王镜岩生化第三版考研课件 第36章 RNA的生物合成与加工

第三十六章RNA的生物合成和加工

转录(transcription)：以DNA单链为模板，NTP为原料，在DNA依赖的RNA聚合酶催化下合成RNA链的过程。转录的条件：模板原料酶产物配对方向引物DNA(不对称转录〕NTPRNA聚合酶mRNA,tRNA,rRNA，小RNAA-U,T-A,G-C5’3’不需要DNA复制与转录的比较相同点模板两股链均复制模板链转录合成方式半保存复制不对称转录原料dNTPNTP聚合酶DNA聚合酶RNA聚合酶碱基配对A-T，G-CA-U，T-A，G-C产物半保存的双链DNA单链RNA不同点以DNA为模板遵循碱基配对原那么都需依赖DNA的聚合酶聚合过程都是生成磷酸二酯键新链合成方向为5’→3’3/50复制转录◆几个根本概念结构基因(structuregene)模板链(templatestrand)Watson(W)链、负(-)链(minusstrand)、反意义链(antisensestrand)编码链(codingstrand)Crick(C)链、正(+)链(plusstrand)、有意义链(sensestrand)不对称转录(asymmetrictranscription)结构基因(structuregene)：

DNA分子中能转录出RNA的区段。模板链：

反意义链〔antisensestrand，(-)链〕

——以该链中的DNA碱基顺序指导RNA的合成即被转录的那条DNA链。

编码链：有意义链〔sensestrand，〔+〕链〕

——不被转录的那条DNA链，但其碱基顺序除T代替U外，其余与mRNA相同。

5’-----GCAGTACATGTC-----3’编码链DNA3’-----CGTCATGTACAG-----5’模板链5’-----GCAGUACAUGUC-----3’mRNAN------Ala--Val--His--Val------C蛋白质不对称转录

.DNA双链上，仅一股链转录，另一股不转录。

.有意义链与反意义链并非固定不变。

.转录方向都是5’3’转录方向5’3’模板链图13-1

〔一〕RNA聚合酶——依赖DNA的RNA聚合酶

〔DNA-dependentRNApolymerase,DDRP〕

以DNA为模板，催化2个游离的NTP形成3’，5’-磷酸二酯键1、大肠杆菌RNA聚合酶的组成〔1〕全酶(holoenzyme)由4种(5个)亚基α2ββ’σ组成〔2〕核心酶(coreenzyme)α2ββ’，参与转录的全过程〔3〕σ亚基〔起始亚基〕亦称σ因子〔σfactor)—转录辅助因子识别启动子ω亚基功能未知大肠杆菌RNA聚合酶的结构示意图核心酶(α2ββ)起始因子β——和模板DNA结合β——起始和催化聚合反响α——酶的装配、结合启动子等全酶(α2ββ

)全酶核心酶亚基α2ββ’σ决定哪些基因被转录结合底物，形成磷酸二酯键〔催化〕结合模板〔开链〕〔核心酶参与转录全过程〕识别起始点启动子〔延长时脱落〕功能全酶=α2ββ’(ω)σ

核心酶=α2ββ’

σ—开始合成RNA链时必需有σ因子，

一旦合成开始即释放出来

β’—参与酶与底物的结合，

以及与σ因子和核心酶的结合

β—参与σ因子和核心酶的结合，并参与RNA合成的引发、延伸

α

—与结合模板、酶的滑动及碱基识别有关起始双链DNA局部解开磷酸二酯键形成终止阶段解链区到达基因终点延长阶段53RNA启动子Promoter

终止子terminator5RNA聚合酶5353553离开转录泡2.真核细胞RNA聚合酶在DEAE-Sephadex柱上的洗脱次序称为酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ

没有对应于σ因子的成分，需要转录因子参与类型ⅠⅡⅢ转录产物rRNA:18s,5.8s,28shnRNAsnRNAtRNA,5srRNA,scRNAU6snRNA对鹅膏蕈碱的反响不敏感高度敏感不同物种敏感性不同酵母RNA聚合酶ⅠSeeMovieofTranscription〔二〕启动子〔promoter〕和转录因子

