAA抗原的的客观存存在的差差异性进进行比较较，不能能反映他他们各自自HLAA抗原组组合的功功能状况况，而不不同的抗抗原组合合具有不不同的免免疫反应应性，所所以，原原来的方方法不能能反映一一个人的的HLAA抗原组组合对人人类某一一个HLLA抗原原的免疫疫反应性性。而本本方法是是一个功功能性检检测方法法，是了了解一个个人的HHLA抗抗原组合合对各种种不同特特定抗原原反应性性的方法法。这一一方法所所得结果果更接近近人体内内实际的的免疫反反应状况况。目前前对移植植后排斥斥反应的的确定主主要是通通过有创创，痛苦苦、非特特异的活活检穿刺刺方法。临临床上急急需的快快捷、敏敏感、特特异、可可靠、无创的科科学手段段尚未建建立。再再者器官官移植后后,受体体需终生生使用免免疫抑制制剂,但服用用该药的的剂量过过大不仅仅导致费费用增加加(一般般一年需需数万元人人民币)),且且受体易易患感染染性疾病病及恶性性肿瘤等等,服服用剂量量过小又又会导致致移植器器官被排排斥而失失去功能能,如如何对具具体的个个体选择择合适的的用药剂剂量是长长期以来来困扰临临床医生生的一个个难题。多多年来指指导用药药的“金指标标”一直是是上述的的活检穿穿刺,但由于于活检穿穿刺费用用高且有有创、痛痛苦,不易为为病人接接受,而且穿穿刺本身身具有危危险性,,不宜宜多做,,故移移植后在在医生未未察觉的的情况下下突然因因排斥反反应使移移植器官官失去功功能而导导致病人人死亡情情况屡有有发生。再再如,许多病病人在移移植后,,由于于经济原原因而停停用免疫疫抑制剂剂,结结果发现现其中有有些病人人停药后后并不发发生排斥斥反应,,也就就是说这这些病人人对供体体器官产产生了免免疫耐受受，在未未停药的的患者中中，实际际上可能能有不少少患者已已对供体体器官产产生了耐耐受。然然而，由由于没有有一个科科学的指指标去检检测并说说明该患患者已对对供体器器官产生生了耐受受，所以以，医生生很难确确定停用用免疫抑抑制剂的的时机，从从而，使使移植后后停用免免疫抑制制剂成为为一种冒冒险。因因此，本本方法将将对器官官移植前前的供受受体选择择、移植植后的排排斥反应应的确定定以及停停用免疫疫抑制剂剂时机的的掌控有有革命性性的贡献献。器官移植是是治疗许许多器官官终末期期疾病的的唯一方方法。在在器官移移植后，供供受体间间HLAA抗原的的差异将将引起排排斥反应应，排斥斥反应仍仍是目前前影响心心、肝、肾肾、骨髓髓等器官官或细胞移植后11年、55年、110年存存活率的的主要因因素，如果有有一个在在移植以以前可以以挑选供供受体使使之合理理搭配((即挑选选那些移移植后可可能发生生排斥反反应较轻轻或不发发生排斥斥反应的的供受体体进行移移植,这一点点对骨髓髓移植尤尤为重要要)、在在移植后后能检测测有无排排斥反应应发生、移移植器官官有无淋淋巴细胞胞慢性浸浸润及受受体对供供体器官官有无免免疫耐受受发生等等的无创创检测方法法,对对指导临临床医生生合理调调整免疫疫抑制剂剂用量、使之适适时停药药(将大大大减轻轻病人的的经济负负担),,提高高病人生生存质量量，降低低移植病病人的死死亡率,,延长长移植器器官的存存活时间间具有重重要意义义,这将将有力推推动器官官移植事事业的发发展。所以,随随着接受受器官移移植的患患者的不不断增加加及移植植免疫学学的迅速速发展,,建立立一套完完善的移移植前对对供受体体选择,,移植植后监测测受体对对供体特特异性免免疫状态态的无创创检测方方法,对供体体器官的的长期存存活已变变得越来来越重要要。但在在本方法法出现以以前,临床上上尚没有有一个快快捷、敏敏感、特特异、可可靠、无创的科科学的指指标来指指导移植植前供体体的挑选选,移移植后排排斥反应应和免疫疫耐受的的诊断,,及免疫疫抑制剂剂用量调调整的方方法。2．主要研研究开发发内容、拟拟解决的的技术难难点、创创新突破破点以及及预期达达到的目目标、主主要经济济技术指指标和水水平（不不限字数数）2.1本项项目研究究开发的的主要内内容：将传统免疫疫学检测测方法和和现代分分子生物物学技术术有机结结合，建建立一套套可应用用于临床床器官移移植排斥斥反应预预测的快快捷、敏敏感、特特异、可可靠、无创的科科学方法法；在进进行传统统免疫学学研究过过程中建建立一个个全新的的免疫学学方法，应应用于排排斥反应应的临床床诊断。