基因工程抗体1

基因工程抗体

根据研究者的意图，采用基因工程方法，在基因水平，对免疫球蛋白基因进行切割、拼接或修饰后导入受体细胞进行表达，产生新型抗体。主要包括嵌合抗体、单链抗体、人源化抗体、双价抗体和双特异性抗体等。Geneticengineeringantibody单克隆抗体用于治疗存在的问题1、单克隆抗体的特异性由于肿瘤特异性抗原较少，缺乏对肿瘤有严格特异性的单抗，对正常组织有交叉反响；2、异种抗体反响鼠源性单抗用于人体，导致异源性超敏反响理想的抗体药物的性质高特异性和高亲和力〔Kd=108~1010L/M〕对人没有免疫原性，不诱导机体对抗体的排斥反响游离抗体不激活补体一旦结合到靶抗原上，能诱导效应功能细胞系稳定，适合在无血清培养基中进行大规模培养抗体符合生物制品标准

问题异源蛋白导致产生抗抗体，影响靶向性和效果靶部位摄取的量太低效应功能弱在体内被去除速度快

对策抗体人源化改变抗体分子大小连接毒素、放射性同位素、药物抗体人源化抗体治疗存在的问题及对策抗体药物改造的方向抗体人源化和人源抗体制备改变抗体分子大小增强抗体亲和力增强抗体效应功能单克隆抗体人源化的改进鼠抗体人源化〔人-鼠嵌合、改型抗体〕小分子抗体〔Fab、单链、单域、超变区多肽〕基因工程抗体〔双特异、免疫黏连素、催化抗体〕人源抗体〔噬菌体抗体库、转基因小鼠〕人-人抗体1、抗体人源化鼠单克隆抗体人源化：嵌合抗体、改型抗体小分子抗体：单价(Fab、ScFv、单域抗体、超变区多肽)、多价〔Di-,Tri-,Minibody〕特殊类型抗体(双特异性抗体、细胞内抗体、抗原化抗体、免疫脂质体)抗体融合蛋白〔免疫粘连素、免疫毒素、催化抗体〕VH和VL是抗原决定簇结合位点高变区HVR决定簇互补区CDR

骨架区FRCH1和CL：Ig同种异型的遗传标志CH2：补体结合位点CH3：某些细胞Fc受体结合部位

第一代的抗体人源化—嵌合抗体从杂交瘤细胞别离出鼠MAb功能性可变区基因，与人Ig恒定区〔决定免疫原性〕基因连接，插入适当表达载体，转染宿主细胞，表达人-鼠嵌合抗体。嵌合抗体由于这两局部在空间结构上相对独立，其独特的抗体亲和力保持得很好，但因鼠单抗可变区的存在，应用时仍有较强的免疫排斥反响。特点：减少了鼠源性抗体的免疫原性，同时保存了亲本抗体特异性结合抗原的能力。Pr鼠VH人CHPr鼠VL人CL免疫球蛋白基因载体的构建H链嵌合载体L链嵌合载体共转染细胞启动子人-鼠嵌合抗体基因工程改造策略鼠VH鼠VL人CL人CH抗体分泌细胞人-鼠嵌合基因工程抗体第二代的抗体人源化——改型抗体在嵌合抗体的根底上进一步将鼠MAb可变区中相对保守的FR(frameworkregion)替换成人的FR，保存与抗原结合部位决定簇互补区〔complementdeterminantregion)部位(即CDR移植)早期的改型抗体：简单的CDR移植，通过点突变进行微调即更换某个位点上的氨基酸。第二代改型抗体：①应用了人抗体基因库；②引进计算机技术模拟抗体分子的立体结构(分子模拟法)；③使用了鼠人嵌合FR。其目的是获得具有高亲和力的治疗性抗体

CDR序列CDR序列鼠单克隆抗体人抗体人源化抗体鼠单克隆V区人源化〔CDR移植〕小分子抗体人源化抗体属完全的抗体分子。通过基因重组技术，可以在保持原有抗原结合活性的根底上，把完整的抗体分子改造成较小的分子，称为小分子抗体。根据其价数的不同可分为单价小分子抗体及多价小分子抗体两种。单价小分子抗体一、Fab抗体

