原核蛋白表达与纯化

ThekeyofProkaryoticproteinexpressionandpurification北京全式金生物技术有限公司☏：400-898-0321原核表达概述原核表达策略选择表达结果验证常见问题与实验例上篇原核表达原核表达原理概述表达载体表达菌株表达条件原核表达概述

原核表达原理概述表达载体目的基因重组载体表达菌株“基因——载体——菌株——培养”培养，诱导构建转化表达载体启动子融合标签常用表达载体系统常见启动子

λpL启动子： 热诱导启动子

trp启动子： 化学诱导启动子

trc启动子： trp+lac杂交启动子

tac启动子： trp+lacUV5杂交启动子；

pGEX（Pharmacia）、pMal（NEB）T7/T7lac启动子： pET（Novagen）、pEASY-E1/E2（Transgen）T7启动子T7lac启动子融合标签常用于蛋白检测与纯化。有时也可增加蛋白可溶性、将蛋白运转至特定位置。N端融合： 易于构建。终止密码子来自载体/基因

表达量高

提前终止会干扰纯化

二级翻译起始不影响纯化

C端融合： 构建时注意避免移码

基因不能自带终止密码子

提前终止不影响纯化

二级翻译起始会干扰纯化常用融合标签

His·Tag

pET系统

GST·Tag

pGEX系统

MBP·Tag

pMal系统系统名称公司启动子抗性常用标签特点pGEXGE

(Pharmacia)tacAmpGST·Tag可溶性表达，纯化难以控制，谷胱甘肽一步洗脱，得到的蛋白纯度较低,通常需要去掉GST·TagpMalNEBtacAmpMBP·Tag可溶性表达，纯化难以控制，麦芽糖一步洗脱，得到的蛋白纯度较低,通常需要去掉MBP·TagpETMerck

(Novagen)T7

T7lacAmp

KanHis·Tag种类丰富。标签小，无需切割，一般来说，对蛋白活性无影响。纯化及其方便。pEASYTransgenT7lacAmpHis·Tag同pET系统常用表达载体系统表达菌株考虑因素细胞特性蛋白稳定性蛋白酶缺陷型——B型菌株，缺失lon、ompT蛋白酶

多种常用表达菌株均为此类，如BL21、Origami、Rosetta等启动子tac启动子需要大肠杆菌自身的RNA聚合酶即可：BL21

T7启动子需要能够提供T7RNA聚合酶的细胞：DE3溶源菌抗性细胞不能与载体带有相同的抗性：

pET-28a+OrigamiB(DE3) No！

pET-21b+OrigamiB(DE3) Yes！严谨调控BL21(DE3)pLysS/BL21(DE3)pLysE稀有密码子Rosetta系列溶解性Origami系列稀有密码子不同生物使用密码子存在偏爱性。某种或某几种tRNA的缺乏，会导致外源目的基因的mRNA无法正常在E.coli里表达，是为“稀有”密码子。表达条件乳糖操纵子与诱导物常用表达条件的优化乳糖操纵子与诱导物

1980年，GuaranteL等构建了以乳糖操纵子为基础的大肠杆菌表达系统

GuaranteL,RobertsTM,PtashneM.Atechniqueforexpressioneukaryoticgenesinbacteria.Science,1980,209:1428~1430

启动子Plac+操纵基因lacO+结构基因

lacI负调控：

阻遏物lacI与操纵基因lacO结合，抑制表达

IPTG：半乳糖苷类似物，结合阻遏物lacI使其失活，启动诱导表达

cAMP-CAP正调控

cAMP结合并激活CAP，起始转录，实现正调控

葡萄糖抑制腺苷酸环化酶，ATP不能转化为cAMP，无cAMP-CAP，无转录常用表达条件的优化培养基组分温度

IPTG浓度

OD值培养体积与溶氧量根据实验目的选择表达策略载体选择感受态细胞选择表达条件原核表达策略选择根据实验目的选择表达策略明确实验目的选择表达载体选择表达菌株优化表达条件实验目的 表达策略

活性分析 可溶表达制备抗原 包涵体高纯度 融合标签结构研究 天然蛋白…… ……选择表达载体系统名称公司启动子抗性常用标签特点pGEXGE

(Pharmacia)tacAmpGST·Tag可溶性表达，纯化难以控制，谷胱甘肽一步洗脱，得到的蛋白纯度较低,通常需要去掉GST·TagpMalNEBtacAmpMBP·Tag可溶性表达，纯化难以控制，麦芽糖一步洗脱，得到的蛋白纯度较低,通常需要去掉MBP·TagpETMerck

