省队生物奥赛课件实验

实验一：葡萄糖含量的测定——碘量法

实验目的:通过此实验要求学生掌握碘量法测定葡萄糖的基本原理掌握间接碘量法测定葡萄糖的操作方法。实验原理:碘与NaOH作用发生歧化反应生成具有氧化能力的次碘酸钠（NaIO），而葡萄糖能定量地被NaIO氧化。在酸性条件下，未与C6H12O6作用的NaIO又可转变成I2析出，因此只要用硫代硫酸钠（Na2S2O3）标准溶液滴定析出的I2，便可计算出C6H12O6的含量。其反应过程式如下：1．I2歧化反应：

I2+2NaOH=NaIO+NaI+H2O2．

氧化反应：

C6H12O6+NaIO=C6H12O7（葡萄糖酸）+NaI3．

NaIO歧化反应：与C6H12O6作用完后，剩下的NaIO在碱性条件下发生歧化反应：3NaIO=NaIO3+2NaI4．

酸化：NaIO3+5NaI+6HCl=3I2+6NaCl+3H2O析出的I2：I2+2Na2S2O3=Na2S4O6（连四硫酸钠）+2NaI实验器材与试剂：

器材：移液管，滴定仪或滴定管，碘量瓶试剂：0.05mol.L-1碘标准溶液。0.10mol.L-1Na2S2O3标准溶液。2mol.L-1NaOH溶液6mol.L-1盐酸溶液

1%淀粉待测葡萄糖溶液（约1%）碘量法是氧化还原滴定法中，应用比较广泛的一种方法。碘可做为氧化剂而被中强的还原剂（如Sn2+，H2S）等所还原．直接碘量法是供试液液就是你所测的物质和碘反应,当碘稍过量时,淀粉和碘反应显蓝色,这就是反应终点.

间接碘量法是加入定量的碘化钾,溴试剂等,生成碘,加淀粉显蓝色,然后加入硫代硫酸钠与碘反应,滴定终点为蓝色消失.实验过程：1.用移液管吸取10ml待测溶液放入碘量瓶中，准确加入5mlI2标准溶液。2.边加边摇动的情况下慢慢加入2mol/L-1NaOH溶液至溶液呈淡黄色。3.将碘量瓶加盖放置10—15分钟。4.加6mol/L-1盐酸于碘量瓶中使成为酸性。5.立即用Na2S2O3溶液滴定至溶液呈淡黄色。6.加入2ml淀粉指示剂，继续滴定至蓝色消失为止。7.记录滴定所消耗的Na2S2O3的量。重复试验一次。葡萄含量的计算：C6H12O6（g.L-1）={[（CI2VI2——1/2CNa2S2O3VNa2S2O3）

×MC6H12O6/1000]/10.00}×1000。

思考与分析：

1.碘量法测定葡萄糖的主要误差来源有哪些，应如何避免？2.间接碘量法为什么既可测定还原性物质又可以测定氧化性物质？测定时应如何控制溶液的酸碱性？为什么？3.为什么加碱速度不能过快，如果过快则对葡萄糖的测定结果有何影响？实验二：总糖与还原糖测定

实验目的：通过本实验要求学生掌握还原糖和总糖的测定原理，掌握用比色法测定还原糖的操作方法。实验原理：

本实验是利用3.5一二硝酸水杨酸与还原糖共热后被还原成棕红色的氨基化合物，在一定浓度范围内，还原糖的量和棕红色物质颜色的深浅程度成一定比例关系。通过测定540nm处的吸收值就可求出糖的含量。此法快速简便，杂质干扰小，但糖含量超过一定范围就会测不准确。实验器材及试剂：

仪器：容量瓶（100ml），漏斗，吸管，量筒，试管，烧杯，三角瓶，分光光度计，恒温水浴锅试剂：①3.5一二硝基水杨酸（DNS）试剂（6.3gDNS和262ml2mol.L-1NaOH，加到500ml含有182g酒石酸钾钠的热溶液中，再加5g重蒸酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加水定容至1000ml，贮于棕色瓶中。②1000ug/ml葡萄糖标准溶液：准确称取干燥恒重的葡萄糖1.000g，加水溶解后加8ml浓盐酸，加水定容至1000ml。③6mol.L-1盐酸。④6mol.L-1NaOH。