Fab段由重链V区及CH1功能区与整个轻链以二硫键形式连接而成，主要发挥抗体的抗原结合功能。Fab抗体只有完整IgG的1/3。二、单链抗体(ScFv)定义：用基因工程方法，将抗体VH和VL〔重链和轻链可变区〕通过一个连接肽连接而成的小分子抗体，功能：具有较好的抗原结合能力，且分子量小、穿透力强、免疫原性低等特性。可与其他效应分子构建成多种具有新功能的抗体分子，是构建免疫毒素和双特异抗体等的理想而根本的元件。Ag

ScFv应用：用于肿瘤的导向治疗肿瘤的影像分布基因治疗研究基因结构与功能的关系三、单域抗体

抗体与抗原的结合主要由Ig的V区决定，因此只含V区基因片段的小分子抗体，即只有VH或VL一个功能结构域，也能保持原单克隆抗体的特异性。这种小分子的抗体片段就称为单域或单区抗体，其分子量仅为整个Ig分子的1／12，故也称之为小抗体。四.超变区多肽(hypervariableregionpolypeptides)抗体抗原结合是经过补体决定区〔CDR〕来实现。因此，CDR是构成抗原抗体结合的最小结构单位。根据这一特点，可以设计出那些在抗原识别及亲和力方面有重要意义的CDR多肽，直接用于诊断或治疗，可望获得理想的结果。这种只含有一个CDR多肽的抗体，称为超变区多肽，亦称为最小识别单位(minimalrecognitionunit,MRU)。多价小分子抗体在ScFv的根底上，可以把两个或两个以上的ScFv重组在一起，由此可制备成多价小分子抗体即微型抗体〔简称多价微抗〕。其中包括双链抗体(diabody)，微型抗体〔minibody〕，三链抗体(triabody)及四链抗体(tetrabody)等。AgAg一、双链抗体(diabody)

制备方法化学交联法粘性蛋白结构域融合法接头长度控制法。二、三链抗体(triabody)在制备单链抗体时，当接头的长度为2个或2个的以下氨基酸残基时，或者直接把VH结构域的N末端与VL结构域的C末端相连，通过非共价键而形成的三聚体，称为三链抗体。接头长度在3～12个氨基酸残基时，那么形成双链抗体。三、微型抗体(minibody)通过基因工程手段采用不同的接头把单链抗体(VL-VH)的VH结构域与IgG的CH3结构域融合，形成VL-VH-CH3的结构，称之为微型抗体〔minibody〕。此种抗体合成后通过CH3结构域形成稳定二聚体式，发挥其双价微抗作用。四、双特异性抗体〔BfAb〕天然Ig是由两个完全相同的VL和VH区域构成，该区域是特异性识别并结合抗原的关键部位。而经人工设计构建的双特异性抗体〔BsAb〕那么由两个不同的抗原结合位点组成，可同时与两种不同的抗原决定簇结合，并可将其偶连的药物、酶或放射性核素等导向到靶部位，这种具有双价双特异性的抗体又称为双功能抗体〔bifunctionalantibody,BfAb〕双特异性抗体的特点将免疫细胞锚着于肿瘤部位，提高肿瘤部位的效靶比。不受MHC的限制，直接激活免疫细胞的杀瘤机制。123提高抗体效应功能抗体融合蛋白双特异性抗体偶连细胞毒物质细胞内抗体提高抗体效应功能抗体融合蛋白：抗体的一局部被非抗体序列替代，所形成的具有新的特性融合蛋白。根据构建方式的不同，主要分为两种形式：Fc融合蛋白〔Fcfusionprotein,FcFP〕由抗体的Fc段与某些具有特定功能的蛋白结构域融合而成。如CD4免疫粘附素，就是由抗体的Fc段与2个CD4分子的Ig同源区重组而成抗原结合融合蛋白〔antigen-Bindingfusionprotein,ABFP〕由具有抗原结合功能的抗体结构与其他功能性蛋白融合构成。如免疫毒素，抗体局部主要包括嵌合抗体、单链抗体形式。免疫粘附素(immunoadhension)：将人抗体恒定区(主要是Fc段)N-端连接于人细胞外表的受体分子或细胞粘附分子上，在真核细胞中表达出正确折叠的融合抗体蛋白分子，这种分子可同时发挥抗体的效应功能及其它相应的效应功能，这种分子又被称为新效能抗体。免疫毒素：又称生物导弹，是由导向性的载体分子与具有毒性的弹头蛋白交联而制成，属于导向药物的一种。偶连细胞毒物质连接放射性同位素(131I、99mTc〕连接植物或细菌毒素〔ricin、PE40〕连接细胞毒性药物〔C1027、柔红霉素〕免疫毒素CCVCVCCCSPDPSPDPRicinARicinA〔α-FcγRI-RicinA〕RicinA:蓖麻毒素A,对肿瘤细胞具有毒性作用CH1CH2CH3IL-2scFvIL-2

