常见分子细胞生物技术

第一节引言第二节PCR技术第三节电泳技术第四节分子杂交第五节DNA-蛋白质研究其它技术常见分子、细胞生物技术第一节引言1978年沃纳·亚伯瑞士“发现限制性内切酶及其在分子遗传学方面的应用”丹尼尔·那森斯美国汉弥尔顿·史密斯美国1979年阿兰·麦克莱德·科马克美国“开发计算机辅助的断层扫描技术”高弗雷·豪斯费尔德英国1984年尼尔斯·杰尼丹麦“关于免疫系统的发育和控制特异性的理论，以及发现单克隆抗体产生的原理”乔治斯·克勒德国色萨·米尔斯坦英国1990年约瑟夫·默里美国“发明应用于人类疾病治疗的器官和细胞移植术”唐纳尔·托马斯美国2003年保罗·劳特伯美国“在核磁共振成像方面的发现”彼得·曼斯菲尔德英国2006年安德鲁·法厄美国“发现了RNA干扰——双链RNA引发的沉默现象”克雷格·梅洛美国2010年罗伯特·杰弗里·爱德华兹英国“因为在试管婴儿方面的研究获奖”1980年保罗·伯格美国“对核酸的生物化学研究，特别是对重组DNA的研究”沃特·吉尔伯特美国“对核酸中DNA碱基序列的确定方法”弗雷德里克·桑格英国1982年阿龙·克卢格英国发展了晶体电子显微术，并且研究了具有重要生物学

意义的核酸-蛋白质复合物的结构”1993年凯利·穆利斯美国“发展了以DNA为基础的化学研究方法，开发了聚合酶链锁反应（PCR）”迈克尔·史密斯加拿大“发展了以DNA为基础的化学研究方法，对建立寡聚核苷酸为基础的定点突变及其对蛋白质研究的发展的基础贡献”2002年约翰·贝内特·芬恩美国“发展了对生物大分子进行鉴定和结构分析的方法，建立了软解析电离法对生物大分子进行质谱分析”田中耕一日本库尔特·维特里希瑞士“发展了对生物大分子进行鉴定和结构分析的方法，建立了利用核磁共振谱学来解析溶液中生物大分子三维结构的方法”2008年下村脩美国“发现和改造了绿色荧光蛋白（GFP）”马丁·查尔菲美国钱永健美国2014年

埃里克·白兹格美国

超分辨率荧光显微技术领域取得的成就斯特凡·W·赫尔德国威廉姆·艾斯科·莫尔纳尔美国

1986年恩斯特·鲁斯卡德国“电子光学的基础工作和设计了第一台电子显微镜”格尔德·宾宁德国“研制扫描隧道显微镜”海因里希·罗雷尔瑞士生物技术对生物学、化学做出了巨大贡献！已经学习了RNAi、基因组学等内容回顾一些经典、至今仍广为使用的分子、细胞生物技术polymerasechainreaction(PCR)多聚酶链式反应第二节PCR技术一、PCR的最早设想Korana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想：“经过DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆基因”。PCR技术简史1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应。二、PCR的实现1993年诺贝尔化学奖

KarymullisandMichaelSmithMullis最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段，其缺点是：①Klenow酶不耐高温，90℃会变性失活，每次循环都要重新加。②引物链延伸反应在37℃下进行，容易发生模板和引物之间的碱基错配，其PCR产物特异性较差，合成的DNA片段不均一。这使得PCR技术在一段时间内没能引起生物医学界的足够重视。三、PCR的改进与完善1988年Saiki等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(thermusaquaticus)中提取到一种耐热DNA聚合酶。此酶具有以下特点：①耐高温:在93℃下反应2h后其残留活性是原来的60%。热变性时不会被钝化。②大大提高了扩增片段特异性及扩增效率和灵敏性。此酶命名为TaqDNA多聚酶(TaqDNAPolymerase)。PCR类似于DNA的天然复制过程-半保留复制，由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：PCR的基本反应步骤（一）模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链解离，使之成为单链。（二）引物的退火：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；（三）引物的延伸：TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补链。DNAamplificationbythePCRFirstcycleSecondcycleThirdcyclePCR的反应动力学y:产物分子数x：起始分子数e：扩增效率n：循环次数1、模板PCR的几个要素2.引物3.TaqDNA聚合酶4.dNTPs5.Mg2＋浓度Fig.AgarosegelelectrophoresisofPCRproductsfromtheintestinalcontentsofchickens.SalmonellaentericaserovarEnteritidisSense：5′-GCAGACATTATCAGTCTTCATG-3′Antisense:5′-TCAGGTTCGTGCCATTGTCAA-3′351bpFig.1