实验过程：

1．标准曲线的制作：1）取5支试管按下表配制不同浓度的葡萄糖标准溶液。管号1000ug/ml葡萄糖（ml）H2O（ml）葡萄糖终浓度（ug/ml）1191002282003373004464005555002）另取6支试管按下表加入各种溶液，制作标准曲线。管号

H2O100ug/200ug/300ug/400ug/500ug/DNSml

葡萄糖

mlGlcmlGlcmlGlcmlGlc10.5ml0.5ml20.5ml0.5ml30.5ml0.5ml40.5ml0.5ml50.5ml0.5ml60.5ml0.5ml混匀后沸水浴加热5min，取出冷却，加入4ml水混匀，以1号管作空白调零，测定其OD540以葡萄糖含量（ug）为横坐标，光密度值为纵坐标作标准曲线。2．淀粉中还原糖的测定：称取淀粉1.00g放入烧杯中。用少量水调成糊状。加50—60ml水摇匀。50℃保温20min，使还原糖浸出。定容至100ml。过滤。取滤液0.5ml测定还原糖。方法与标准曲线制作相同。3．淀粉中总糖的测定：

称取淀粉0.5g，放入三角瓶中。加入6mol.L-1盐酸10ml，水15ml。沸水浴中加热水解30min。冷却后加入6mol.L-1NaOH溶液调节至PH中性。水解液定容至100ml。过滤。取滤液10ml。稀释至100ml，即为稀释1000倍的总糖水解液。取稀释液0.5ml测定还原糖，方法与葡萄糖标准曲线制作相同。将样品中所测得的OD值，在标准曲线上查出相应的还原糖量，计算出淀粉中还原糖和总糖的百分含量。思考与分析：1．除此法外还有哪些方法可以测定总糖和还原糖？2．此法与其它测定糖含量的方法相比有何优缺点？3．在总糖的测定中为什么不直接用水解液来测定而要稀释后来测定。实验三：蛋白质含量的测定——双缩脲法

实验目的：

掌握双缩脲法测定蛋白质含量的其本原理，掌握双缩脲法测定蛋白质含量的操作方法。实验原理：两个尿素分子在加热的情况下失去一分子氨而形成双缩脲分子，双缩脲分子能与碱性硫酸铜形成粉红色的络合物称为双缩脲反应。蛋白质分子中因含有多个肽键，因此也有双缩脲反应，在碱性条件下蛋白质与Cu2+形成紫红色络合物，其颜色的深浅与蛋白质的含量成正比，此颜色最大吸收峰波长在540nm处，故可通过测定其吸收值来测定蛋白质含量。此法只与蛋白质的含量有关而与蛋白质的分子量、氨基酸成分无关，但以氨基酸、Tris、肽作缓冲溶液时，反应呈阳性。此法快速简便，但灵敏度较差，测定范围每毫升1—10毫克蛋白质。实验器材与试剂：器材：试管，移液管，721分光光度计，恒温水浴锅。试剂：①双缩脲试剂：取1.5gCuSO4.5H2O和6.0g酒石酸钾钠用500ml水溶解后在搅拌下加入300ml10%NaOH溶液，再用水稀释至1升。②标准蛋白溶液：10mg/mL牛血清白蛋白溶液。③未知浓度蛋白溶液（1：100的鸡蛋清稀释液）。实验过程：