免疫细胞因子(Immunocytokine)五、细胞内抗体细胞内抗体主要是指在细胞内合成并作用于细胞内组分的抗体，亦称内抗体〔intrabody〕。目前的研究主要集中在单链抗体上，在ScFv的C端或N端插入其它靶向信号〔targetingsignals〕，如分泌信号、核定位信号、线粒体定位信号和内质网滞留信号等，从而进行检测、识别、发挥特定功能。细胞内抗体的应用：由于细胞内抗体具有高亲和力及选择结合特性，因而可通过多种机制调控细胞的生理过程及代谢。作用机理表现为：阻断靶蛋白的活性部位阻断细胞内蛋白－蛋白相互作用干扰细胞内靶蛋白的转运促使靶蛋白降解六、抗原化抗体〔antigenizedantibody,AbAg〕AbAg是应用基因工程技术，把编码蛋白质抗原表位的核苷酸片段插入重链CDR3序列中进行表达，从而产生具有天然抗原表位构象和免疫原性的新型抗体。今后抗体药物开展的方向寻找新的靶抗原基于抗原立体结构设计抗体基于抗原-抗体相互作用设计小分子抗体模拟物最理想的单克隆抗体100%人源人类免疫系统自然产生25年来的全人抗体的尝试鼠骨髓瘤不适合与人B细胞融合稳定性差抗体产量低非洲淋巴细胞瘤病毒(EBV)保存抗体分泌细胞细胞株不稳定抗体的产量低不能特异性地保存抗体分泌细胞很难获得人类骨髓瘤细胞株成功建立人骨髓瘤细胞系，人源抗体进入新的里程用途：能稳定的保持人B细胞分泌抗体的能力创造人：英国剑桥大学的DrKarpas教授意义：1在整体水平上研究人类产生抗体2开创人类抗体基因组学的研究评价：1诺贝尔奖得主DrMilstein推荐发表在PNAS2世界权威杂志“科学〞发表了新闻评述3剑桥大学开了新闻发布会未来单抗开发的完美方案从治疗靶子生产高亲和力全人抗体全人抗体挑战靶分子的筛选开发未知抗原的治疗用抗体42已批准上市的单抗适用病症靶抗原抗体名称抗体来源临床阶段移植排斥大肠癌冠心病淋巴瘤移植排斥炎症性肠病、类风湿CD317-1A血小板受体ⅡbⅢaCD20CD25TNF-аOKT3PanorexReoProRituxanSimulectRemicade鼠单抗鼠单抗人－鼠嵌合抗体人－鼠嵌合抗体人－鼠嵌合抗体人－鼠嵌合抗体19861995(德国)1994199719981998、199943适用病症靶抗原抗体名称抗体来源临床阶段移植排斥乳腺癌RVS感染AMLCLLCD25HER-2RSVF蛋白CD33CD52ZanapaxHerceptinSynagisMylotargCAMPATH人源化抗体人源化抗体人源化抗体人源化抗体－化疗药物交联物人源化抗体1997199819982000200144正在进行临床开发中的基因工程抗体适用病症靶抗原抗体名称抗体来源临床阶段银屑病IL－8CD11a(IgG1)ICAM-3CD80CD2CD3ABX－IL8Anti-CD11aICM3IDEC-114MEDI-507Smartanti-CD3Human(人源)Humanized(人源化)HumanizedPrimatizedHumanizedHumanized(IgG)ⅡⅠ，Ⅱ临床前ⅠⅠⅠ/Ⅱ45适用病症靶抗原抗体名称抗体来源临床阶段风湿性关节炎Complement(C5)TNF-аTNF-аTNF-аCD4CD45G1.1D2E7CDP870InfliximabIDEC-151MDX-CD4HumanizedHumanHumanized(Fab)Chimeric(IgG1)(嵌合)Primatized(IgG1)Human(IgG)ⅡⅢⅡFDA批准（1999）ⅡⅠ46适用病症靶抗原抗体名称抗体来源临床阶段克罗恩病，节段性回肠炎溃疡性结肠炎自身免疫病TNF-аTNF-аа4ß7CD4CD3InfliximabCDP571LDP－02OrthoCloneOKT4ASmartanti-CD3Chimeric(IgG1)Humanized(IgG4)HumanizedHumanized(IgG)HumanizedFDA批准（1998）ⅡⅡⅡⅠ/Ⅱ47适用病症靶抗原抗体名称抗体来源临床阶段系统性红斑狼疮多发性硬化症C5CD40LCD40LComplement(C5)VLA-4CD40L5G1.1AntovaIDEC-1315G1.1MEDI-507AntegrenIDEC-131HumanizedHumanized(IgG)HumanizedHumanized(IgG)Humanized(IgG)HumanizedⅠⅡ(继续)ⅡⅠ/ⅡⅡⅡ48适用病症靶抗原抗体名称抗体来源临床阶段自身免疫出血性病症气喘/变态反应CD64(FcgR)IL-5IL-5IL-4IgECD23MDX-33SCH55700SB-240563SB-240683rhuMab-E25IDEC-152HumanHumanized(IgG4)HumanizedHumanizedHumanized(IgG1)PrimmatizedⅡⅡⅡⅡⅢⅠ49适用病症靶抗原抗体名称抗体来源临床阶段移植物抗宿主疾病同种异体移植排斥CD147CD2CD2CD3CD3ABX-CBLBTI-322MEDI－507Orthoclone/OKT3SMATanti-CD3Murine(IgM)(小鼠)Rat(IgG)(大鼠)HumanizedMurine(Ig2a)HumanizedⅢⅡⅠ/ⅡFDA批准（1996）Ⅰ/Ⅱ50适用病症靶抗原抗体名称抗体来源临床阶段同种异体移植排斥CD25CD25ß2-integrinCD4CD147ZenapaxSimulectLDP-01OKT4AABX-CBLHumanized(IgG1)Chimeric(IgG1)Humanized(IgG)Humanized(IgG)Murine(IgM)FDA批准（1997）FDA批准（1998）Ⅰ/ⅡаⅡⅢ51适用病症靶抗原抗体名称抗体来源临床阶段同种异体移植排斥中风青光眼抗凝血剂CD40LCD18ß2-integrinTGF－ß2FactⅦAntovaAnti-LFA-1LDP-01CAT-152CorsevinMHumanized(IgG)Murine[F(ab’)2]Humanized(IgG)HumanChimeric(Fab)Ⅰ/Ⅱ(继续)ⅢⅠ/ⅡаⅡⅠ52适用病症靶抗原抗体名称抗体来源临床阶段冠状血管成形术并发症心肌梗死罗氏肉瘤病毒GlycoproteinⅡbⅢareceptorPDGFßRCD18FproteinReoProAbciximabCDP860Anti-CD18SynagisHumanized(IgG)Humanized[F(ab’)2]Humanized[F(ab’)2]Humanized(IgG1)Ⅰ/ⅡаⅡⅡFDA批准（1998）53适用病症靶抗原抗体名称抗体来源临床阶段艾滋病乙型肝炎巨细胞病毒中毒性休克一般癌症Gp120HepBCMVTNF-аCD14VEGFPRO542OstavirProtovirMAK-195(SEGAND)IC14Anti-VEGFCD4fusionHumanHumanMurine[F(ab’)2]?Humanized(IgG1)ⅡⅡ(批准)ⅢⅢⅠⅢ54适用病症靶抗原抗体名称抗体来源临床阶段卵巢癌结肠病肺病头、颈部病变CA12517-1ACellsurfaceantigenAnti-idiotypicGD3epitopeEGFROvaRexPanorexBEC2IMC－C225MurineMurine(IgG2a)Murine(IgG)MerckKGaAChimeric(IgG0Ⅱ/Ⅲ德国批准（1995）ⅢⅢ55适用病症靶抗原抗体名称抗体来源临床阶段乳腺病慢性淋巴细胞白血病急性粒细胞白血病非何杰金淋巴瘤HER2/neuCD52CD33CD20CD22HerceptinCampath1/(LDP03)SmartRituxanLymphoCideHumanized(IgG1)Humanized