主主要研究究内容有有：(1)排斥斥反应预预测：它是运用分分子生物物学技术术，建立立表达HHLA--Ⅰ类和Ⅱ类抗原原的标准准细胞株株，使每每株细胞胞上只表表达一个个HLAA抗原。再再把这些些几乎包包含了人人类全部部HLAA抗原的的细胞株株的细胞胞分别放放入细胞胞培养板板各孔之之中，制制成标准准细胞板板作为抗抗原板，用用该抗原原板通过过混合淋淋巴细胞胞培养方方法来检检测受体体对哪些些HLAA抗原反反应强、对对哪些HHLA抗抗原反应应弱，从从而指导导我们为为受体挑挑选合适适的供体体器官，以以减少移移植后排排斥反应应的发生生。其主主要研究究内容包包括：A、HLAA抗原缺缺失细胞胞系（作作为HLLA抗原原表达的的空白细细胞载体体）的选选择与鉴鉴定，已已完成。B、通过EEB病毒毒感染的的方法建建立包含含已知人类类全部HHLA抗抗原的几几十个细细胞系（该该项工作作已经基基本完成成），并并分别从从这些细细胞中提提取mRRNA进进行反转转录，再再通过PPCR方方法从反反转录的的cDNNA中克克隆出目目的基因因进行测测序，该该项工作作正在进进行中，已已经完成成了其中中一部分分。C、选择一一种能在在真核细细胞中表表达、并并且能整整合到宿宿主细胞胞基因组组中的逆逆转录病毒表表达载体体，构构建HLLA抗原原表达载载体，该该项工作作正在进进行中（已已构建出出10余余个抗原原表达载载体）。D、把HLLA抗原原表达载载体经包包装后转转染入细细胞中表表达（正正在进行行中）。E、筛选稳稳定表达达某一个个HLAA抗原的的细胞建建株、并并进行鉴鉴定。F、重复上上述工作作，建立立分别表表达不同同HLAA抗原近近1000个亚型型抗原的的细胞株株。G、探索用用这些细细胞株作作为刺激激细胞进进行混合合淋巴细细胞反应应的最佳佳条件。H、建立这这些细胞胞株的大大规模培培养条件件，用这这些细胞胞制备包包含人类类全部HHLA抗抗原的检检测板。I、用这种种HLAA抗原检检测板，通通过混合合淋巴细细胞反应应为器官官移植受受者挑选选供体，同同时对移移植后的的患者进进行监测测，发现现已对供供体器官官产生免免疫耐受受的患者者，并指指导其逐逐渐停用用免疫抑抑制剂。J、建立用用这些细细胞株作作为刺激激细胞进进行混合合淋巴细细胞反应应抑制试试验的最最佳条件。(2)排斥斥反应等等的诊断断：在进行移植植免疫学学的研究究过程中中，我们们又建立立了一个个全新的的免疫学学方法，由由于其实实验方法法与混合合淋巴细细胞反应应相似，反反应结果果和混合合淋巴细细胞反应应结果完全全相反，暂暂时我们们把它叫叫做混合合淋巴细细胞反应应抑制试试验，该该实验可可以用来来检测外外周血中中活化淋淋巴细胞胞的特异异性，故故使用上上述HLLA抗原原板即可可检测器器官移植植受者体体内有无无HLAA抗原活活化的淋淋巴细胞胞，从而而判断体体内有无无排斥反反应发生生。该方方法不但但可以用用于诊断断排斥反反应，也也可能用用于各种种传染病病的诊断断和预防防。⑴挑选上述述已被EEB病毒毒转化的的细胞株株中相互互不具有有相同抗抗原的细细胞株，以以他们为为载体，通通过上述述基因工工程的方方法，把把其它的的未包含含在所挑挑选的载载体中的的HLAA抗原分分别转入入其中并并表达，使使一个细细胞表达达尽可能能多的HLAA抗原。从从而使这这些细胞胞株表达达几乎人人类全部部的HLLA抗原原。⑵用这些表表达较多多HLAA抗原的的细胞株株制备HHLA抗抗原板，通通过混合合淋巴细细胞反应应抑制试试验对器器官移植植病人进进行排斥斥反应监监测,并并探索其其最佳反反应条件件。⑶选择上述述两种细细胞板中中的一种种细胞板板进行混混合淋巴巴细胞反反应抑制制试验，对对器官移移植后的的患者进进行排斥斥反应监监测、诊断和预预防。⑷对混合淋淋巴细胞胞反应抑抑制试验验方法在在临床感感染性疾疾病诊断断方面的的应用进进行探索索性研究究，争取取早日把把该方法法应用到到流脑、乙乙脑病毒毒、出血血热病毒毒、水痘痘病毒、麻麻疹病毒毒、腮腺腺炎病毒毒、呼吸吸道合胞胞病毒、SSARSS病毒等等疾病的的诊断和和感染性性疾病疫疫苗接种种后的免免疫效果果评价方方面。2.2拟拟解决的的技术难难点：建立、筛选选稳定表表达单一一HLAA抗原的的各种细细胞株。