1．标准曲线的制定：取12支试管分成两组按下表分别加入试剂。试管号123456标准蛋白液（ml）00.20.40.60.81.0水（ml）1.00.80.60.40.20双缩脲试剂（ml）444444充分摇匀后,恒温水浴25℃保温30min，以1号试管作对照调零测定其它试管540nm处的吸收值。取两组测定的平均值，以蛋白质含量作横坐标，吸收值为纵坐标绘制标准曲线。2．样品的测定：取两支试管各加入未知浓度蛋白液1ml，加入双缩脲试剂4ml25℃保温30min，测定540nm吸收值，通过此吸收值在标准曲线上查出样品中蛋白质的含量。思考与分析：1．蛋白质含量的测定除双缩脲法外，还有哪些方法，与双缩脲法比较各有何优缺点？2．有哪些因素影响其测定结果？实验四：维生素C的定量测定实验目的：掌握碘量法测定維生素C含量的原理。掌握維生素C含量测定的操作方法。实验原理：在酸性条件下，碘氧化还原型维生素C，维生素C生成氧化型，而碘被还原成无色的I-，过量的碘与淀粉生成兰色，即为终点。实验试剂：2%草酸溶液：草酸2g溶于100ml蒸馏水1%草酸溶液：溶1g草酸于100ml蒸馏水标准抗坏血酸溶液：准确称取50.0mg纯抗坏血酸，溶于1%草酸溶液，并稀释至500ml。（贮棕色瓶，冷藏，最好临用时配置）O.05mol/L碘液实验步骤：1、维生素C的提取：洗净蔬菜或水果、擦干称取20g蔬菜或水果加2%草酸少许研磨成糊状用2%草酸定容100ml过滤（最初数毫升滤液弃去）滤液备用2.标准液滴定：

准确吸取标准抗坏血酸溶液1.0ml（含0.1mg抗坏血酸），置150ml锥型瓶中。加1淀粉液用碘液滴定至蓝色出现，并保持15s不褪色即为终点。由所用碘的体积计算出1ml碘液相当于多少mg抗坏血酸。3.样品滴定取滤液20ml，加1ml淀粉液，用碘液滴定至兰色出现4.计算：V×TW×100=100g样品中含坏血酸mg数V=滴定样品时所用去的碘ml数T=1ml碘液相当于抗坏血酸mg数W=20ml样液相当于含样品的克数1.滴定速度为什么要迅速（一般不超过2分钟）。2.为什么最初数毫升滤液要弃去。3.有哪些因素影响测定结果。思考与分析：实验五：酵母RNA的提取与鉴定

实验目的：

1．掌握RNA的提取原理与方法。2．掌握鉴定核酸组分的方法。实验原理：酵母核酸中RNA的含量较高，RNA可溶于碱性溶液，而DNA不溶，用碱性溶液提取可使RNA与DNA分开，在提取液中加入酸性乙醇可使解聚的RNA沉淀而得到RNA的粗制品。

RNA含有核糖.嘌呤碱.嘧啶碱和磷酸等组分，加硫酸煮沸后可使RNA完全水解成各组分，从水解液中可以测定出各组分的存在。1．核糖的鉴定：核糖+浓盐酸糠醛,糠醛+苔黑酚——绿色物质。2．磷酸的鉴定：PO43-+3NH4++12MoO42-+24H+→（NH4）3PO4.12MoO3.6H2O↓+6H2O黄色磷钼酸铵在有还原剂存在时（VitC）Mo6+被还原成Mo4+，Mo4+再与MoO42-结合成Mo(MoO4)2或Mo3O8而呈蓝色即钼蓝。3．嘌呤碱的鉴定：嘌呤碱+Ag+→嘌呤银（絮状物沉淀）