ResultofPCR-SSPtypingforHLA-B27gene

M.marker；N.neg.control；Lanes1-7.positiveresultsofB27byPCR-SSP;Lane8:negativeB27sample

1、变性温度与时间变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。一般情况下，93℃～94℃lmin足以使模板DNA变性，若低于93℃则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。PCR反应条件的选择PCR反应条件为温度、时间和循环次数。对于富含GC的序列,可适当提高变性温度.Tm值=4(G+C)＋2(A+T)退火温度=Tm值-(5～10℃)在Tm值允许范围内，选择较高的退火温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。2、退火温度与时间退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。退火时间一般为30～60sec。延伸反应通常为72℃,实际上,引物延伸在退火时即已开始。延伸反应时间的长短取决于目的序列的长度和浓度.在一般反应体系中,TaqDNA聚合酶每分钟约可合成1kb长的DNA。延伸时间过长会导致产物非特异性增加。一般在扩增反应完成后,都需要一步较长时间(10min)的延伸反应,以获得尽可能完整的产物,这对以后进行克隆或测序反应尤为重要。3.延伸：4.循环次数：N＝No(1+e)n当其它参数确定之后,循环次数主要取决于DNA浓度。通常经25-30轮循环扩增后,反应中TaqDNA聚合酶已经不足。循环次数过多,会使PCR产物中非特异性产物大量增加。PCR反应的最大特点是具有较大扩增能力与极高的灵敏性。1、污染原因(一)标本间交叉污染:(二)PCR试剂的污染:主要是由于在PCR试剂配制过程中，由于加样枪、容器、双蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染.如何做好PCR(三)实验室中克隆质粒的污染:在分子生物学实验室及某些用克隆质粒做阳性对照的检验室，这个问题也比较常见。1）阳性对照:它是PCR反应是否成功、产物条带位置及大小是否合乎理论要求的一个重要的参考标志.2、污染的监测2）阴性对照:每次PCR实验务必做阴性对照.

在PCR试剂中不加模板DNA，进行PCR

扩增，以监测试剂是否污染.3）重复性试验4）选择不同区域的引物进行PCR扩增(一)合理分隔实验室:①标本处理区;②PCR反应液制备区;③PCR循环扩增区;④PCR产物鉴定区.(二)预混和分装PCR试剂3、防止污染的方法(三)防止操作人员污染(四)操作多份样品时，制备反应混合液，先将dNTP、缓冲液、引物和酶混合好，然后分装，最后加入反应模板。父A1B35A2B31A2B40A10B16母A1B３1A2B35怀疑者2A10B16A1B35儿父母儿怀疑者1怀疑者2HLA-A1、22、101、102、91、2HLA-B31、3516、4016、355、5131、35HLA与亲子鉴定和法医学法医学(亲子鉴定)上的应用子女从父亲和母亲各得到一条单元型HLA是每人的生物学身份证使用巢式引物进行连续多轮扩增可以提高特异性和灵敏度。第一轮是15到20个循环的标准扩增。将一小部分起始扩增产物稀释100到1000倍加入到第二轮扩增中进行15到20个循环。在第二轮扩增中使用一套巢式引物，其可以同第一套引物内侧的靶序列结合。巢式PCR的使用降低了扩增多个靶位点的可能性，因为同两套引物都互补的靶序列很少。

1.巢式PCR(Nested

PCR)常见PCR类型2.实时定量PCR技术(RealtimeQuantitativePCR)

实时荧光定量PCR原理实时荧光定量PCR的几种方法介绍实时荧光定量PCR医学和科研中的应用实时定量PCR定义

在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法介绍三个概念：扩增曲线、荧光阈值、Ct值如何对起始模板定量？通过Ct值和标准曲线对起始模板进行定量分析定量原理实时定量PCR原理

扩增曲线扩增曲线图：

横坐标：扩增循环数（Cycle）；

纵坐标：荧光强度每个循环进行一次荧光信号的收集荧光基团荧光检测元件实时定量PCR原理荧光阈值荧光信号阈值（threshold）：

前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline），即样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值真正的信号:荧光信号超过域值阈值：在扩增曲线的指数增长区域内适当位置上设定的荧光检出界限实时荧光定量PCR原理Ct值Ct值的定义：

PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数C(t)value横轴：PCR反映循环数纵轴：荧光信号量Ct值的特点：相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定；

Ct值则极具重现性标准样品与内参相对定量中的内标内标通常是β-actin、GAPDH基因等看家基因在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定，受环境因素影响小内标定量结果代表了样本中所含细胞或基因组数量绝对定量的标准样品：已知拷贝数的质粒DNA和体外转入的RNA定量PCR仪光学原理非特异性荧光标记：

1、SYBRGreen特异性荧光标记：

2、TaqMan3、MolecularBeacon4、Amplisensor实时荧光定量PCR的几种方法介绍QQRSYBRGreen法SYBRGreen工作机理SYBRGreen能结合到双链DNA的小沟部位SYBRGreen只有和双链DNA结合后才发荧光变性时，DNA双链分开，无荧光复性和延伸时，形成双链DNA，SYBRGreen发荧光，在此阶段采集荧光信号。SYBRGreen5’3’5’3’SGNoEmissionSGSGSGExcitationSGSGSGSGSGSGSG5’3’5’3’EmissionExcitation荧光染料嵌合法(SYBRGreenI)作用机理示意图SYBRGreen法优缺点

对DNA模板没有选择性

适用于任何DNA

使用方便

不必设计复杂探针非常灵敏便宜优点

容易与非特异性双链DNA结合，产生假阳性但可以通过融解曲线的分析，优化反应条件对引物特异性要求较高缺点与目标序列互补TaqMan法TaqMan水解型杂交探针5′端标记有报告基团(Reporter,R)，如FAM、VIC等

3′端标记有荧光淬灭基团(Quencher,Q)

探针完整，R所发射的荧光能量被Q基团吸收，无荧光，R与Q分开，发荧光

Taq酶有5′→3′外切核酸酶活性，可水解探针TaqMan法工作原理每扩增一条DNA分子，释放一个荧光信号，可以在循环过程中任一点检测荧光TaqMan法优缺点

对目标序列的高特异性

阴性结果确定设计相对简单

与目标序列某一区域互补重复性比较好优点

只适合一个特定的目标委托公司标记，价格较高不易找到本底低的探针缺点以前对PCR引物的选择、PCR试剂的优化经验不足，Probe法较为广用。但是・・・RealTime已经是SYBRGreenI法的时代设计合适的引物，使用SYBRGreenI将会更加便宜，更为方便，并拥有良好的特异性。数据分析分析结果：HBVDNA的精确copy数为3.7X105实用例子：检测血液中的HBV1.琼脂糖凝胶电泳第三节电泳技术技术原理电泳是分离和纯化DNA片段的最常用技术琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，沸水中溶解，45℃开始形成多孔性刚性滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度DNA分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同的DNA，分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带琼脂糖凝胶电泳法分离DNA，是利用分子筛效应，迁移速度与分子量的对数值成反比关系可依据DNA分子的大小使其分离M1234PCR产物的琼脂糖凝胶电泳实验的步骤电泳前准备制胶上样电泳染色成像琼脂糖电泳的用途判断扩增片断的大小回收扩增片断用于转印进行Southern印迹问题

·

如何获得清晰的琼脂糖电泳照片呢？·琼脂糖电泳结果的影响因素凝胶电泳液电压检测手段琼脂糖凝胶浓度的选择1、核酸分子大小与琼脂糖浓度的关系

在凝胶中，DNA片段迁移距离（迁移率）与碱基对的对数成反比。2、琼脂糖凝胶电泳分离DNA时，分子大小不宜超过20kb。3、不同大小的DNA需要用不同浓度的琼脂糖凝胶进行电泳分离。