表达HLAA抗原的的细胞株株的大规规模培养养技术。2.3创新新突破点点：（1）利用用基因工工程技术术建立百百余种分分别只表表达一种种HLAA抗原的的标准细细胞株，把把这些细细胞株和和传统免免疫学技技术结合合建立人人类混合合淋巴细细胞反应应板，在在世界上上首次建建立一个个世界通通用的、体体外检测测一个个个体对每每个HLLA抗原原反应性性的方法法。该方方法已获获国家发发明专利利（见附附件）。（2）建立立了一个个全新的的、可以以用来检检测机体体内活化化淋巴细细胞特异异性的免免疫学方方法（目目前世界界上还没没有一个个检测体体内活化化淋巴细细胞特异异性的方方法），并并在世界界上推广广该方法法用于排排斥反应应的诊断断和预防防。2.4预期期达到的的目标2.4.11过22-3年年的工作作，完成成上述HHLA--Ⅰ类抗原原、HLLA-‖‖类抗原原近1000个亚亚型抗原原的表达达、并使使之具备备生产条条件。通过3-44年的工作作，用于于移植前前挑选供供、受体使之之合理搭搭配的检测试剂剂盒，用用于移植植后排斥斥反应监监测、诊诊断的试试剂盒均均拿到生生产批号号，投放放并满足足国内市市场的需需求，同同时开始始进军国国外市场场。2.5主要要技术指指标和水水平：2.5.11主要技技术指标标：（1）表达达10多多种和表表达单种种HLAA抗原的的细胞株株，具有有稳定表表达、传代能能力。（2）移植植前用于于预测，可可以了解解一个个个体对每每个HLLA抗原原分子的的反应性性；移植植后用于于诊断，可可以确定定受体对对供体所所含抗原原有无免免疫耐受受发生。（3）移植植后用于于诊断，不不但可以以确定排排斥反应应的发生生与否，而而且还可可以确定定受体对对哪一个个HLAA抗原产产生了排排斥反应应，精确确到每一一种抗原原亚型。（4）建立立哺乳动动物细胞胞大规模模培养的的技术平平台，建建立和掌掌握500升、3300升升动物细细胞大规规模培养养的技术术条件。2.5.22水平：：①预测、诊诊断排斥斥反应的的试剂盒盒达到世世界领先先水平。②有关细胞胞大规模模培养的的技术达达到国内内先进水水平。2.6经经济指标标：①预测、诊诊断排斥斥反应的的试剂盒盒国内上上市后年年利税达达到一亿亿元人民民币。出出口年创创汇4-6亿美金金。②各种传染染性疾病病检测试试剂盒投投放市场场后，可可创造不不少于排排斥反应应检测试试剂盒所所能创造造的效益益。综上分分折，本本项目预预计投资资50000万元元，首期期投资需需10000-115000万元人人民币。投投资到位位后188-244个月可可具备批批量投产产条件，生生产能力力为年产产80万万套，投投产一年年后年产产1500万套。届届时，年年销售收收入200亿元人人民币，税税收3亿亿元人民民币，净净利润88亿元人人民币。产产品上市市后一年年可收回回全部投投资。33、预期期可获得得的发明明专利等等知识产产权情况况（不限限字数）①目前已获获得国内内发明专专利一个个，专利利号为：：0011137747..6(见见符件))，其在美、英英、德、日日、印度度的专利利申请正正在进行行中。②我们建立立的免疫疫学新方方法的也也已申请请专利。44、项目目国内外外发展现现状与趋趋势，国国内现有有技术基基础，与与项目有有关的技技术领域域的国内内外专利利申请和和授权情情况以及及其他知知识产权权情况((附有关关查新结结论)（不不限字数数）4.1国内内外技术术现状及及发展趋趋势目前,临临床器官官移植后后对移植植排斥反反应的最最终诊断断主要靠靠活组织织穿刺检检查来确确定,如如心脏移移植，目目前急性性排斥反反应仍然然是影响响心脏移移植病人人长期存存活的主主要因素素，病人人接受心心脏移植植后，世世界上各各移植中中心的普普遍做法法是通过过心内膜膜活检来来监测或或诊断排排斥反应应，尤其其是移植植后第一一年内，可可能要进进行多次次心内膜膜活检，由由于活检检穿刺具具有一定定的创伤伤和危险险，而且且还要昂昂贵的费费用，病病人比较较痛苦，不不易为医医生和病病人所接接受，所所以国内内大多数数心脏移移植单位位都很少少正规地地给患者者做定期期活检。为为建立一一个风险险小，快快捷、敏敏感、特特异、可可靠、无创、费用低低、医生生和病人人都乐于于接受的的排斥反反应的监监测、诊诊断的科学方法法，国内内外研究究人员都都进行了了大量工工作。