(IgG1)M195Chimeric(IgG1)Humanized(IgG)FDA批准（1998）生物制品许可申请蛋白质设计FDA批准Ⅰ/Ⅱ56适用病症靶抗原抗体名称抗体来源临床阶段非何杰金淋巴瘤黑色素瘤HLAHLADR抗id(GD2)*Smart1D10Oncolym(Lym-1)TriGemHumanizedRadiolabelledmurineMurineⅠⅡ/ⅢⅡ57武汉生物制品研究所研制的注射用鼠源性抗人T淋巴细胞CD3抗原单克隆抗体是国内自行研制最早批准上市的抗体；北京百泰生物与古巴合作开发的I类癌症治疗新药“重组人源化抗人表皮生长因子受体单克隆抗体〞(商品名：泰欣生)是我国批准的第一个人源化单克隆抗体药物；58第四军医大学、成都华神联合研制的美妥昔单抗注射液(商品名：利卡汀)是全球第一个用于治疗原发性肝癌的药物，也是我国第一个具有自主知识产权的抗体类药物。噬菌体展示系统PhageondisplayExponentialgrowthinpublicationsreferringtophagedisplay.ThenumberofMedlinecitationscontainingtheterms‘phage’and‘display’areplottedagainsttheyearofpublication.TIBTECHNOVEMBER1999(VOL17).OfNeedlesandHaystacks噬菌体展示系统Phageondisplay•••噬菌体展示原理