1、启动子

RNA聚合酶全酶识别、结合、开始转录的DNA序列〔双链〕

2、转录因子

RNA聚合酶起始转录所需要的辅助因子〔蛋白质〕

足迹法〔Footprinting〕足迹法技术用于测定与特殊蛋白质结合的核酸顺序。如该技术提供了RNA聚合酶与启动子之间相互作用的信息并确定了作用位点〔启动子〕的核苷酸顺序。通过核酸酶消化别离Pr结合的DNA片段足迹法确定启动子序列

3、原核生物启动子的特点:

(1)DNA序列在转录起始点的5’端区(上游区)

(2)-10bp处-TATAAT-(Pribnowbox)

(3)-35bp处-TTGACA-

原核生物的转录起始σ亚基识别-35区RNApol全酶移向-10区合成第一个磷酸二酯键5’-pppGpN-OH-3’转录起始复合物RNApol(αββ′σ)—DNA—pppGpN-OHσ亚基脱落〔结合松弛〕〔结合紧密〕转录起始不需引物！16/50RNA聚合酶保护区结构基因终止点10-10TTGACATATAAT转录开始+1翻译开始Purine-35〔Pribnowbox〕识别结合区转录起始区12/50大肠杆菌启动子共有序列的功能××AGTCTTGACA××××××××××××××××××AAT××××××××××××××TTAAAT××××××AACTGT××××AAT××××××××××××××××Pribnow框-10-35识别区16-19bp5-9bp起点

酶与启动子的结合速度解链速度RNA聚合酶σ因子识别及结合启动子，延长时脱落不参与转录过程，是转录辅助因子识别位点：启动子-35区、-10区原核生物有多种σ因子识别不同的启动子一般情况下起作用的是---σ70σ70有四个保守区域：第2区域、第4区域和-35区和-10区结合由含70RNA聚合酶全酶识别的典型大肠杆菌启动子促进转录ααββ’TTGACATATAAT-35原核生物RNA聚合酶及其在转录起始区的结合σ-109/50σ70σ32Heatshockprotein(HSP)热休克蛋白应激结合过程：闭和的启动子复合体RNA聚合酶〔全酶〕中的σ因子在DNA双链上迅速、随机滑动，寻找到启动子-35区，形成疏松的复合物，DNA双链未解开。开放的启动子复合体RNA聚合酶〔全酶〕移向-10区和转录起始延长----转录泡

RNA聚合酶〔核心酶〕

◆与DNA模板紧密结合，沿3’5’方向移动

◆解旋作用：DNA解开

◆聚合功能〔不具外切酶功能〕

杂交螺旋

◆RNA-DNA形成杂交螺旋

◆转录产物RNA沿5’3’方向延长

SeeMovie核心酶图13-74、真核生物的起始——较原核生物复杂

◆顺式作用元件

(启动子/增强子)

◆转录因子(transcriptionfactor,TF)

RNA聚合酶Ⅱ所需的转录因子

---转录因子Ⅱ〔TFⅡ〕

启动子上游启动子元件(upstreampromotorelements,UPE)增强子：远离转录起始点〔1~30kb〕增强启动子转录活性DNA序列作用与方向、距离无关沉默子：负性调节元件，起阻遏作用

与基因表达调控有关的DNA非编码序列——顺式作用元件(cis-actingelement)顺式作用元件增强子反式作用因子(trans-actingfactor)概念：为DNA结合蛋白，可使邻近基因开放〔正调控〕或关闭〔负调控〕特点：三个功能结构域：DNA识别结合域转录活性域结合其他蛋白的结合域能识别并结合顺式作用元件(cis-actingelement)正调控与负调控功

能

结

构

域反式作用因子结构域的模式DNA结合域(DNA-bindingdomain)锌指结构(zincfingermotif)同源结构域(homodomain,HD)：

螺旋-回折-螺旋(helix-turn-helix)亮氨酸拉链结构(leucinezipper)螺旋-环-螺旋(helix-loop-helix,HLH)碱性α螺旋(alkalineα-helix)A类别Ⅰ启动子〔有种属特异性〕——控制rRNA前体基因的转录近启动子-40～+20：决定转录起始的精确位置远启动子-180～-107：影响转录的频率〔核心启动子和上游控制元件〕需要两种转录因子的参与upstreamcontrolelement结合于富含CG的区域四聚体蛋白σB类别Ⅱ启动子根本启动子〔basalpromoter〕起始子〔initiator〕上游元件〔upstreamelement〕应答元件〔responseelement〕需要多种转录因子的参与TATA框〔Hognessbox，–25至-30bp〕与RNA聚合酶的定位有关DNA双链解开的部位辅助因子为通用转录因子〔generaltranscriptionfactor，GTF〕①根本启动子Y为嘧啶碱②起始子〔initiator，Inr〕RNA聚合酶Ⅱ与转录因子的装配TATA-bindingprotein，TBP形成复合物ATP酶、解旋酶和激酶活性