他他们先后后对心肌肌钙蛋白白T、心心肌钙蛋蛋白I[[1,22,3,,4]，降降钙素前前体，肿肿瘤坏死死因子、IIL－22、ILL－6[[5,66]、nntoppterrin[[7]、CC反应蛋蛋白[88]及eechoocarrdioograaphiicffuncctioonallinndiccesorstrresss-veeloccityyreelattionnlooopss[9,,10,,11]]、bbraiinnnatrriurretiicppepttidee[122]等等在器官官移植排排斥反应应诊断中中的意义义进行了了大量研研究，结结果均不不理想。目目前，临临床移植植排斥反反应的诊诊断主要要靠临床床医生的的经验、一一些移植植器官的的功能性性指标((一旦发发现器官官功能有有改变,,就表明明器官的的损伤已已相当严严重了，时机太晚！)和一些非特异的免疫学指标(如白细胞移动抑制试验,C反应蛋白检测,淋巴细胞转化试验,淋巴细胞亚群分析及一些细胞因子监测等的结果)。虽然一些大的移植中心试图把混合淋巴细胞培养、CTL杀伤实验等细胞免疫的特异性指标引入器官移植后排斥反应的临床诊断,但由于他们未建立标准细胞株,所以他们只能把一个一个供体的脾细胞冻存起来作为刺激细胞或靶细胞,而且只能做一对一的检查,即一个供体对一个受体做检查,由于每一个冻存脾细胞中B淋巴细胞的比例不同(只有B淋巴细胞表面才表达二类抗原)及他们冻存的细胞各自的状态不同，还有人们对活化淋巴细胞对抗原再刺激的反应增强、减弱的条件了解不足（对反应原理不清楚）等,使他们的结果也不相同,缺少可比性和稳定性。有时即使是对同一个人的检测，同一中心不同时间做的结果也不一样，所以，对于把混合淋巴细胞反应方法用于诊断器官移植排斥反应的研究也越来越少。到目前为止，世界上其他研究单位尚未建立一个合适的排斥反应诊断方法。4.2国内内现有的的技术基基础：生物技术可可能是国国内少数数几个接接近于国国外技术术水平的的领域之之一，基基础较好好；本项目目所使用用的技术术均为生生物工程程领域的的成熟技技术，现现有技术术基础已已完全满满足该项项目的要要求；研研究组大大部分技技术人员员都是相相关领域域的专家家，如有足足够资金金支持，完成该项目无大的困难。1.HowwarddJ，SSmevvenB，JJefrreyE,etal..Nooninnvassiveedeetecctioonoofrrejeectiionoftraanspplannteddheearttswwithhinndiuum-1111--labbeleedllympphoccytee.Ciircuulattionn,119877,775:8868--8766．2.NaarullaJJ,AAciooERR,NNaruulaN,AAnneexinn-Vimaaginngffornonninvvasiivedettecttionnoffcaardiiacalllogrrafttreejecctioon.NattMeed220011Deec;77(122):113477-5223.PattrciiaKK，DoonalldWW，AnnnaMorriarrty,,etal．．Immmunoologgicaalmmoniitorringgoffthhecardiiactraanspplanntppatiientt.Chhestt,19988,,94：：8344-8336.4.ReaaderrJAA,BBurkkeMMM，CouunihhamP，etal．．Nonninvvasiivemonnitoorinngoofhhuammncardiiacalllogrrafttreejecctioon.TTrannspllanttatiion,,19990,550:229-330.5.VallenttineeHAA、Foowl航航MB，HHunttSAA,ettall．ChhanggesinDopppleereechoocarrdioograaphiiciindeexessoffleeftvenntriicullarfunnctiionaspottenttiallmaarkeersofacuutecarrdiaacrrejeectiion..CCircculaatioon.19887，776(ssupppl.55)v--86．．