第八章工业微生物代谢控制育种

第七章工业微生物代谢控制育种代谢控制发酵

以生化和遗传学为基础，研究代谢产物的生物合成途径和代谢调节的机制，选择巧妙的技术路线，通过遗传育种技术获得解除或绕过了微生物正常代谢途径的突变株，从而人为地使有用产物选择性地大量合成或累积。如氨基酸、核苷酸及某些次级代谢产物。

工业生产中的流水线技术，就是选择巧妙的技术路线，环环相扣，使得产品的生产效率达到最大。第一节概论

代谢控制育种则是要获得代谢调节机制不完善的高产菌株。

新陈代谢（metabolism）简称代谢，泛指发生在活细胞中的各种分解代谢（catabolism）和合成代谢

(anabolism)的总和。分解代谢酶系复杂分子（有机物）简单分子+ATP

+[H]合成代谢酶系

一、初级代谢和初级代谢产物1.分解代谢体系：糖、脂、蛋白质

2.素材性生物合成体系：氨基酸、核苷酸

3.结构性生物合成体系：蛋白质、核酸、多糖、类脂二、次级代谢和次级代谢产物

次级代谢产物是对产生它们的生物本身不需要的一种产物。如抗生素、生长刺激素、生物碱、色素、毒素以及甾体。三、初级代谢与次级代谢的关系1.从生化代谢方面：葡萄糖碳架掺入途径；莽草酸途径；与核苷有关的途径；聚酮体和聚丙酸途径；由氨基酸衍生的途径；甲羟戊酸途径；其它复合途径。各代谢途径互相交错，互相影响。2.从遗传代谢观点：初级代谢受核内DNA调控；次级代谢受核内DNA和核外DNA（质粒）调控。第二节初级代谢的调节控制

微生物细胞内的所有生化反应都是在酶的催化下进行的，因此对酶的调节控制是主要的、最有效的调控方式。1.反馈阻遏：调节酶的合成量。2.反馈抑制：调节现成酶分子的催化活力。一、酶合成的调节

酶合成的调节：通过调节酶的合成量进而调节代谢速度的调节机制，这是一种在基因水平上的代谢调节。（一）酶合成调节的类型1、诱导组成酶：细胞固有的酶类，其合成是在相应的基因控制下进行，“与生俱来”。诱导酶：细胞为适应外来底物或其结构类似物而临时合成的一类酶，“后天学习”。（1）同时诱导：诱导物加入后，微生物能同时或几乎同时诱导几种酶的合成，主要存在于短的代谢途径中。（2）顺序诱导：先合成能分解底物的酶，再依次合成分解各中间代谢物的酶，以达到对复杂代谢途径的分段调节。2、阻遏

通过阻遏作用来阻碍代谢途径中包括关键酶在内的一系列酶的生物合成，从而更彻底地控制代谢和减少末端产物的合成。末端产物阻遏：由某代谢途径末端产物过量累积而引起的阻遏。分解代谢物阻遏：有两种碳源（或氮源）分解底物存在时，细胞利用快的那种分解底物会阻遏利用慢的低物的有关分解酶合成的现象。（二）酶合成调节的机制

操纵子：由启动基因（是转录的起始点）、操纵基因（决定结构基因的转录是否能进行）和结构基因（转录翻译出相应的酶）组成。

调节蛋白分为阻遏物（能在没有诱导物时与操纵基因相结合）和阻遏物蛋白（只能在辅阻遏物存在时才能与操纵基因相结合）。

诱导型操纵子（乳糖操纵子）阻遏型操纵子（色氨酸操纵子）乳糖操纵子色氨酸操纵子二、酶活性的调节前体激活：后面的反应被前面的中间产物所促进。反馈抑制：末端代谢产物过量抑制前面的酶活性。（一）反馈抑制的类型1、直线式代谢途径中的反馈抑制

2、分支代谢途径中的反馈抑制(1)协同反馈抑制(2)累积反馈抑制(3)增效反馈抑制(4)顺序反馈抑制(5)同工酶调节（二）反馈抑制的机制

受反馈抑制的调节酶一般都是变构酶，有两个活性中心：催化中心调节中心变构效应(协同效应)效应物＋调节中心→构象变化→阻碍酶与底物结合

→酶活变化。三、反馈阻遏与反馈抑制的比较反馈抑制是通过调节变构酶的活力得以实现，因为不涉及蛋白质的合成过程，调节的效果比较直接而快速。反馈阻遏是对酶合成的阻遏，是基因转录水平上的代谢调节，效果不及反馈抑制那样迅速。

第三节次级代谢的调节控制次级代谢产物的生物合成途径中，反馈调节作用包括：1.次级代谢产物本身积累就能反馈调节作用；2.初级代谢产物作为次级代谢产物合成的前体，当其受到反馈调节时，必然会影响次级代谢产物的合成。使调节机制失效，可以提高次级代谢产物产量。次级代谢产物产生菌的代谢和合成包括初级代谢（菌体生长期）和次级代谢阶段（合成抗生素的产生期）。次级代谢产物合成酶在生长期受阻遏。一、次级代谢产物的诱导调节