GCCAAT-90-70③上游元件CCAAT框〔被CP1、CP2和核因子NF-1识别〕GC框〔被Sp1识别〕八八聚体框〔octamer，被Oct-1和Oct-2识别〕转录激活因子的诱导调节磷酸/去磷酸化④应答元件细胞因子酪氨酸激酶JAK-STAT途径信号转导子和转录激活子类别Ⅲ启动子下游启动子/内部启动子tRNA基因：两个分隔的局部〔A、B区〕5SrRNA基因：+50～+83需要3种转录因子的参与定位因子通用转录因子RNA聚合酶Ⅱ催化的转录过程RNA聚合酶Ⅱ催化各种前体mRNA的合成需要多种TF参与：TFⅡ①起始真核细胞RNA聚合酶Ⅱ所需的转录因子

参与RNA-polⅡ转录的TFⅡ转录因子功能TFⅡA稳定TBP及TFⅡB与启动子的结合TFⅡB与TPB结合引进polⅡ-TFⅡF复合物TBP识别TATA盒TFⅡHATPase、激酶、解旋酶TFⅡF解旋酶，与polⅡ紧密结合20/50TBP与DNA的结合真核生物转录起始复合物的组装启动子TATA盒+TFⅡD+D-A复合物(TFⅡD+TFⅡA)+TFⅡB+(RNA聚合酶+TFⅡF)复合物+TFⅡE、TFⅡJ+TFⅡH〔解旋酶、蛋白激酶〕DNA解旋、RNA聚合酶C-端Ser磷酸化从起始点向下游移动TBP---TATAbindingproteinTAF---TBP-associatedfactorsTFⅡDTFⅡA

TFⅡBRNApolyⅡ/TFⅡFTFⅡEPICDTATABFEDNA起始前复合物〔Pre-InitiationComplex，PIC〕ARNApolyⅡTATA起始前复合物〔PIC〕的生成②延伸时形成转录泡〔三〕终止：终止子和终止因子

转录至模板某一位置

停止形成磷酸二酯键

RNA—DNA杂交链解开

DNA解链的局部重新形成双螺旋

RNA聚合酶离开DNA

终止子〔terminator〕——提供转录终止信号的DNA序列终止因子〔terminationfactor〕——协助RNAPol识别终止信号的辅助因子抗终止因子〔antiterminationfactor〕——阻碍终止子作用的蛋白造成通读〔readthrough〕如：噬菌体早、中、晚期基因的时序表达

1、转录终止的两种方式〔原核〕

第一类：依赖ρ-因子的终止ρ-因子的结构六聚体依赖RNA的NTP酶活性RNA-DNA解旋酶活性与单链RNA结合

ρ-因子的作用与新生RNA结合ATP供能ρ因子沿新生的RNA单链推进新生的RNA单链从DNA模板上别离下来新生RNA图13-8ρ因子1.识别结合富含C的RNA链功能2.ATPase活性3.解螺旋酶活性ρ因子+ATP5′3′Polymerase富含C

DNA模板上有终止信号

转录出来的RNAPol遇此结构停止工作DNA和RNA〔dA：rU〕稳定性下降富含GC/AT的回文结构自身互补形成发夹状结构〔hairpin〕3’尾端有≥4个UDNA恢复双链，释放转录产物第二类：不依赖ρ-因子的终止UUGCAGCCUGAGAAAUCAGGCUGAUGG…5’3’…5’3’自发形成发夹结构〔转录产物3’末端〕例如：AUGGCUGGUGACUUUUUAGUCACCAGCCUU5’3’UUUU……5’3’自发形成茎环结构UUUU………..5’3’茎环结构改变RNApol的结构，使其失活茎环结构的形成使转录复合物趋于解体，PolyU加速这一过程发夹结构环茎多个U