6.AueerTTH，SSchrreieerGG,HuutteenHH,ettall.Affterrheeartttrranssplaantaatiooniintrramyyocaardiialeleectrrogrramforrmoonittoriingofalllogrrafttreejecctioon.TraanspplanntPProcc，19995,,27((3)：：19883-119855．7.F..Ibeererr,B..Graasseer,eetaal.Inttradduciingannewcliiniccalmetthoddfoornnoniinvaasivverrejeectiionmonnitoorinngaafteerhhearrtttrannslllanttatiiontocliiniccalpraactiice::Annalyysissoffpaaceddinntraamyeecarrdiaaleelettroggramm.TTrannspllanttPrroc,,19998,330,8895--89998.AnngerrmannnCCE,NNasssanK,eetaal.rrecoogniitioonoofaacutteccarddiaccallloggrafftrrejeectiionfroomsseriialinttegrreteedbaccksscattterranaalyssisinhummanheaarttraanspplanntrreciipieentss.CComppariisonnwiithconnvenntioonallecchoccarddioggrapphy..Ciircuulattionn.119977,955(1))：14409.MaarieePYY,AAngiioiM,CarrteaauxJP,,etal..DeetecctioonaandpreedicctioonoofaacuttehhearrtttrannspllanttreejecctioonwwithhthhemmyoccarddiallT22deeterrminnatiionprooviddedbyabblacck-bblooodmmagnnetiicrresoonannceimaaginngssequuencce.JAAmCColllCaardiiol20001MMar1;337(33):8825--31..10.MMulllenJC,,BeentlleyMJ,,SccherrrKKD,eetaal.TTropponiinTTanndIIarrennotrelliabblemarrkerrsoofccarddiacctrranssplaantrejjecttionn.EEurJCCarddiotthorracSurrg220022Auug;222(22):2233--711.WaahlaandeerHH,KKjelllsttrommC,,HoolmggrennD，eetaal.SSusttainnedeleevattedconncenntraatioonsofcarrdiaacttropponiinTTduurinngaacutteaalloograaftrejjecttionnaffterrheeartttrranssplaantaatiooniincchilldreen.Traanspplanntattionn20002Octt277;744(8)):11130--512.CChannceJJ,,SeegallJBB,WWalllerssonG,eetaal.CCarddiacctrropooninnTanddC--reaactiiveprooteiinaasmmarkkerssoffaccuteecaardiiacalllogrrafttreejecctioon.CliinCChimmAccta20001OOct;;3122(1--2)::31--95、项目拟拟采取的的研究方方法（或或技术路路线、实实施方案案）及其其可行性性和风险险分析