诱导物→刺激影响初级代谢造成代谢流的改变→大量生成次生代谢物

诱导物→次生代谢物合成酶的合成→大量生产次生代谢物如：色氨酸诱导刺激麦角碱的产生蛋氨酸对头孢霉素C的产量提高作用二、次级代谢产物碳源分解调节

例如：顶头孢霉发酵产头孢菌C时利用不同的主碳源速度产率为蔗糖＞半乳糖＞果糖＞麦芽糖＞葡萄糖抗生素受碳源分解调节的可能机制：第一，可能与菌体生长速率控制抗生素合成有关。第二，可能与分解代谢产物的堆积浓度有关。三、次级代谢产物氮源分解调节

含氮底物的酶的合成受快速利用的氮源，尤其使氨的阻遏。机制：NH4+影响pH值和电化学的质子梯度，改变能量代谢，影响细胞壁物质和膜的结构功能等。（一）次级代谢自身产物的反馈调节

抗生素对自身产物的抑制有一定的规律：抑制特定产生菌合成抗生素所需浓度与生产水平具相关性，一般产生菌产量高，对自身抗生素的耐受力强，反之越敏感。

如青霉素产生菌完全由抑制需要的外源青霉素浓度：高产菌株：15μg/mL

中产菌株：2μg/mL

低产菌株：0.2μg/mL

四、次级代谢反馈调节（二）分支代谢中初级代谢物的反馈调节对次级代谢的影响

第一种方式：

次级途径和初级途径具有共同的分叉中间体，由分叉中间体产生的初级代谢终产物的反馈调节可能影响次级代谢产物的形成。

第二种方式：

在次级代谢产物生物合成途径中，初级代谢的终产物作为前体合成次生产物。五、磷酸盐的调节

过量则促进菌体生长，但是抑制抗生素合成；

亚适量：控制在适合菌体生长的浓度以下。

调节机制：直接作用和间接效应。六、细胞膜透性的调节胞内产物分泌到胞外；胞外营养物质进入胞内。例如：青霉素发酵中，产生菌细胞膜输入硫化物能力的高低是影响青霉素发酵单位高低的一个因素。第四节代谢调节控制育种

代谢控制育种：通过定向选育某种特定的突变型，改变代谢通路、降低支路代谢终产物的产生或切断支路代谢途径及提高细胞膜的透性，以达到大量积累有益产物的目的。一、组成型突变株的选育

代谢控制发酵：通过培养条件来解除反馈调节而使生物合成的途径朝着需要的方向进行。

代谢控制育种：通过定向选育某种特定的突变型，以达到大量大量积累有益产物的目的。操纵基因或调节基因突变引起酶合成诱导机制失灵，菌株不经诱导也能合成酶、或不受终产物阻遏的调节突变型。乳糖操纵子筛选方法及实例：1、限量诱导物恒化培养将菌种诱变后移接到低浓度诱导物的衡化器中连续培养。如：大肠杆菌在恒化器中培养，限量补充乳糖，选育出不需要乳糖就可以大量产生β-半乳糖苷酶的组成性突变株。2、循环培养

在含诱导物和不含诱导物的培养基上交替连续循环培养。例如，先用含葡萄糖的培养基培养诱变过的大肠杆菌，稀然后将此培养物转移到含乳糖的培养基中，重复这个过程，最终组成性的突变株就会占优势而被选出来。3、鉴别性培养基的利用

以甘油为唯一碳源，菌落上喷O-硝基苯酚-β-D-半乳糖苷（ONPG），通过显示来判断半乳糖苷组成型突变株。4、筛选

用诱导能力低，但能作为良好碳源的诱导物的培养基上培养，突变体良好生长，野生型不能生长。如利用苯-β-半乳糖苷酶组成型突变株。二、抗分解调节突变株的选育

抗分解调节突变就是指抗分解阻遏和抗分解抑制的突变。其实就是筛选合成酶的产生不受碳、氮、磷的代谢阻遏或抑制的突变株，使抗生素提前到菌体生长期开始合成，从而延长了产抗期而提高产量。

（一）解除碳源调节突变株的选育1、循环培养法：快速利用和慢速利用的碳源交替培养例如，先用含快速利用（如葡萄糖）的培养基培养诱变过的大肠杆菌，稀释后将此培养物转移到慢速利用（如蔗糖）的培养基中，重复这个过程，最终抗分解调节的突变株就会占优势而被选出来。2、鉴别性培养基：菌落上喷O-硝基苯酚-β-D-半乳糖苷（ONPG），显色筛选半乳糖苷酶解除碳源调节的突变株。3、特殊氮源：用葡萄糖为碳源，受阻遏酶的底物为惟一氮源配制成培养基。4、葡萄糖结构类似物