琼脂糖浓度与DNA分离范围

琼脂糖浓度/%

0.3

0.6

0.7

0.9

1.2

1.5

2.0

线状DNA大小/kb

60-5

20-1

10-0.8

7-0.5

6-0.4

4-0.2

3-0.1电泳缓冲液DNA的泳动受到电泳缓冲液和离子浓度的影响。缺乏离子，电导率严重降低，电泳迁移率很慢；离子强度过高，电导率升高，极易产生大量的热能，最严重的结果是凝胶熔化，DNA变性常用的电泳缓冲液有TAE，TPE和TBE,其中TAE的缓冲容量最低，长时间电泳将被消耗。电泳缓冲液比较缓冲液缓冲容量迁移速度分辨率用途TAE最低最快(高10％)高分子量高高度复杂DNA混合物；超螺旋DNATBE很高较慢低分子量高价格昂贵，不常用TPE琼脂糖凝胶中DNA的检测凝胶中核酸染色方法：溴化乙锭(EB)染色法和SYBRGold染色法前者检测灵敏度低10ng，但价格便宜，常用后者检测灵敏度高20pg，但价格昂贵，不常用染料存在时，线状DNA电泳迁移率降低约15％在凝胶中没有EB时，DNA条带更为清晰，当需要知道DNA片断的准确大小时，可以在无EB情况下电泳，电泳结束后用EB染色电压琼脂糖凝胶分离大分子DNA实验条件的研究结果表明，在低浓度、低电压下，分离效果较好。随着电压的增高，电泳分辨率反而下降，对于大分子DAN片断。电场强度不宜高于5V/cm。但对于小片断的DNA可以5-20V/cm电压电泳凝胶制备的注意事项1、配胶和电泳需要使用同一批次的缓冲液（一些限制酶缓冲液含有高浓度盐，能减慢DNA的迁移，并可使临近孔泳带变斜）2、琼脂糖要彻底熔化，时间不宜过长3、EB含量要适当4、凝胶应存放在阴凉处，再次用时加入少量电泳液，再熔化5、检查梳子6、拔取梳子时应均匀用力，检查凝胶孔的整齐度7、凝胶稍厚些，避免样品溢出电泳时间PCR产物，应该在24h之内电泳电泳时间不易过长，对于长片断影响不大，但对小片断DNA影响明显电泳期间，EB向阴极迁移，与DNA迁移方向相反，长时间电泳将导致凝胶中EB含量显著较少，小片断DNA检测发生困难电泳上样量中号梳子：8—10ul小号梳子：6—8ul上样注意事项：

1、加样时应悬空

2、加样尽可能快

3、不必每一个样品用一个吸头

4、上样量中DNA含量过高，容易产生“弯月亮”2.聚丙烯酰胺凝胶电泳

PolyacrylamideGelElectrophoresis，PAGE

一、PAG的组成PAG是由丙烯酰胺（acrylamide，Acr）单体和N，N’-亚甲双丙烯酰胺（N，N，N’，N’-methylenebixacrylamide，Bis）交联剂通过自由基聚合而成的一种多孔三维网状结构。Acr+Bis

多孔三维网状结构（1）丙烯酰胺结构式（2）亚甲双丙烯酰胺

二、PAG的聚合

需要催化剂——氧化还原系统作用，使Acr单体带有游离基，从而与Bis进行聚合。

化学聚合：AP-TEMED系统过硫酸胺[(NH4)2S2O8]（Ammoniumpersulfate，AP）作为催化剂，四甲基乙二胺（TEMED）为加速剂。

AP在水溶液中能产生游离基SO42-，使丙烯酰胺单体的双键打开，活化形成自由基丙烯酰胺，然后游离Acr和Bis作用就能聚合形成凝胶。TEMED的游离碱基能促进AP的形成SO42-。

三、PAG的浓度与孔径的关系

PAG孔径的大小主要由Acr和Bis这两种单体的浓度决定。可以根据要分离物质分子的大小，选择合适的单体浓度。Acr/Bis：20~40完全透明且有弹性；＜10很脆，易碎，不透明；＞100糊状不成形，易破碎。

凝胶总浓度T——100ml凝胶溶液中含有Acr和Bis的总克数。T=（a+b）/m×100%T越大，凝胶孔径越小，适用于分离分子量较小的物质。T越小，凝胶孔径越大，适用于分离分子量较大的物质。C——Bis占单体与交联剂总量的百分比。C=b/（a+b）×100%当T固定时，Bis浓度在5%时孔径最小。

四、不连续PAGE按具体操作分垂直板形电泳圆盘电泳按凝胶系统的均匀性分连续PAGE

不连续PAGE

Disc

成分作用样品胶T=3%C=20%单体欲分离的样品溶液pH6.7Tris-HCl缓冲液混在一起，用光聚合方法聚合而成的大孔凝胶有防对流作用电极槽缓冲液通常为pH8.3Tris-甘氨酸缓冲液