（不不限字数数）5.1研究究方法：：⑴细胞培培养技术术⑵基因工工程技术术⑶病原微生生物培养养及纯化化技术⑷单克隆隆抗体技技术⑸蛋白质纯纯化技术术⑹⑹免疫组组化技术术⑺混合淋巴巴细胞反反应⑻混合淋淋巴细胞胞反应抑抑制试验验5.2技术术路线图图1：筛选具有不同HLA抗原的个体，并用EB病毒转化其B淋巴细胞利用基因工程技术、构建表达HLA抗原的双顺反子的逆转录病毒载体筛选具有不同HLA抗原的个体，并用EB病毒转化其B淋巴细胞利用基因工程技术、构建表达HLA抗原的双顺反子的逆转录病毒载体细胞载体细胞载体从EB病毒转化的B淋巴细胞中挑选出几个彼此不具相同HLA抗原的细胞株作抗原载体从EB病毒转化的B淋巴细胞中挑选出几个彼此不具相同HLA抗原的细胞株作抗原载体转染抗原空白载体细胞使一个细胞上只表达一种HLA抗原细胞转染，增加HLA抗原表达的种类转染抗原空白载体细胞使一个细胞上只表达一种HLA抗原细胞转染，增加HLA抗原表达的种类筛选得到分别稳定表达各种HLA抗原的细胞株筛选得到稳定表达10种以上HLA抗原的细胞株筛选得到分别稳定表达各种HLA抗原的细胞株筛选得到稳定表达10种以上HLA抗原的细胞株两类细胞分别进行大规模培养，并制备成相应的试剂盒两类细胞分别进行大规模培养，并制备成相应的试剂盒用混合淋巴细胞反应：1、挑选供、受体使之合理搭配。用混合淋巴细胞反应：1、挑选供、受体使之合理搭配。2、免疫耐受的诊断用混合淋巴细胞反应抑制实验监测诊断排斥反应美、欧欧临床试试验及市市场准入入、FDDA申请请5.3可行行性研究究：⑴基因的克克隆表达达是基因因工程的的基本技技术，研研究组有有一位基基因工程程专家专专门负责责该项工工作，无无大的技技术问题题；稳定定表达某某一HLLA抗原原细胞株株的筛选选也无大大的技术术难点，所所有的困困难就是是工作量量大；⑵项目研究究所使用用的混合合淋巴细细胞反应应方法是是经过几几十年验验证的、反反映体内内细胞免免疫状态态的最好好的体外外模型，对对该方法法研究组组有多个个成员都都有丰富富的试验验经验；；⑶混合淋巴巴细胞反反应抑制制试验为为本研究究组自己己所建立立，其建建立时间间虽然较较短，但但经1000余人人次临床床应用，550余人人次活检检病理对对照检查查，二者者有很好好的一致致性。5.4风险险分析：：排斥反应的的预测和和诊断方方面的试试剂盒原原材料的的制备，其其所用技技术均为为基因工工程的常常用技术术，理论论上本研研究没有有太大的的、意想想不到的的困难和和技术风风险。其其所用的的检测方方法：一一个是混混合淋巴巴细胞培培养，一一个是混混合淋巴巴细胞反反应抑制制试验。前前一个已已建立近近30年年，是免免疫学界界公认的的、能够够反映机机体内细细胞免疫疫状态的的最好的的方法；；后一个个虽然建建立时间间较短，但但用于临临床排斥斥反应检检测与目目前公认认的活检检对照具具有很好好的一致致性，而而且其体体外模型型也已建建立成功功，其反反应发生生的内部部机理也也已基本本清楚。6、预期研研究成果果应用转转化的前前景预测测及分析析（包括括国内外外应用或或市场现现状、潜潜在用户户、市场场前景及及风险预预测，经经济效益益和社会会作用、影影响分析析等）6.1市场场对该试试剂盒的的需求来来源①移植前对对供受体体进行挑挑选:每年年全世界界大约要要进行55万例器器官移植植和骨髓髓移植,,除这这些受者者需检查查外,每个受受者需从从多个有有意贡献献器官和和骨髓的的被选供供者中选选择一个个合适的的供者,,故做做一例器器官移植植或骨髓髓移植需需作多个个检查,,此项项每年大大约需110万多多个试剂剂盒,共约330000万美元元的市场场.②PRAA检测::目目前每年年全世界界大约进进行5万万例器官官移植,,每个个受体移移植前均均需做PPRA检检测,此项每每年大约约需5万万个PRRA检测测试剂盒盒,共共约2000万美美元的市市场.但该项项检测有有两个公公司的产产品已经经投放市市场.③排斥反应应的诊断断:目前全全世界已已有存活活移植患患者约550万人,而而且每年年还在以以近5万万例的速速度增加加,按按常规使使用,接受器器官移植植1年以以内每年年需检查查4次,,1年年以上每每年需检检查2次次,此此项每年年大约需需1200万个试试剂盒,,共约约360000万万美元的的市场..