DNA模板3’5’NusA蛋白置换σ因子并识别终止子结构，完成起始复合物与终止复合物的循环N蛋白具有抗终止作用不依赖于ρ的终止子依赖于ρ的终止子抗终止作用〔四〕转录的调节控制遗传信息表达有时间特异性(temporalspecificity)〔时序性〕和适应性〔adaptivespecificity〕时序性:某一基因的表达严格按特定的时间顺序发生Hb(hemoglobin)α珠蛋白基因簇：ζ〔胚胎型〕、αβ珠蛋白基因簇：ε〔胚胎型〕、γ〔胎儿型〕、β、δζ2ε2→α2γ2→α2β2适应性：

适应环境、维持生长和增殖维持个体发育与分化基因表达调控的环节：基因活化、转录、转录后加工、翻译、翻译后加工原核生物基因表达的调控

(ControlofProkaryoticGeneExepression)转录水平的调控(controloftranscription)操纵子(operon)细菌基因表达和调控的单位由信息区与调控区组成〔正调控与负调控〕操纵子模型的提出

—莫洛(Monod)和雅各布(Jacob)

获1965年诺贝尔生理学和医学奖PS1S2S3启动子OPromoter调控序列结构基因操纵子〔operon〕

结合RNA聚合酶表达功能蛋白?11/50操纵子〔operon〕:原核生物的转录单位操纵基因OperatorDiscoveryofOperon1940年，Monod发现：细菌在含葡萄糖和乳糖的培养基上生长时，细菌先利用葡萄糖，葡萄糖用完后，才利用乳糖；在糖源转变期，细菌的生长会出现停顿。即产生“二次生长曲线〞。存在两种酶：组成酶与适应酶〔诱导酶〕。“酶的适应现象及其在细胞分化中的意义〞1947操纵子的结构与功能操纵子(operon):结构基因(structuralgene)、启动子(promoter,P)和操纵基因(operator,O)阻遏物基因(inhibitor,I),产生阻遏物(repressor)

SeeMovieoflacOperonCAP的正性调节

〔PositiveControlofCAP〕CAP(catabolitegeneactivatorprotein)—降解代谢基因激活蛋白或CRP〔cyclicAMPreceptorprotein〕—环腺苷酸受体蛋白两个相同的亚基组成，均含有DNA结合区cAMP(cyclicAMP)结合位点cAMP能促进许多原核生物的基因表达cAMP活化CRP〔cAMPreceptorprotein〕↓改变其构象，提高对启动子亲和力，促进转录CRP是广谱的正调节物，促进RNAPol与启动子的结合葡萄糖效应：细菌优先利用葡萄糖，阻遏利用其它底物的酶类的合成。原因：葡萄糖的降解物可以抑制AC的活力，激活磷酸二酯酶——降低cAMP的水平CAP-cAMP对转录的正调节〔五〕与DNA结合蛋白的基序结构1、螺旋-转角-螺旋Lacrepressor2、锌指结构——保守AA的基团锌离子形成相对独立的结构域有两种：Cys2/His2〔典型的锌指蛋白，串联重复〕Cys2/Cys2〔类固醇受体中〕结合DNA及二聚化Cys2/His2锌指结构12AA特异结合位点〔类固醇与类固醇受体〕糖皮质激素效应元件3、借疏水作用形成的——亮氨酸拉链bZIP4、HLH〔螺旋-环-螺旋〕

——两个两亲性α螺旋

以疏水侧形成二聚体

碱性区结合DNA〔bHLH〕一、嘌呤和嘧啶类似物核酸代谢的拮抗物：抑制核酸合成有关的酶掺入核酸分子形成异常核酸如：6-巯基嘌呤、硫鸟嘌呤、2.6—二氨基嘌呤、8-氮鸟嘌呤、5-氟尿嘧啶、6-氮尿嘧啶进入体内变成相应的核苷酸表现抑制作用〔六〕RNA生物合成的抑制作用