(Novagen)T7

T7lacAmp

KanHis·Tag种类丰富。标签小，无需切割，一般来说，对蛋白活性无影响。纯化及其方便。pEASYTransgenT7lacAmpHis·Tag同pET系统选择表达菌株菌株适合启动子特性BL21tac、trc……(pGEX、pMal)适用于非T7启动子的表达系统BL21(DE3)T7/T7lac(pET，pEASY)适用于T7、T7lac的表达系统，适用于非毒基因的表达BL21(DE3)pLysST7/T7lac(pET，pEASY)质粒pLysS含有表达T7溶菌酶的基因，可结合T7RNA聚合酶，降低本底表达水平。适用于严谨调控毒基因的表达Rosetta(DE3)

Transetta(DE3)

T7/T7lac(pET，pEASY)补充6种稀有密码子对应的tRNA，提高外源基因，特别是真核基因在原核系统中的表达水平OrigamiB(DE3)

TransB(DE3)T7/T7lac(pET，pEASY)具有thioredoxin

reductase/glutathionereductase双突变，有助于形成更多的二硫键，增加蛋白的可溶性。毒基因：基因表达产物——即目的蛋白，影响宿主生长（“毒性”）PageDownPageUpBL21(DE3)pLysS、BL21(DE3)pLysE利用T7溶菌酶的严谨调控机制优化表达条件葡萄糖： 抑制cAMP形成，进而抑制表达，严谨调控

无其他严谨调控手段（pLysS）且毒基因时，至关重要！温度： 影响表达速率、蛋白可溶性与活性IPTG浓度： 影响表达速率、蛋白可溶性与活性

lac透性酶(lacY1)突变使IPTG均一渗透，获得浓度依赖 的诱导：Tuner，OrigamiB，Rosetta其他因素： 菌体密度

Mg2+

培养体积与通气

……ArtMediaTMProteinExpression（AMPE）葡萄糖抑制cAMP形成，无cAMP-CAP，不能正调控乳糖操纵子，因而无法利用乳糖，使得大肠杆菌优先利用葡萄糖

AMPE中含有特定配比的葡萄糖与乳糖，利用该机理，使得葡萄糖耗尽开始摄入乳糖时，控制细菌恰好生长到适合诱导的阶段（对数期），利用乳糖代谢，启动自动诱导！无需监控菌体生长，实现自动诱导无需加入IPTG，对细菌生长无抑制细胞密度高，蛋白产量高应用于一切乳糖操纵子表达系统：pET、pGEX、pMal、pEASY……4123pET28a,30kDa1：ArtMedia

2：LB3：LB+0.2%Glucose4：SOB载体：pEASY-E1

蛋白：70kDa

菌株：Transetta(DE3)Lane1:LB培养基，对照

Lane2:LB培养基，IPTG诱导

Lane3:AM-PE自动诱导载体：pGEX-5X-3蛋白：70kDa

蛋白：30kDa

菌株：BL21Lane1:LB培养基，IPTG诱导

Lane2:AM-PE自动诱导

Lane3:LB培养基，对照123123表达定位表达结果验证溶解性信号肽活性免疫原性产量纯化难度胞内表达可溶/包涵体不需要有/无有最高≤50%蛋白种类多，需裂解菌体，复杂周质表达多为可溶需要有有较少≤4%蛋白种类少，需渗透压休克，相对容易胞外分泌完全可溶需要有有变化较大纯化简单。但机理不详，成功先例少表面展示融合膜蛋白/嵌合于膜上需要-有-适用于疫苗开发、抗体制备，前景广阔。表达定位菌液离心菌体细胞总蛋白培养基组分悬菌，渗透压休克菌体细胞周质组分悬菌，裂解，离心胞质可溶组分沉淀溶解，离心胞质不溶组分沉淀沉淀上清全菌可溶表达沉淀上清全菌包涵体常见问题与实验例无表达或表达量低蛋白不可溶蛋白纯化障碍无表达或表达量低载体-菌株搭配不当摸索最佳的组合载体启动子菌株pGEXtacBL21pMaltacBL21pETT7/T7lacBL21(DE3)BL21(DE3)pLysSRosetta(DE3)OrigamiB(DE3)pEASYT7lac同上无表达或表达量低稀有密码子影响： 翻译终止，移码突变，氨基酸序列错误，表达量低或无表达应对： 在宿主中补充稀有密码子的tRNA