如2-脱氧葡萄糖（2-dG）和3-O-甲基葡萄糖（3-mG），不被微生物利用，不被代谢，但可以阻遏诱导酶的合成。筛选方法：低浓度葡萄糖类似物及一种生长碳源。抗性突变株的性质：抗分解阻遏突变型。（二）解除氮源分解调节突变株的选育（三）解除磷酸盐调节突变株的选育1、磷酸盐对次生产物的调节机制通过初级代谢的变化影响次级代谢；可以加强初级代谢，或者改变糖类的分解代谢途径，或者限制抗生素合成的诱导物。发酵中，添加浓度要控制在亚适量水平。2、抗磷酸突变株的筛选方法

含氮底物的酶受到快速利用的氮源阻遏，铵盐和其他快速利用的氮源对抗生素的生物合成具有分解调节作用。2、抗磷酸突变株的筛选方法

Martin建立的一种直观的筛选磷酸盐抑制脱敏突变体的方法：三、营养缺陷型在代谢调节育种中的应用

缺陷型菌株常常会使发生障碍的前一步的中间代谢产物得到累积。（一）在初级代谢调节育种中的应用利用营养缺陷型来阻断代谢流向或切断支路代谢，使代谢朝着有益产物合成方向进行。也可以通过营养缺陷型解除协同反馈效应，降低终产物的数量，以累积支路代谢中某一末端产物。1、在直线式生物合成途径中2、在分支式生物合成途径中（二）在次级代谢调节育种中的应用如：四环素、制霉素产生菌的脂肪酸缺陷型可增加相应抗生素的发酵单位。四、渗漏缺陷型在代谢调节育种中的应用

渗漏缺陷型是遗传代谢障碍不完全的突变株。其特点是酶活力下降而不完全丧失，并能在基本培养基上少量生长。可以利用渗漏缺陷型能少量地合成代谢终产物，又不造成反馈抑制的现象。五、抗反馈调节突变株的选育

这是一种解除合成代谢反馈调节机制的突变型菌株。

特点：所需产物不断积累，不会因其浓度超量而终止生产。抗反馈突变型；结构基因的突变，变构酶不能与代谢终产物相结合。

抗阻遏突变型：调节基因的突变，调节蛋白不能和代谢终产物结合。（一）回复突变引起的抗反馈调节突变株1、原因（1）原有基因的回复突变基因内部位点突变引起的逆向突变现象。

A.真正的回复突变；B.基因内抑制突变。（2）非原有基因的回复突变原突变基因邻近的基因发生突变，抑制了前一个突变基因的效应——抑制基因突变。区别方法：回交试验和杂交重组。回复突变株野生菌株突变型抑制基因回复突株野生型真正的回复突变2.回复突变引起的抗反馈调节突变株的筛选（1）初级代谢途径障碍性回复突变型回复突变在原突变点以外的位置，反馈调节变构酶的调节中心发生突变，它不能再和阻遏物结合，使有效代谢产物大量积累。如芽孢杆菌产生的蛋白酶，首先选取低产菌株获得一部分嘌呤和嘧啶缺陷型，再进一步筛选得到回复突变株，使蛋白酶的产率提高5~10倍。（2）次级代谢途径障碍性的回复突变

零变株的回复突变：突变可以发生初级代谢，也可以发生在次级代谢途径中，发生回复突变后，产量往往比原亲本株高。途径：原养型→零突变株→回复突变株

如一株不产金霉素的绿色链霉菌的缺陷型诱发回复突变为原养型菌株，金霉素的产率比亲株提高了6倍。（二）耐自身产物突变株选育

高产菌株必须具备很强的对自身产物的耐受性，要提高抗生素的发酵水平，可以选育对自身抗生素敏感性低，钝化酶活性高的菌株。选育时可以结合以下抗性菌株的筛选：

1.抗镁离子突变：提高钝化酶的活性。

2.钝化酶活性高的变株：（三）抗终产物结构类似物突变株的选育

结构类似物起共遏物作用，但不真正掺入细胞结构，是“假反馈抑制”。如果能找到适当的结构类似物，将使抗反馈抑制突变菌株的简单容易且效果明显。抗结构类似物突变株，相比于营养缺陷型突变，其代谢调节被解除，生产操作方便，产率稳定。1.直线合成途径

如抗刀豆氨酸的突变株，可以有效的积累精氨酸。2.分支途径如产肌苷酸的枯草杆菌的腺嘌呤缺陷型，选育出抗8-氮鸟嘌呤突变株，肌苷酸和鸟苷酸的产量明显提高。筛选方法：浓度梯度法实例抗苏氨酸和异亮氨酸结构类似物的突变型抗代谢类似物的筛选方法（四）累积前体和耐前体突变株的选育

用一系列浓度梯度的平板检测前体物对抗生素合成的产量影响：其一作为组成成分掺入生物合成；其二导致反馈调节；其三引起“毒性”。1、耐“毒性”前体突变株的选育2、耐前体结构类似物突变株的选育3、耐前体的有关代谢物突变株的筛选1、耐“毒性”前体突变株的选育如：灰黄霉素产生菌耐氯化物前体高产菌株的选育。2、耐前体结构类似物突变株的选育如：硝吡咯菌素产生菌耐5-氟色氨酸的前体高产菌株的选育。3、耐前体的有关代谢物突变株的筛选如：抗缬氨酸的的麦迪霉素高产菌株的选