–噬菌体展示定义、分类

–简介噬菌体及淘选过程噬菌体展示应用商业化噬菌体展示系统表型——基因型展示肽——编码基因什么是噬菌体展示是一项筛选技术，将外源多肽或蛋白与噬菌体的衣壳蛋白融合表达，融合蛋白展示在病毒颗粒的外表，而编码该融合子的DNA那么位于病毒粒子内。使大量多肽与其DNA编码序列之间建立了直接联系，使各种靶分子〔抗体、酶、细胞外表受体等〕的多肽配体通过淘选得以快速鉴定。Smith在1985年首次证实外源DNA可以插入丝状噬菌体基因III中，并与pIII蛋白融合展示。

SmithGP.Science1985;228:1315-7噬菌体展示技术PhageDisplayTechnologyWhatcanbedisplayed?Proteinsfrom6-300aaShortpeptidesAntibodyfragmentscDNAlibraryenzymes1Panlibrarywithimmobilizedtargets2Washoffunboundphage3Eluteboundphage4Amplifyovernight5Panelutedphage6Isolateindividualcolony3-4©2004MontaropYamabhaiCellFree展示系统DisplaySystem

PhageDisplay CellBased CellSurfaceDisplayRibosomeDisplaymRNADisplay根据噬菌体不同根据载体不同根据文库不同PhageLibrary噬菌体展示系统的分类Classificationofphagedisplaysystems根据载体不同VectorTruePhagePhagemid根据噬菌体不同PhageM13,f1,fdT7,T4,lamda根据文库不同Library随机肽库cDNA文库

抗体文库 蛋白质文库SchematicrepresentationofM13Phage SchematicrepresentationofT7Phage种为结构蛋白质。 与展示密切相关的有两种结构蛋白质。

DNA在细菌内滚环复制，细菌不被裂解，但生长速度减慢，并且分泌大量噬菌体颗粒。

M13噬菌体的组成和结构

StructureofM13filamentousphage丝状噬菌体：M13、f1和fd。单链DNA病毒,6407bp。基因组编码11种蛋白质，其中5SchematicrepresentationofM13PhageLifeCycleofM13pIII蛋白结合于E.Coli的F纤毛; 细菌的Tol蛋白复合体解聚噬菌体的衣壳蛋白，转运至胞浆〔再用〕;病毒ssDNA进入细菌的胞浆合成dsDNA；

以dsDNA为模版合成所有的病毒蛋白，且通过滚环复制合成组装病毒所需的ssDNA。第一代噬菌体在感染10分钟后出现在培养液中〔37oC〕。感染后1小时内平均每个细胞分泌1000个噬菌体。次要衣壳蛋白pIIIBRIEFINGSINFUNCTIONALGENOMICSANDPROTEOMICS.VOL1.NO2.189–203.JULY2002406aa组成，5个拷贝，位于噬菌体的尾部。由三个功能区组成：N1穿膜区：作用于细胞膜上的TolA蛋白；与噬菌体的入侵有关。N2受体结合区：负责结合F菌毛。CT疏水区：组装前黏附在细菌内膜上；与噬菌体组装终止有关。G1、G2:甘氨酸片段，在感染过程中，增加各个功能域之间的灵活性。InfectionofE.colibyFfbaceriophage主要衣壳蛋白pVIII每个病毒子含约2700个拷贝，约10%能有效地融合外源多肽或蛋白。以pIII融合子方式表达的多肽是低价的，而以pVIII融合子方式表达的多肽那么是高价的〔每个病毒子~200个拷贝〕。这种高价pVIII展示所增加的亲和力有利于筛选到亲和力非常低的配体，而低价pIII展示那么将筛选限制在具有较高亲和力的配体上。所有Ph.D.文库都是pIII融合方式〔每个病毒子展示5个拷贝的外源多肽〕。Smithetal.(1997)Chem.Rev.97,391-410phagemidvectors