Rosetta系列菌株（Novagen公司）1：BL21(DE3)；2：Rosetta(DE3)；3：BL21(DE3)pLysS目的蛋白M123无表达或表达量低毒基因影响：宿主中质粒不稳定、抑制生长或杀死宿主（溶菌）、表达量低或无 表达应对：严谨调控启动子，抑制本底表达 选择特殊的载体（pETcoco） 选择特定的宿主菌（BL21(DE3)pLysS，BL21(DE3)pLysE） 优化培养条件与诱导表达条件 包涵体表达123pET28aLane1：Rosetta(DE3)Lane2：BL21(DE3)pLysSLane3：BL21(DE3)蛋白不可溶成因：蛋白质正确折叠，形成有活性、有功能的天然构象的程度。定位：可溶蛋白 胞质，细胞周质，胞外（培养基） 包涵体 胞质，细胞周质特点：可溶蛋白 天然构象，正确折叠，具有生物活性 包涵体 高浓度，高纯度，无活性，具免疫原性，不易水解增加可溶表达原理 手段促进正确折叠融合催化二硫键形成酶的标签选择促二硫键形成的细胞（Origami系列菌株）分泌表达细胞周质表达，胞外分泌融合表达融合溶解性高的标签（GST，MBP）控制表达水平诱导温度IPTG浓度“假”包涵体

（疏水区域，膜结合等）特殊裂解缓冲液（去垢剂，盐，核酸酶……） 123Lane1：37℃Lane2：30℃Lane3：25℃12pETpGEX促进包涵体形成目的 高浓度，高纯度 毒基因表达 免受蛋白酶水解（小蛋白，多肽）手段 胞质表达 提升表达速率（诱导温度，IPTG浓度，etc）

特定的表达载体（pET-17xb，pET-31b(+)） 蛋白纯化障碍

表达——纯化是一个完整的、密切联系的过程，蛋白纯化过程中，很多问题的根源来自上游表达蛋白不结合，洗脱杂带多，包涵体不易溶解……下篇详述纯化策略选择亲和层析与离子交换层析层析方法的组合与顺序包涵体纯化与复性下篇蛋白纯化根据蛋白自身特点选择纯化方案常用实验流程纯化策略选择蛋白自身特点可溶/包涵体融合标签表面净电荷分子量其它特点可溶/包涵体可溶蛋白无需变性步骤适用于亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析等方法包涵体需要洗涤、变性、复性（如有需要）等步骤适用于某些亲和层析方法（6×His·Tag）、离子交换层析不适用于某些亲和层析方法（GST·Tag、MBP·Tag

）不适用于凝胶过滤层析等方法融合标签6×His·TagGST·TagMBP·Tag标签大小6aa26kDa42kDa原理金属螯合层析酶-底物特异结合酶-底物特异结合溶解性可溶/包涵体有助可溶表达有助可溶表达纯化条件天然/变性条件下纯化仅天然条件下纯化仅天然条件下纯化洗脱条件咪唑，低pH还原型谷胱甘肽麦芽糖是否去除通常不需要依实验目的而定依实验目的而定表面净电荷与蛋白质等电点、溶液pH值密切相关离子交换层析的重要标准分子量天然构象下，蛋白分子正确折叠，近似球形，大小与分子量成正比凝胶过滤层析的重要标准其他特点利用蛋白质本身的特点进行亲和层析耐热蛋白可用热变性法进行纯化常用实验流程菌体裂解蛋白预处理层析纯化菌体裂解冻融去垢剂溶菌酶超声破碎原理冰晶+溶胀化学酶解细胞壁机械作用优点简便温和温和彻底打断分子（DNA）缺点活性略有损伤容易起泡需要合适条件伤害活性发热避免蛋白质降解低温蛋白酶抑制剂蛋白质预处理(可溶)初分离/粗纯

DNA去除热变性（对耐热蛋白）交换Buffer(NH4)2SO4沉淀透析蛋白质预处理(包涵体)洗涤变性溶解13Lane1：洗涤前Lane2：洗涤Lane3：洗涤后2层析纯化选择适当层析方法亲和层析离子交换层析凝胶过滤层析亲和层析利用分子与其配体间特殊的、可逆性的亲和结合作用而进行分离的一种层析技术。

特异性

酶——底物

抗原——抗体

配体——受体可逆性

改变条件可以使结合解除金属螯合层析——6×His·Tag纯化基本原理与特点常用纯化流程常见问题与技巧基本原理与特点利用蛋白质表面暴露的一些氨基酸残基和载体之上的金属离子之间的相互作用而进行的亲和纯化。