Disc成分作用浓缩胶除不加样品外，其余组成成分同样品胶相同样品在此胶中被浓缩

Disc成分作用分离胶T=7%C=2.5%单体溶液pH8.9Tris-HCl缓冲液化学聚合法聚合成小孔胶主要的电泳分离部分

分离原理1.浓缩效应1）凝胶层的不连续性两层凝胶T与C不同孔径不同浓缩胶孔径大，分离胶孔径小，蛋白质在大孔径浓缩胶中移动，受阻力小，移动速度快。

2）缓冲液离子成分的不连续性甘氨酸（pI=6.0）在pH8.3带负电，朝正极移动，进入浓缩胶（pH6.7），甘氨酸解离度（）很小，有效迁移率（M）很低，移动速度较慢，称为慢离子。HCl

是强电解质，=1，Cl-有效迁移率大，移动速度快，称快离子。蛋白质（pI＜6.0）带负电荷，有效迁移率介于两者之间。

pH8.3Tris-甘氨酸缓冲液

甘氨酸HCl蛋白质样品胶浓缩胶分离胶样品低电导区

3）pH值的不连续性为了控制慢离子的解离度，从而控制其有效迁移率，必须使浓缩胶与分离胶之间pH值有所区别。

3.分子筛效应与电荷效应进入分离胶后，Gly-成为快离子分离胶只有电荷效应和分子筛效应，根据各蛋白质所带电荷不同、分子大小不同而分离

五、PAGE的特点

1.具有分子筛效应，分辨率高2.样品不易扩散，用量少，灵敏度可达10-6g3.化学性质稳定，分子结构中富含酰胺基具有稳定的亲水基团4.凝胶不带电荷，消除了电渗现象5.机械强度好，有弹性，在一定浓度范围内无色透明6.网孔可调节分子杂交技术第四节分子杂交技术这种方法已成为遗传学和分子生物学等生命学科中最为普遍和重要的方法之一。分子杂交（molecularhybridization）是用一个DNA单链或RNA单链与另一被测DNA单链形成双链，以测定某特异序列是否存在。DNAExampleFirststrandGGGTTTAAACCCSecondstrandCCCAAATTTGGG（一）SouthernBlot该技术是1975年英国爱丁堡大学的E.M.Southern首创的，Southern印迹杂交故因此而得名。

将待检测的DNA分子用/不用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应。如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。原理：一是将待测定核酸分子通过一定的方法转移并结合到一定的固相支持物（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上，即印迹（blotting）;二是固定于膜上的核酸同位素标记的探针在一定的温度和离子强度下退火，即分子杂交过程。主要过程：操作步骤：1,DNA

2,琼脂糖电泳3,NaOH变性

4,印迹转移5,预杂交

6,杂交（变性探针）

7,洗膜8,显影或显色*DNA大于10kb时，

Hcl加水分解Nucleicacidshaveanetnegativechargeandwillmovefromthelefttotheright.Thelargermoleculesareheldupwhilethesmalleronesmovefaster.Thisresultsinaseparationbysize.2,琼脂糖电泳3，变性1.5MNaOH处理30min溴酚蓝(BPB)4，印迹转移凝胶中的DNA变性后，经毛细管的虹吸作用，转移到硝酸纤维膜上。A,毛细管转移法（0.4MNaOH）B,电转移法为使核甘酸固定在膜上，传统的方法是将膜置于真空烘箱中80℃烘2小时。在紫外交联仪上仅需在254nm紫外光下照射几秒钟即可。用无关的单链DNA，如小牛胸腺DNA和鲑鱼精子DNA吸附到膜上的空白处，称预杂交，防止探针被吸附在背景上。5，预杂交Basepairingindicates

thegeneofinterest6,杂交（变性探针）双链DNA探针提前100℃变性10min后迅速冰浴，单链探针无需变性。将处理后的探针加入杂交液温浴至杂交温度。应用寡核苷酸探针时，杂交温度的选择。Tm＝4╳(G+C)+2╳(A+T),杂交温度比Tm低约10℃。杂交探针是由Southernblot衍生而来。方法是将某种生物的总DNA直接点滴在尼龙膜上，后将膜变性处理，预杂交后，经中和、洗脱、干燥,进行放射自显影，观察结果。这种方法是用来初步探测某种生物中含有一种特殊的基因或序列。来分析DNA样品之间的同源性。此法因有假阳性的存在，所以发现阳性斑后还要进一步做Southernblotting加以验证。(二)斑点杂交（dotblotting）（三）NorthernBlot