Typesofphagedisplay systempVIII展示的多肽比较小，如果太大会影响噬菌体壳蛋白的组装。pIII只要不影响感染，可以展示300aa的多肽。噬菌质粒能展示的蛋白已经达到86kDa。噬菌体质粒－方便克隆、增强遗传稳定性Phagedisplaywithphagemidvectors噬菌体质粒特征：携带有欲在噬菌体上融合展示的蛋白基因，没有其他噬菌体基因。有质粒复制起点(322ori)和噬菌体复制起点(f1ori－用于合成ssDNA)。有包装序列信号〔packingsignal〕。有供筛选的抗生素标记基因。Helperphage：提供噬菌体质粒复制、合成ssDNA和病毒包装所需要的所有蛋白和酶〔f1oridefect)。包装后的噬菌体包含有两种不同来源的成份：噬菌体质粒和Helperphage。多价展示？单价展示？Polyvalentormonovalentdisplay?展示价位〔Displayvalency)：噬菌体外表展示的多肽的拷贝数。展示价位不同所筛选的分子亲和力就会不同。用噬菌体质粒时，以pIII展示为例：<10%病毒展示为单价，非常少量的展示为两个拷贝，绝大多数只展示野生型pIII。Themajordisplayingspeciesismonovalent,butmostparticlesdonotdisplayatall.TruephagePhagemid多价展示单价展示筛选到的分子亲和力相对低亲和力高极少或无未展示的噬菌体

*大部分是未展示的噬菌体高拷贝数增加了抗原性可能会影响噬菌体的组装和增殖易克隆，遗传稳定性好改进helperphage•••••pJuFo噬菌质粒中参加了JunandFosLeuZipper基因两个基因都以PelB作为signalsequence，以lac作为promoter/operator。NH2-pelB+JunLeuzipper+C-terminaldomainpIII-COOHNH2-pelB+FosLeuzipper+cDNA-product–COOHJun和Fos通过二硫键形成异源二聚体theleaderinenzymetechnology展示cDNA文库SelectionfromcDNAlibraries

Carmerietal.Gene1993theleaderinenzymetechnology淘选Findingtheneedleinthehaystack:Screening

phagedisplaylibraries建立噬菌体展示库淘选噬菌体展示库分析克隆theleaderinenzymetechnology

淘选的方法－亲和淘选••直接包被法淘选法： •优点：简单直接。 •缺点：偶尔会导致配体结合位点难以进入 •可能是由于分子的立体封阻 •或者是靶分子外表的局部变性而引起液相法：先将噬菌体库在液相中与靶分子进行预结合，然后将噬菌体-靶分子复合物亲和捕获于亲和介质上，如：链霉亲和素包被的外表。theleaderinenzymetechnology噬菌体肽库与靶分子相互作用洗涤去未结合的或非特异性结合的噬菌体将特异性结合的噬菌体洗脱下来三轮淘选后，克隆测序噬菌体肽库淘选示意图：亲和筛选theleaderinenzymetechnology测定抗FLAGM2单克隆抗体的抗原决定簇对每轮淘选所得到的克隆测序，结果清晰地显示核心抗原决定簇是DYKXXD,其中X可以是任意氨基酸。为了确定FLAG抗原决定簇序列DYKDDDDK中哪一个氨基酸是抗体结合所必需的，将单克隆抗体包被于96孔板，对Ph.D.-7展示文库进行三轮淘选。theleaderinenzymetechnology噬菌体展示系统Phageondisplay•••噬菌体展示原理噬菌体展示应用商业化噬菌体展示系统theleaderinenzymetechnology噬菌体展示的应用••••抗原表位分析制备特异性抗体制备疫苗、多价疫苗构建新型的生物催化剂如Renetal(1997)将T4DNA连接酶展示于T4噬菌体，所表达的融合蛋白能够高效连接黏性或者平末端。有可能把催化某一代谢途径的多种酶展示到噬菌体上，制造人工的多酶复合体。或者把成百上千个酶分子的活性位点展示到同一个噬菌体颗粒上，制造superenzyme。theleaderinenzymetechnology噬菌体展示的应用筛选酶抑制剂是寻找抑制酶活性肽段的理想工具。Dennis从肽库中筛选到非竞争性地抑制FVIIa活性的肽段。CoagulationCascade.AcurrentsimplifiedviewofthecoagulationcascadeinitiatedbytheTF•FVIIacomplexisshown.theleaderinenzymetechnology