④免疫耐受受检测::服服用免疫疫抑制剂剂两年以以后均可可检测,,一年年检测一一次,此项每每年大约约需检测测试剂盒盒50万万个,共约1150000万美美元的市市场.⑤自身免疫疫性疾病病的诊断断需要。⑥临床科研研工作的的需要。⑦肿瘤，乙乙肝等疾疾病患者者的细胞胞免疫功功能评价价等。⑧各种病毒毒性疾病病诊断的的需要。其市场也在5亿美元左右。综上分析，器器官移植植排斥反反应市场场预测诊诊断市场场约为55亿美元元，各种种病毒性性疾病诊诊断试剂剂盒的市市场也有有约5亿亿美元，总总计该项项目所涵涵盖的市市场在110亿美美元以上上。6.2风险险分析：：①本项目所所使用的的技术是是目前最最先进的的基因工工程技术术；其所所用的混混合淋巴巴细胞培培养方法法是目前前免疫学学专家公公认的，反映机体细胞免疫状态最好的体外模型；所用的混合淋巴细胞反应抑制试验是我们近期才建立的一个免疫学方法，故本项目产品短期内被其他更先进的技术和方法所取代的可能性不大。②本项目研研究所涉涉及的基基础技术术和研究究方法均均已成熟熟，足以以支撑本本项的实实施。③本项目所所使用的的主要原原材料立立足国内内，采购购渠道通通畅。④目前器官官移植排排斥反应应预测、诊诊断、监监测领域域在世界界上属于于一个尚尚未开发发的领域域,尚尚未有其其他有关关的试剂剂盒推出出,我我们申请请国内外外专利后后可保护护20年年。综上所述，目目前在器器官移植植前的供供受体挑挑选，移移植后的的排斥反反应和免免疫耐受受性诊断断方面尚尚无相应应产品出出售，本本项目产产品推向向市场后后属独家家经营，无无竞争产产品。6.3经济济效益：：6.3.11产品成成本分析析以下产品成成本分析析按500万套/年年生产能能力计算算。制造成成本:全年制造成成本1224055万万元，其其中：直接材料774311.5万元（按按小试阶阶段平均均耗用材材料计算算）((约占660%))直接工资118600.8万元(约占占15%%)制造费用331122.7万元(约占占25%%)其中：折旧旧及摊销销15112.77万元((按新增增30776万元元固定资资产计，折折旧按66年平均均摊销))厂房租赁1160万元燃料动力3320万万元运输包装3300万万元外出考察880万元元其它5000万元元期间费费用期间费用包包括管理理费用、财财务费用用、销售售费用,,全年共共计4226733万元管理费用：：参照本本企业实实际情况况按销售售收入115%计计算，全全年计1148886万元元；财务费用：：约为销销售收入入3%计计算,全全年约229777万元销售费用::(含含广告推推广费用用)参参照本企企业实际际情况按按销售收收入255%计算算,全年年约2448100万元6.3.22经济济效益分分析试剂剂盒项目目经济效效益分析析表年度单位2007年2008年年生产能力套500000800000产销率%%80%90%年销售量套400000720000销售收入万元99240178632销售成本万元3721564506其中生产成本万元1240519848销售费用万元2481044658销售单价元24812481增值税15%万元1488626795销售利润万元4713987331管理费用万元1488626795财务费用万元29775359利润总额万元2927655177企业所得税万元790514898净利润万元21371402796.3.33项目投投资评价价本项目在提提出申请请之前,,即前期期研究阶阶段已投投入2440万元元研发经经费,完完成中试试时的生生产能力力为800万套//年,此此后,将将通过增增加资金金投入等等方式扩扩大生产产规模,,2年后后年达到到年生产产能力1150万万套/年年,投资资评价计计算期,,年计算算(固定定资产佘佘值为零零),则则本项目目投资评评价如下下:本项目的财财务内部部收益率率较高,,投资回回收期短短,经济济效益明明显,是是见效快快、回报报高的好好项目,,项目的的投产,,既可以以给国家家税源做做出较大大贡献,,同时又又能出口口创汇..因此,,本项目目在经济济上是可可行的。