Alwine,D.J.（1977）姓不是“Northern”，因“Southern”意为“南方”，故戏称他们的分析方法为“北方”（northern）杂交。northern杂交与Southern杂交主要的不同之处在于检验物是RNA，而不是DNA。原理：在变性条件下将待检的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，继而按照同SouthernBlot相同的原理进行转膜和用探针进行杂交检测。用途：检测样品中是否含有基因的转录产物（mRNA）及其含量。

操作过程mRNA提取甲醛变性电泳印迹转移预杂交杂交（变性探针）洗膜显影或化学发光（四）Westernblot

对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法。流程图WesternBlotWesternBlot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜或PVDF膜--聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidenefluoride）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。Westernblot特点蛋白质的Western印迹技术结合了凝胶电泳的高分辨率和固相免疫测定的特异敏感等多种特点，可检测到低至1～5ng（最低可到10－100pg）中等大小的靶蛋白。wb的应用目的蛋白的表达特性分析目的蛋白与其它蛋白的互作目的蛋白的组织定位目的蛋白的表达量分析Westernblot流程转膜戴手套，避免用手接触滤纸、凝胶和膜，因为手上的油脂会阻断转印。滤纸和膜的尺寸与凝胶大小一致以适量的转移Buffer室温平衡滤纸、凝胶和膜15－30min，如果是PVDF膜，必须先用甲醇激活后浸泡。方向正确：凝胶在阴极，膜在阳极排去滤纸、胶和膜间的气泡。电转时间：100V1-2h,可根据蛋白分子量的大小灵活选择转移结束后，凝胶用考马氏亮兰染色以确定转移效率膜用丽春红染色观察蛋白分子量标准的位置电泳常用SDS：单一亚基组成的蛋白质非变性PAGE：多个不同亚基组成的蛋白质Tris-Tricine胶中电泳：用于分子量小于10kDa的多肽和蛋白的电泳，能够获得较好的分离效果。聚丙烯酰胺具有神经毒性，操作时要戴手套封闭用5％脱脂奶粉或3％BSA（含0.1％Tween20TBS或PBS配制）时间：室温2h或4ºC过夜显色显色辣根过氧化物酶：底物为DAB碱性磷酸酶：底物为BCIP/NBT化学发光显影最常用。辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶有不同的发光底物（商品化产品）注意：化学发光前将膜用不含Tween20的TBS或PBS洗涤一次曝光的时间和显影的时间根据实际情况而定免疫荧光技术

Immunofluorescencetechnique第五节DNA-蛋白质技术蛋白质定位研究技术荧光（fluorescence）

荧光物质吸收激发光的能量后，电子从基态跃迁到激发态，当其回复至基态时，以发射光形式释放出能量，称为荧光。

一、荧光的基本知识发射光谱和激发光谱发射光谱是指固定激发波长，在不同波长下记录的样品发射荧光的强度。激发光谱是指固定检测发射波长，用不同波长的激发光激发样品记录的相应的荧光发射强度。

荧光效率定义:荧光物质分子将光能转变成荧光的百分率计算公式:

荧光效率=

荧光寿命定义:荧光物质被激发后所产生的荧光衰减到一定程度时所用的时间。各种荧光物质的荧光寿命不同。

荧光淬灭定义:荧光物质在某些理化因素作用下，发射荧光减弱甚至消退称为荧光淬灭。如紫外线照射、高（≥20℃）、苯胺、酚、硝基苯、I-等。荧光物质最大吸收光谱最大发射光谱应用异硫氰酸荧光素(FITC)490～495nm520～530nm（黄绿色）FAT、荧光偏振免疫测定四乙基罗丹明(RB200)570～575nm595～600nm（橙红色）FITC的衬比染色或双标记FAT四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)550nm620nm（橙红色）FITC的衬比染色或双标记FAT藻红蛋白（PE）490-560nm595nm（红色）双标记FAT、流式细胞术7-氨基-4-甲基香豆素354nm430nm（蓝色）双标记或多标记FATEu3+螯合物340nm613nm时间分辨荧光免疫测定荧光物质是一类能吸收激发光的光能而发射荧光的物质。

常用的荧光物质二、荧光物质荧光抗体技术的基本原理

荧光素标记抗体与切片中组织细胞抗原反应，洗涤分离后荧光显微镜观察呈现特异荧光的抗原抗体复合物及其部位，对组织细胞抗原进行定性和定位检测，或对自身抗体进行定性和滴度测定。荧光抗体技术的内容