Ni-Beads

基质：琼脂糖凝胶

侧链：NTA、IDA

配基：Ni2+Ni2+与组氨酸形成配位键Ni-NTANi-IDA常用纯化流程样品处理装柱，平衡

上样洗涤与洗脱再生常见问题与技巧蛋白不结合无标签——构建有误、提前终止（C端）、二级翻译起始（N端）

测序，重新构建标签未暴露——变性不充分，天然蛋白折叠

充分变性结合条件不合适——螯合剂、还原剂、咪唑、pH值……

螯合剂 EDTA≤0.1mM（忌用）

还原剂 DTT≤1mM（不推荐）

β-ME≤20mM（慎用）

咪唑 ≤20mM（因蛋白而异）1-S1-FT2-S2-FT样品1：0.5mMEDTA样品2：无EDTA蛋白杂带多洗脱条件不合适——咪唑浓度、pH值

梯度洗脱非特异性结合

上调初始咪唑浓度

β-ME

非离子型去垢剂、甘油、NaCl……

蛋白不完整——蛋白降解、提前终止（N端）、二级翻译起始（C端）

低温，蛋白酶抑制剂

重新构建填料过多无初始咪唑10mM

初始咪唑填料过多无β-ME有β-MEN端融合C端融合蛋白提前洗脱洗脱条件不合适——咪唑浓度、pH值

改变洗脱条件蛋白结合能力弱

下调初始咪唑浓度蛋白洗脱无检出洗脱条件不合适——咪唑浓度、pH值

增加洗脱强度蛋白结合能力强

上调初始咪唑浓度蛋白浓度低

WesternBlot

优化表达蛋白未结合或被提前洗涤

电泳检查全部样品：上样前、流出、洗涤、洗脱SFTWashElute1Elute2Elute3Elute4Elute5咪唑浓度：LaneS： 10mM

LaneWash： 20mM

LaneElute1~5： 40mM,80mM,120mM,160mM,200mMGST标签基本原理与特点GST： GlutathioneS-transferase，谷胱甘肽S-转移酶填料： 固定于基质的谷胱甘肽原理： GST与谷胱甘肽的特异性结合（酶与底物）洗脱： 还原型谷胱甘肽特点（以pGEX系统为例）

N端融合 有助正确折叠，多为可溶表达 不适用于变性条件的纯化 标签可以切除 填料没有理想的再生方法GSTGST融合蛋白10mMGlutathione离子交换层析离子交换层析原理离子交换层析分类离子交换层析特点离子交换层析原理离子交换层析分类按活性基团分阴离子交换剂：DEAE、Q……

阳离子交换剂：CM、S、P11……按基质材料分离子交换树脂离子交换纤维素离子交换葡聚糖：Sephadex

离子交换琼脂糖：Sepharose离子交换层析特点原理：待纯化物质与填料的静电作用洗脱：离子强度，pH值特点 无需融合标签，理论上可纯化任何蛋白 适用于天然或变性条件的纯化 需要灵活调整pH值与离子强度 填料可用高盐浓度简单再生SFTWashElute1Elute2Elute3Elute4填料： P11目的蛋白 20kDa，pI=9.02平衡缓冲液 pH7.4,20mM

KCl需要结合待纯化蛋白的特性，综合考虑各种纯化方法的适用条件，选择合适的纯化方法与不同纯化步骤的次序。例如：His蛋白纯化时，要小心Buffer中螯合剂（EDTA）与还原剂（DTT）的影响而进行离子交换纯化时，则必须考虑Buffer与样品的pH值和离子强度，尤其是细菌裂解后，细胞内物质的释放对pH值与离子强度的影响硫酸铵沉淀与透析的搭配使用包涵体蛋白的变、复性与纯化纯化方法的组合以某蛋白质为例，组合不同的纯化方法pI/MW:6.31/75kDa，pET28a/BL21(DE3)方法1：确认表达→裂解菌体、离心保留上清→His纯化，确认纯化效果→合并目的蛋白，透析→DEAE纯化，确认目的蛋白→合并目的蛋白方法2：确认表达→裂解菌体、离心保留上清→硫酸铵沉淀、溶解、透析→DEAE纯化，确认目的蛋白→His纯化，确认纯化效果→合并目的蛋白，透析→合并目的蛋白DEAENi-NTADEAENi-NTA包涵体洗涤包涵体变性与纯化包涵体复性包涵体纯化与复性包涵体洗涤目的： 去除沉淀中的杂质，粗纯化包涵体蛋白沉淀： 包涵体

细胞膜碎片+膜