2、DNA模板功能的抑制物〔1〕放线菌素D〔actinomycinD〕与DNA形成非共价复合物其作用如同阻遏蛋白抑制DNA转录和复制。色霉素A3、橄榄霉素、光神霉素〔2〕嵌入染料使DNA在复制时缺失或增添一个核苷酸，导致移码突变，并能抑制RNA链的起始。〔3〕烷化剂放线菌素D--插入dG*dC间低浓度--(-)RNA延长高浓度--(-)RNA起始

(-)DNA复制与DNA模板作用3、RNA聚合酶的抑制剂利福平抑制细菌RNA聚合酶活性原核生物真核生物利福平/利福霉素利链霉素与RNA聚合酶β亚基结合α鹅膏蕈碱——(-)RNA聚合酶Ⅱ与RNA聚合酶作用某些常用的转录抑制剂抑制剂靶酶抑制作用利福霉素细菌的全酶与β亚基结合阻止起始利链霉素细菌的核心酶与β亚基结合阻止延长放线菌素D真核RNAPolⅠ与DNA结合并阻止延长α-鹅膏蕈碱真核RNAPolⅡ与RNA聚合酶Ⅱ结合二、RNA的转录后加工/成熟〔post-transcriptionalprocessing〕

MmRNA可直接作为翻译的模板rrRNAttRNA〔一〕原核生物RNA的成熟原初转录产物要加工、修饰1、rRNA的加工原核生物rRNA转录初始物:rRNA基因和tRNA基因组成混合操纵子：

16SrDNA

tDNA

23SrDNA

5SrDNA

tDNArRNA转录初始物:

16SrRNA

tRNA

23SrRNA

5SrRNA

tRNA加工RNA酶Ⅲ对转录初始物切割再加工成熟RNaseⅢRNaseⅢRNaseE甲基化碱基甲基化核糖2、tRNA的加工原核生物tRNA转录初始物:tRNA基因:◆Ⅰ型---tRNA有3’-CCA-OH◆Ⅱ型---tRNA无3’-CCA-OHtRNA转录初始物:◆与rRNA相连◆几个相同(不同)tRNA连在一起●加工RNA酶ⅢRNA酶FRNA酶DRNA酶PtRNA核苷转移酶切开rDNA、tDNA转录产物间隔序列从3’端切断前体分子核酸外切酶,切除Ⅰ型tRNA3’-CCA-OH下游序列〔核酸+蛋白〕〔M1RNA〕内切酶，tRNA5’端成熟酶

催化Ⅱ型tRNA形成稳定的3’-CCA-OH●稀有碱基〔二〕真核生物RNA转录后的加工

1、rRNA转录后的加工rRNA的基因(rDNA)

转录产物成簇排列高度重复序列DNA核质:(Ⅲ)--不需加工5srRNA核仁:(Ⅰ)--加工rRNA

28srRNA

18srRNArDNA内含子基因间隔18s28s每个重复单位45s转录物3种rRNA前身剪接18srRNArRNARNaseⅢ核酸内切酶核糖2-OH转录后的加工和与核糖体的装配同时进行前rRNA的切割特点：在特殊序列位点由核仁小RNA(snoRNA)催化，snoRNA+蛋白质核仁小核蛋白(sno-RNP)2、tRNA的加工碱基修饰3’端5’端切除反密码环的内含子稀有碱基---Tψ脱氨---AMPIMP复原---DHU甲基化---mAmG添加CCA-OHRNaseP切除多余的核苷酸RNaseP在前tRNA二级结构根底上3、真核生物的mRNA转录后加工转录产物：hnRNA+蛋白质不均一核糖核蛋白〔hnRNP〕●原核与真核生物mRNA的区别原核生物mRNA多顺反子转录与翻译同步mRNA不需加工

寿命短真核生物mRNA单顺反子转录后需加工运至胞浆再翻译mRNA需加工寿命较长加帽加尾mRNA前体的剪接5’端：m7GpppGpN作用:稳定mRNA5’端和翻译的起始有关3’端:polyA尾巴作用：稳定mRNA