荧光抗体制备标本制作荧光抗体染色荧光显微镜检查抗体要求

高特异性高亲和力经纯化提取IgG

荧光抗体的制备有能与蛋白质形成共价健的化学基团，与蛋白质结合后不易解离，而未结合的色素及其降解产物易于清除。荧光效率高，与蛋白质结合后，仍保持较高的荧光效率。荧光色泽与背景组织的色泽对比鲜明。与蛋白质结合后不影响蛋白质原有的生化与免疫性质。标记方法简单、安全无毒。与蛋白质的结合物稳定，易于保存。荧光素要求抗体的荧光素标记标记原理:利用抗体蛋白的自由氨基与FITC的异硫氰基在碱性溶液中形成硫碳酰胺键，使抗体与FITC结合成荧光抗体。标记方法:

搅拌法：适于标记体积较大、蛋白含量较高的抗体。标记时间短，荧光素用量少，但有非特异性染色。透析法：适于标记样品量少，蛋白含量低的抗体。标记比较匀，非特异染色较低。去除游离荧光素及其降解产物：透析或凝胶过滤去除荧光素未结合和结合过度的抗体：阴离子交换层析法去除交叉反应或非期望抗体：动物肝粉吸收或固相抗原吸收荧光抗体的纯化荧光素与蛋白结合率：

F/P=抗体效价：双向免疫扩散试验抗体特异性：吸收试验、抑制试验抗体抗体特异性染色滴度：倍比稀释荧光抗体的鉴定直接法直接荧光抗体染色法示意图荧光素标记的特异性抗体直接与相应抗原反应。荧光抗体染色及结果判断间接法特异性抗体与相应抗原反应，荧光素标记的抗抗体再与第一抗体结合。

间接荧光抗体染色法示意图双标记法

两种荧光素分别标记的两种不同的特异性抗体，与同一标本反应，荧光显微镜观察两种颜色荧光。

设立实验对照:阳性对照和阴性对照区分特异和非特异染色阳性细胞显色分布:胞质型、胞核型和膜表面型荧光抗体染色结果判断

“-”：无或仅见极微弱荧光。

“+”：荧光较弱但清楚可见。

“++”：荧光明亮。

“+++”：耀眼强荧光。特异荧光强度“++”以上判定为阳性，对照光应呈“-”或“±”。根据呈"++"的血清最高稀释度判定特异性抗体效价。

荧光抗体染色结果判断荧光显微镜

利用一定波长的激发光对样品进行激发，产生一定波长的荧光，对样品结构或其组分进行定性、定位、定量观察检测。

三.荧光显微镜的基本结构光源：高压汞灯、氙灯或卤素灯滤光片：隔热、激发和吸收滤光片光路：透射光、落射光聚光器：明视野、暗视野和相差荧光聚光器镜头：消色差镜头

荧光显微镜隔热滤光片：阻断红外线通过而隔热。激发滤光片：位于光源和物镜之间，能选择性地透过紫外线可见波长的光域，提供合适的激发光。

吸收滤光片：位于物镜和目镜之间，阻断激发光而使发射的荧光透过，保护眼睛。荧光显微镜滤光片透射光：照明光线从标本下经聚光器透过标本进入物镜。落射光：照明光线从标本上经垂直照明器落射到标本，经标本反射进入物镜。透射荧光显微镜光路(a)落射荧光显微镜光路(b)荧光显微镜光路①自身抗体检测抗核抗体(均质型)抗核抗体(核膜型)抗核抗体(斑点型)四、荧光抗体技术的应用②病原体检测寄生虫（猴胚肾细胞内弓形虫）细菌（藤黄微球菌)③免疫病理检测肿瘤（人肝癌细胞）④细胞表面抗原和受体检测将游离细胞作荧光抗体特异染色后，在特殊设计的仪器中通过喷嘴逐个流出，经单色激光照射发出的荧光信号由荧光检测计检测，并自动处理各种数据。

⑤特殊应用：流式细胞分析荧光免疫技术可用于淋巴细胞表面CD抗原、抗原受体、补体受体、Fc受体等的检测以及淋巴细胞及其亚群的鉴定和计数。

凝胶阻滞GelshiftDNA-蛋白质相互作用研究技术

凝胶阻滞分析（GelshiftAssay）,该方法用来研究DNA与特异性蛋白的相互作用，通常是放射性标记的DNA片段与纯化蛋白，或提取物中的蛋白混合物相结合，然后在非变性凝胶中分析该产物。与游离DNA相比，蛋白-DNA复合物的迁移率将降低，因此，与游离DNA相对应，人们将观察到带中的“阻滞”。