实验器材及试剂：

器材：烧杯，三角瓶，试管，移液管，离心管，乳钵,量筒，水浴锅，离心机，。试剂：酵母片0.04mol.L-1NaOH,1.5mol.L-1硫酸酸性乙醇（30ml乙醇加入0.3ml浓盐酸）95%乙醇,浓氨水0.1mol.L-1AgNO3，苔黑酚乙醇液（6g苔黑酚溶于100ml95%乙醇）FeCl3浓HCl液（2ml10%FeCl3加入到400ml浓盐酸中）定磷试剂：17%H2SO4：2.5%钼酸铵：10%VitC：水=1：1：1：2（V/V）（临用时混合）。实验过程：1．RNA的提取：取12片酵母片，用乳钵研磨成粉末，加入30ml0.04mol.L-1NaOH溶液合并于三角瓶中，沸水浴上加热30min。冷却。3000rpm离心15分钟，取出上清液，搅拌下缓慢加入10ml酸性乙醇溶液。待RNA沉淀完全后，3000rpm离心15min，弃去上清液，沉淀用95%乙醇洗涤一次，沉淀备用。2．RNA的水解：将以上提取的RNA全部放入一支试管内，加入1.5mol.L-1H2SO45ml，沸水浴中加热10分钟，3．组成鉴定：①嘌呤碱的鉴定：取水解液1ml，加入2ml浓氨水，然后加入1ml0.1mol.L-1AgNO3，观察实验现象。②磷酸的鉴定：取1ml水解液，加入1ml定磷试剂，沸水浴加热5分钟，观察实验现象。③核糖的鉴定：取1ml水解液加入FeCl3-浓HCl2ml和苔黑酚乙醇溶液0.5ml，沸水溶加热10分钟，观察实验现象。思考与分析

1．在嘌呤碱鉴定中，为什么要加入过量浓氨水？2．定磷试剂中维生素C起什么作用？如果维生素C已被氧化成红色，则对实验有何影响？3．此法从酵母中分离的RNA是mRNA，tRNA，rRNA还是总RNA？如果要分离出纯的mRNA，下一步如何做？实验六：DNA的琼脂糖凝胶电泳1．琼脂糖凝胶的准备：称取0.3g琼脂糖置于三角瓶中，加入30mLTBE缓冲液，用小烧杯反扣三角瓶口，放入微波炉中加热（1分钟）至琼脂糖全部融化后取出，待凝胶温度冷却至60—70℃时，将凝胶倒入凝胶盒中，在胶盒一端装上样品槽板（即梳子），室温放置0.5—1小时，待凝胶全部凝固，取下样品槽板，将凝胶放入灌好电极缓冲液的电泳槽中。实验过程2．加样：将DNA样品与溴酚蓝指示剂按5：1（V/V）比例混合，用移液器取混合好后的DNA样品10uL加入凝胶样品槽中。3．电泳：将点样端接负极，另一端接正极，通电调节电压50V，电流40mA。电泳至溴酚蓝距另一端1cm停止电泳。4．染色：从电泳槽中取出凝胶，放入培养皿或白瓷盘中，加入溴化乙锭染色液覆盖凝胶浸泡30分钟，取出凝胶，用水稍冲洗凝胶。5．观察：将凝胶放在暗室（或暗处）用紫外分析仪照射凝胶，观察凝胶中橙黄色荧光的DNA谱带，测量每条DNA谱带的迁移位置，求出Rf值。（注意：染色和观察时带手套操作，避免染色液滴洒周围环境）。思考与分析：根据λDNA/EcoRI电泳图谱：测量每条谱带的迁移位置，计算出Rf值，根据Rf与lgM成反比作标准曲线。（λDNA/EcoRI六个片段分别是：13.7×106，4.74×106,3.73×106,3.48×106,3.02×106,2.13×106）实验八：血清谷丙转氨酶（SGPT）测定一、目的要求：（1）掌握血清谷丙转氨酶活力测定的原理及方法。（2）制备标准曲线，测定血清谷丙转氨酶活性。（3）学习如何设计实验二、原理：生物机体内转氨基作用是—氨基酸的氨基通过酶促作用转移到α—酮酸的酮基位置上，生成相应的酮酸与氨基酸的化学反应。催化这反应的酶称为转氨酶（transaminase），其辅酶为磷酸吡哆醛。转氨酶广泛存在于机体的各种组织中，在肝、心、肾等组织中的谷丙转氨酶(glutamicpyruvictransaminase,GPT)，谷草转氨酶(glutamicoxalacetictransaminase.GOT)活性较高。在正常新陈代谢过程中，血清内维持一定水平的转氨酶活性（即正常值）。当肝、心、肾等组织发生病变时，由于组织细胞肿胀，坏死导致大量的酶释放至血流中，从而引起血清谷丙