噬菌体展示的应用蛋白质－蛋白质相互作用噬菌体cDNA文库与芯片相结合(a)合成噬菌体cDNA文库。(b)生物淘选。(c)铺板，挑克隆入微孔板，为制备芯片做准备。GeneralselectionschemeforcDNAexpression-productsdisplayedonphagesurface.Konthuretal2003TARGETSVol.2,No.6261-270.theleaderinenzymetechnology

噬菌体展示的应用噬菌体cDNA文库与芯片结合(a)淘选后的文库，制作DNA芯片。(b)确认插入片段的种类。(c)生物化学方法进一步确认。SchemefortheelucidationofthecomplexityofenrichedcDNAexpression-productphagedisplaylibraries.

Konthuretal2003TARGETSVol.2,No.6261-270.theleaderinenzymetechnology用病人IgE血清对6种不同的cDNA文库淘选，5轮后，挑出38,000个克隆，鉴别了233种蛋白，其中47种为，186种是新的过敏源。烟曲霉(Aspergillusfumigatus)已成为临床上仅次于白色念珠菌的一种重要的条件致病真菌。草本枝孢(小麦黑霉病菌)Cladosporiumherbarum鸡腿蘑〔Coprinuscomatus〕皮屑牙胞菌(Malasseziafurfur)花生和人肺组织Crameri,R.etal.(2001)Tappingallergenrepertoiresbyadvanced

cloningtechnologies.Int.Arch.AllergyImmunol.124,43–47噬菌体展示的应用应用举例theleaderinenzymetechnology噬菌体展示系统Phageondisplay•••噬菌体展示原理噬菌体展示应用商业化噬菌体展示系统theleaderinenzymetechnologyCommercialsuppliersofphagedisplayvectorsandlibrariestheleaderinenzymetechnologyPhDTMPhageDisplaySystem用于PhD中的噬菌体是M13KE由M13mp19衍生的溶源性噬菌体。随机７肽与次要衣壳蛋白N-端融合，经细胞膜分泌，噬菌斑模糊不透明，用有α-互补的宿主菌在含Xgal/IPTG的平板上可呈蓝斑。融合蛋白表达时N端有一段信号肽前导序列，蛋白分泌后前导序列被切除，使随机七肽直接展示于成熟蛋白的N端。theleaderinenzymetechnology噬菌体展示肽库E.coliER2738宿主菌-28gIII测序引物〔用于人工测序〕-96gIII测序引物〔用于自动测序〕链霉亲和素Streptavidin生物素试剂盒组成theleaderinenzymetechnology

文库克隆载体可以买到吗？••••用来构建所有这三种Ph.D.文库的载体，M13KE〔#E8101S〕，是可以购买到的。M13KE是M13mp19的衍生株，其pIII基因的5’端构建了限制性酶切位点，用户可以将设计好的人工基因盒〔syntheticcassette〕插入此处构建自己的肽库。因为M13KE是噬菌体，而不是噬菌粒载体，所以在已加工的病毒子上所有5个拷贝的pIII蛋白均携带有展示肽序列。另外，大于20-30个氨基酸的展示多肽会影响噬菌体的感染力，所以此载体仅适合展示短的多肽。theleaderinenzymetechnologyM13K07HelperPhage••••由M13衍生而来。在M13复制起始点处，插入有卡那霉素抗性基因。能在无噬菌质粒的情况下复制。当有噬菌质粒时，由于噬菌质粒含有野生型M13或者f1复制起始点，因此，单链噬菌质粒的DNA会被优先包装并分泌。不能用M13KO7作为克隆载体，如果要克隆噬菌体展示库，建议使用M13KE噬菌体克隆载体。theleaderinenzymetechnology