该方法在共价交联有目的DNA序列的寡核苷酸多联体的柱层析树脂中进行。这种技术称为序列特异性DNA亲和层析。DNA亲和层析方法与常规的层析方法相似，但往往使用大量的蛋白质使层析柱超载，这样可以增加DNA亲和层析的成功率。电泳后，用刀片将凝胶上相关泳道切成多个凝胶块。每个凝胶块中的蛋白质通过在合适的缓冲液中浸泡，进行变性，并从聚丙烯酰胺中洗脱。洗脱后通过变性液逐级稀释成非变性缓冲液，使蛋白质复性，或者在非变性缓冲液中透析。Figure7-29.Agel-mobilityshiftassay.Theprincipleoftheassayisshownschematicallyin(A).Inthisexampleanextractofanantibody-producingcelllineismixedwitharadioactiveDNAfragmentcontainingabout160nucleotidesofaregulatoryDNAsequencefromageneencodingthelightchainoftheantibodymadebythecellline.TheeffectoftheproteinsintheextractonthemobilityoftheDNAfragmentisanalyzedbypolyacrylamide-gelelectrophoresisfollowedbyautoradiography.ThefreeDNAfragmentsmigraterapidlytothebottomofthegel,whilethosefragmentsboundtoproteinsareretarded;thefindingofsixretardedbandssuggeststhattheextractcontainssixdifferentsequence-specificDNA-bindingproteins(indicatedasC1–C6)thatbindtothisDNAsequence.(Forsimplicity,anyDNAfragmentswithmorethanoneproteinboundhavebeenomittedfromthefigure.)In(B)theextractwasfractionatedbyastandardchromatographictechnique(top),andeachfractionwasmixedwiththeradioactiveDNAfragment,appliedtoonelaneofapolyacrylamidegel,andanalyzedasin(A).(B,modifiedfromC.Scheidereit,A.Heguy,andR.G.Roeder,Cell51:783–793,1987.)Figure7-30.DNAaffinitychromatography.Inthefirststep,alltheproteinsthatcanbindDNAareseparatedfromtheremainderofthecellularproteinsonacolumncontainingahugenumberofdifferentDNAsequences.Mostsequence-specificDNA-bindingproteinshaveaweak(nonspecific)affinityforbulkDNAandarethereforeretainedonthecolumn.Thisaffinityisduelargelytoionicattractions,andtheproteinscanbewashedofftheDNAbyasolutionthatcontainsamoderateconcentrationofsalt.Inthesecondstep,themixtureofDNA-bindingproteinsispassedthroughacolumnthatcontainsonlyDNAofaparticularsequence.Typically,alltheDNA-bindingproteinswillsticktothecolumn,thegreatmajoritybynonspecificinteractions.Theseareagainelutedbysolutionsofmoderatesaltconcentration,leavingonthecolumnonlythoseproteins(typicallyoneoronlyafew)thatbindspecificallyandthereforeverytightlytotheparticularDNAsequence.Theseremainingproteinscanbeelutedfromthecolumnbysolutionscontainingaveryhighconcentrationofsalt.

免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，Co-IP）蛋白质-蛋白质相互作用研究技术一实验原理以（抗体和抗原）之间的专一性作用为基础的用于研究（蛋白质相互作用）的经典方法。是确定两种蛋白质在完整（细胞内生理性）相互作用的有效方法。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。

问题：细胞怎样保持生理状态-不变性？Y-X-抗XCO-IP应用与IP区别测定两种目标蛋白质是否在体内结合确定一种特定蛋白质的新的作用搭档CO-IP与IP只取决于检测焦点是初级靶分子（抗原）还是次级靶分子（相互作用蛋白）实验基本原理1.提取蛋白2.在细胞裂解液中加入抗X的抗体3.孵育后再加入ProteinA或G(于Agarosebead上)若细胞中有与兴趣蛋白结合的目的蛋白，就可以形成复合物：“Y—X—抗X抗体—ProteinA或G"3.经变性、聚丙烯酰胺凝胶电泳，复合物又被分开。（xy抗原、x抗体）proteinA/G有一个很重要的特性就是能与抗体的Fc段结合