细胞总抗氧化能力(TAC)荧光法(ORAC)定量检测试剂盒

PAGEPAGE4细胞总抗氧化能力（TAC）荧光法（ORAC）定量检测试剂盒产品说明书（中文版）主要用途细胞总抗氧化能力（荧光法（ORAC）定量检测试剂是一种旨在通过使用荧光素探针，受到有机AAPH程度的变化，来定量检测对应于标准水溶性生育酚Trolox的总抗氧化能力，即消除自由基等值浓度的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。适用于适用于各种新鲜细胞样品总抗氧化能力检测。产品严格无菌，即到即用，操作简易，性能稳定。技术背景超氧自由基阴离子superoxideradical；2-、过氧化氢（hydrogenperoxide；22、羟自由基或氢氧基（hydroxylradica；O-、过氧化基（peroxylradica；RO-、氢过氧自由基（hydroperoxyl；HO、烷氧自由基alcoxylradica、氮氧基nitricOxideN-、过氧亚硝基阴离子peroxynitriten-次氯酸hypochlorousacid；HOC、半醌自由基（semiquinoneradical、单线态氧气（singletoxyge）等细胞内活性氧族（ReactiveOxygenSpecies；ROS）的产生和增多，将导致细胞衰老或凋亡，甚而导致诸如冠心病、风湿性关节炎、肿瘤、退行性病变等各种病理状况。在生物系统内，通过抗氧化酶例如超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶等，大分子，例如白蛋白、铜蓝蛋白（ceruloplasmin；CER、铁蛋白（ferritin）和抗氧化因子，例如生育醇、类胡萝卜素、抗坏血酸、还原性谷胱甘肽和尿酸胆红素（bilirubin）ROS能力oxygenradicalabsorbancecapacit；ORAC，即使用荧光素（fluorescei）作为探针，2,2'-偶氮二异（2,2-azobis(2-amidinopropane)（peroxylradicaldonor，其攻击探针，产生荧光淬灭，一旦受到抗氧化剂作用，而防止荧光消失，由此评价抗氧化潜力和活性，也就是自由基去除作用（freeradicalscavengin，在荧光分光光度仪（激发波长485nm20，散发波长528nm±20）的帮助下，观察其峰值下降程度的变化，并与标准化抗氧化剂水溶性生育酚Trolox对照。产品内容清理液（ReagentA）低渗液（ReagentB）缓冲液（ReagentC）染色液（ReagentD）氧化液（ReagentE）标准液（ReagentF）产品说明书

300毫升25毫升4毫升7.5毫升1管200微升1份保存方式保存清理液（Reagent、低渗液（Reagent）和缓冲液Reagent）4在－206月用户自备15毫升锥形离心管：用于样品操作的容器1.54℃（微型）台式离心机：用于样品操作细胞刮脱棒：用于脱离细胞超声仪：用于破碎细胞200196荧光分光光度仪或荧光酶标仪：用于荧光分析实验步骤一、样品准备25cm260mm细胞培养皿的待测培养细胞（15X106细胞）小心加入3毫升 清理液（Reagent，覆盖生长表面小心抽去清理液使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞（注意：）加入2毫升 清理液（Reagent，混匀细胞2毫升离心管（悬浮细胞从这一步骤开）45300g小心抽去上清液500微升低渗液（Reagent，混匀102001110010秒，2个循环41010000g（10000RPMeppendorf5415）41.5毫升离心管移取10微升进行蛋白定量检测（建议使用 BCA蛋白质浓度定量试剂盒－GMS30031.1）使用清理液（Reagent100微克/25微升二、标准液准备51.515号管50微升缓冲液（Reagent25号管移取100微升 标准液（Reagent到1号管，混匀501号管的标准液（ReagentF）2号管，混匀502号管稀释的标准液（ReagentF）3号管，混匀503号管稀释的标准液（ReagentF）4号管，混匀15号管放进冰槽里备用，避免光照；标准管浓度见下表管号缓冲液（ReagentC）标准液（ReagentF）测定体系标准Trolox浓度10100微升1微摩尔/升250微升50微升0.5微摩尔/升334550微升50微升50微升505000.25微摩尔/升0.125微摩尔/升0三、样品测读实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂置于室温下融化，移取1.5毫升缓冲液（Reagent到1管 氧液（ReagentE）里，混匀，置于暗室里，标记为氧化工作液，避免光照。然后进行下列操作。196孔板，做好标记：最大对照孔、标准样品孔、待测样品孔150微升染色液（ReagentD）96孔板里的每个孔里25微升缓冲液（ReagentC）到最大对照孔25微升上述配制的标准液（ReagentE）到相应标准样品孔里25微升样品（100微克蛋白总量）到待测样品孔里3730分钟25微升氧化工作液到标准样品孔和待测样品孔里25微升缓冲液（ReagentC）到最大对照孔96孔板，使其混匀3715分钟485nm±20528nm±20分析结果：构建标准曲线：纵座标（Y轴）为荧光单位；横座标（X轴）Trolox浓度（微摩尔/升）最大对照孔为最大荧光单位读数标准样品孔和待测样品孔为实际荧光单位读数Trolox浓度（微摩尔/升）计算样品实际总抗氧化能力Trolox（微摩尔/升）X÷0.025（样品容量；毫升）＝（微摩尔/升TROLOX等值）根据下列公式计算测定体系中样品量的总抗氧化能力（实际抑制百分率）【实际荧光单位读数÷最大对照孔荧光单位读数】X100％IC50：50％抑制率所需的样品单位：TROLOX等值或样品蛋白量（/毫升）量（106细胞）X（所需样品单位）＝（已知样品单位÷实际抑制百分率）X50％注意事项50次操作，包括标准品1001Tr