M13噬菌体与其他噬菌体比 较有什么优点？•••M13噬菌体为非裂解性噬菌体〔溶源性〕，周质内组装，经细胞膜分泌，噬菌斑的形成不是由于菌体裂解而是由于细胞生长力减弱所致，因此噬菌斑是浑浊的而不是清亮的，用有α-互补的宿主菌在含Xgal/IPTG的平板上可呈蓝斑。由于M13噬菌体在增殖期间不裂解宿主菌。简化了噬菌体纯化步骤，只用简单的PEG沉淀方法就足以将噬菌体与其他所有污染的细胞蛋白分开。而其他用于噬菌体展示的噬菌体如：T7,T4和Lambda噬菌体均为裂解性噬菌体，每轮淘选之间都需要花时间进行纯化，以防止淘选扩增的噬菌体污染有细胞蛋白〔如：有些蛋白酶类物质会在淘选时将靶分子降解掉〕。theleaderinenzymetechnologyNEB的噬菌体文库能展示cDNA文库吗？••不适合于cDNA文库展示，因为这种表达需要使目的蛋白序列在前导序列〔蛋白分泌所需要的〕和噬菌体包膜蛋白pIII或pVIII的N端序列之间保持读码框架一致，这样产生的M13cDNA文库中，能有效表达的克隆会非常少。Novagen的T7Select噬菌体展示系统可以将cDNA插入片段融合在包膜蛋白的C末端，但是该系统利用的是裂解性噬菌体T7而不是溶源性噬菌体M13，淘选扩增的噬菌体可能会污染有细胞蛋白，故需要化更多的时间进行噬菌体的纯化。货号产品名称规格价格E8100SPh.D.-7噬菌体表面展示试剂盒10次淘选E8110SPh.D.-12噬菌体表面展示试剂盒10次淘选E8120SPh.D.-C7C噬菌体表面展示试剂盒10次淘选E8101SPh.D.多肽展示克隆系统20μgtheleaderinenzymetechnologyNEB提供的三种随机肽库theleaderinenzymetechnologyRecombinantPhageAntibodysystem用于克隆、表达和检测小鼠抗体基因噬菌质粒-Helperphage系统抗体片段克隆于噬菌质粒与pIII蛋白融合展示在M13噬菌体外表Helperphage-M13KO7theleaderinenzymetechnologyT7SelectPhageDisplaySystemfromNovagenNovagen提供：DisplayVectorPre-MadeLibrariestheleaderinenzymetechnologyT7噬菌体结构StructureoftheT7phageparticle(Source:Novagen) 裂解型噬菌体，含有双链DNA(40kb,55gene,3classes)。 Lifecycle30minat30°C 头部：20面体〔icosahedral)，衣壳蛋白有415拷贝〔capsidprotein,gene10)，分别由60个6聚体和11个5聚体组成。 尾部：连接头尾的颈圈〔connector)、1个短小的圆锥型尾部和6个尾丝。theleaderinenzymetechnologyGeneticmapofT7衣壳蛋白表达受以下因素的调控：

T7RNA聚合酶启动子φ10(promoter)终止子Tφ〔terminator)翻译起始因子s10〔translationinitiationsignals)衣壳蛋白有两种形式：10A(344aa)和10B〔397aa〕T7Select载体：10BtheleaderinenzymetechnologyT7SelectvectorfeaturesT7Select®415-1b:衣壳蛋白基因含有野生型的调控信号：φ10promoter,Tφterminator,ands10translationinitiationsignals。T7Select10-3b：Thes10translationinitiationsignal(ribosomebindingsite)wasmodifiedtoproducethemid-copyvector。T7Select1-2:φ10ands10wereremovedtofurtherreducecapsidgeneexpression。theleaderinenzymetechnology噬菌体展示系统Phageondisplay•••噬菌体展示原理噬菌体展示应用商业化噬菌体展示系统theleaderinenzymetechnology

测序模板的快速纯化1.噬菌斑扩增，在第一步离心后， 将500µl含噬菌体上清转入一新 鲜离心管。2.加200µlPEG/NaCl，颠倒混匀， 室温放置10min。3.离心10min，弃上清液。4.短暂离心，小心吸去剩余上清。5.沉淀物彻底重悬于100µl碘化 物缓冲液中，