6.4社会会效益分分析该项目属生生物高技技术领域域，是传传统免疫疫学方法法和现代代分子生生物学技技术结合合的产物物；其产产品投入入市场将将大大延延长接受受器官移移植病人人的生存存时间，提提高生存存质量，将将产生巨巨大的经经济效益益和社会会效益。该该项目开开发的成成功除每每年可为为国家增增加数亿亿美元的的利税外外，更重重要的是是它将使使我国在世界界生物高高技术产产品开发发领域填填补空白白和占有有领先地地位；使使器官移移植技术术和水平平获得突突破性发发展，使使我国器器官移植植产品占占领全球球同类产产品的至至高点；；作为我我国首个个出口欧欧美的生生物高技技术产品品，也将将对我省省生物高高技术产产业的发发展将具具有巨大大的推动动作用。本项目技术术高新，工工艺流程程长，对对上游生生物仪器器、生物物仪表、生生物设备备及生物物材料、高高分子材材料、包包装材料料、运输输业有着着极大的的需求,,对上游游各产业业的发展展起着积积极的推推动作用用。对下下游器官官移植产产业提供供快捷、简简便、准准确、价价谦的预预测、诊诊断试济济，提高高器官移移植反应应成活率率，降低低移植监监控的费费用，对对器官移移植事业业的发展展起到积积极的推推动作用用。同时时，由于于本项目目的产业业化，需需要高质质量的设设备、设设施，引引入人才才，招揽揽员工，对对本地的的经济发发展和对对本地文文化的发发展起到到积极的的带动作作用。投资计划书书本项目计划划总投资资50000万元元，投资资完成后后将拥有有一个全全国一流流的现代代化的生生物工程程研究所所（总面面积约115000平方米米）和一一个符合合美国FFDA要要求的GGMP生生物工程程产品生生产车间间（总面面积约550000平方米米）。其其投资拟拟分两次次到位，第第一批110000万元，建建立生物物工程研研究所；；第二批批40000万元元，建立立生物工工程产品品生产厂厂。首期投入110000万元，经经费主要要使用如如下：建立生物工工程研究究所：租租房15500平平方米；；地点：：佛山市市高新技技术产业业园；租租金：约约25万万元/年年；租期期：200年。人人员约330人。装修：1550万元元。购买设备（见见计划购购置的重重要仪器器设备表表）：3350万万元-4450万万元；包包括基因因工程实实验室：：1000万元，细细胞工程程实验室室50万万元，蛋蛋白质纯纯化实验验室1000万元元，通用用仪器设设备1000万元元-2000万元元。申报国外专专利约880万元元。科研经费2275万万元。研究所人员员工资及及办公、运运转费用用每年约约1200万元。其其中聘请请的技术术人员基因工程实实验室约约6人，年年需工资资约188万（其其中一个个博士约约需工资资12万万元）。细胞生物学学、免疫疫学、蛋蛋白质纯纯化实验验室约88人，年年需工资资约300万元（其其中3个个博士约约为244万元）。基金申请、国国内外生生物科技技信息搜搜集、信信息管理理约5人人，年需需工资约约12万万元（其其中一个个博士约约需工资资8万元元）。总经理、副副总经理理、办公公室主任任、财务务、打字字、司机机、人事事、勤杂杂等人员员工资每每年约225万元元。总计每年约约需工资资85万万元，办办公经费费约355万元，共共计1220万元元。研究所三年年建设计计划及目目标第一年，资资金到位位后购买买仪器、设设备、租租房、装装修；同同时招聘聘四医大大的研究究人员开开始HLLA-‖‖类抗原原20个个DR亚亚型抗原原的表达达工作。半半年后仪仪器、设设备全部部到位，研研究所建建成，研研究人员员移入研研究所工工作；通通过一年年的工作作，初步步建立起起一支具具有较强强技术实实力的产产品开发发、生产产队伍。第二年，完完善内部部管理；；理顺各各方关系系；完善善资金申申请、信信息收集集、产品品开发、生生产队伍伍的建设设；至少少完成HHLA--‖类抗原原20个个DR亚亚型抗原原的表达达、鉴定定工作，使使之达到到可进行行生产的的水平。至至少拿到到一项国国家的如如中小型型高新技技术企业业创新基基金等的的国家资资助。第三年，把把HLAA-‖类抗原原20个个DR亚亚型抗原原制成检检测试剂剂盒推向向市场，同同时申请请国家产产业化资资助；完完成HLLA-ⅠⅠ类抗原原约600个亚型型抗原的的表达、鉴鉴定工作作使之达达到可以以进行生生产的水水平；至至少拿到到一项国国家基金金资助。第第二批资资金开始始进入，