和翻译模板活性有关剪除内含子，连接外显子加工过程主要包括：5pppGp…5GpppGp…pppGppi鸟苷酰转移酶5m7GpppGp…甲基转移酶SAM5ppGp…磷酸酶Pi〔1〕真核生物mRNA转录后加工--“加帽〞以5’-5’三磷酸相连帽0帽Ⅰ帽Ⅱm7GpppGpNm7GpppGmpNm7GpppGmpNm●三种5’帽结构形式CapBindingComplex步骤1步骤2作用位置200~250〔2〕真核生物mRNA转录后加工--加polyA尾外显子内含子DNA

hnRNA〔3〕真核生物mRNA转录后加工—剪接mRNA-DNAhybridsforthechickenovalbumingene(theR-loopingtechnique)①类型Ⅰ自我拼接磷酸酯的转移反响②类型Ⅱ自我拼接③hnRNA的拼接核内小RNA(snRNA)拼接体(spliceosome)的形成●剪接所需条件

snRNA〔U1-U6〕+多肽/蛋白质

多种snRNP

〔核内小核糖核蛋白颗粒〕

多种snRNPs装配成

拼接体

〔参与剪接过程〕3与内含子5’互补需要U2辅助因子和U1snRNP片段互补结合在一个核糖核蛋白颗粒分支点供能促使U4和U6别离U2和U6互补U5识别外显子拼接点5’羟基④tRNA前体的酶促拼接2’3’环磷酸基环磷酸二酯酶2’磷酸基3’羟基5’羟基5’磷酸基5’-5’酵母⑤反式拼接与选择性拼接降钙素降钙素基因相关肽RNA编辑〔RNAediting〕介绍

〔1〕一种与RNA加帽、加尾、剪接不同的RNA

加工形式。

〔2〕转录后改变RNA的序列，使成熟RNA的序

列与基因组DNA序列不同。

〔3〕生物学中心法那么的补充，扩大了mRNA

遗传信息容量。

SeveraltypesofmRNAeditinginvolvingbasesubstitutionscansignificantlyalterthepolypeptideproductsencodedbytheRNAsequences起始密码氨基酸的变化终止密码沉默编辑mRNA编辑的几种类型锥虫线粒体RNA编辑——泛〔全〕编辑〔panediting〕：插入U锚定顺序核酸内切酶末端尿苷酸转移酶RNA连接酶RNAeditinginprotein-codingregionsofmitochondrialtranscriptfromtheprotozanTrypanosomabrucei四膜虫线粒体COIII基因转录区mRNA的泛编辑人载脂蛋白mRNA〔apolipoproteinB〕基因编码4563个AA多肽→ApoBl00——肝细胞中合成后分泌到血液中编码2153个AA多肽→ApoB48——在肠细胞中合成同源载脂蛋白是载脂蛋白mRNA编辑后的产物

人类载脂蛋白B〔ApoB〕mRNA的编辑出现一个终止密码载脂蛋白apo-BmRNA的修饰超编辑：一种修饰的mRNA加工，涉及靶分子广泛的脱氨基，使RNA的50%腺嘌呤核苷酸转变为次黄嘌呤，称为超编辑。双链RNA腺嘌呤脱氨酶〔dsRADs〕mRNA分子中的区段邻近的内含子顺序——产生双链构型指定修饰的位点

形成特别的配对

腺嘌呤脱氨基插入编辑〔insertionalediting〕在某些病毒RNA及原生生物线粒体mRNA中出现，涉及面不广。例如副粘病毒P基因在mRNA的特别位置插入鸟苷酸〔G〕产生至少2个不同的蛋白质。这些插入事件与引导RNA无关，它们是由RNA多聚酶在合成mRNA时参加的。多聚腺苷酸化〔polyadenylation〕编辑这类加工事件多见于动物线粒体mRNA。从人线粒体基因组转录的5个mRNA均以U或UA结尾，而非终止密码UAA或UAG。多聚腺苷酸化可将未端的U或UA转变为UAAA……，产生终止密码，这是脊椎动物线粒体为保持足够紧凑的结构而具有的几个特征之一。核酶〔介绍〕三、在RNA指导下RNA和DNA的合成〔一〕在RNA指导下RNA合成AmodeltoexplaintheRNA-dependentsynthesisofanRNApolymerfromoligonucleotideprecursors.AnATP-bindingRNAwasgeneratedandisolatedusingSELEX.〔二〕逆转录以RNA为模板，有逆转录酶的参与，在4种dNTP存在及适合的条件下，按碱基配对的原那么，合成cDNA〔complementaryDNA,cDNA〕的过程。1、逆转录酶〔reversetranscriptase)RNA依赖