蛋白质和蛋白质组学全册配套完整课件3

蛋白质组学彭宣宪教授ChapterIAnIntroduction1.Keyconcepts2.Thedevelopmentofproteomics3.Thecontentsofproteomics4.Thetechnologyandmethods5.Thetendencyfordevelopment1.KeyconceptsGeneThegenomeistheblueprintofanorganismGenomeGenomesGeneRNAProteinProteinProteomeProteomicsCellchrommsomesProteomicsRegulationofproteinexpression

Scenario1:canbeanalyzedbymicroarraytechnologyDNARNAProteinTranscriptionTranslationx1x4DNARNAProteinTranscriptionTranslationx3StimulusDNARNAProteinTranscriptionTranslationx3StimulusScenario2:canbesolvedbyproteomicstechnologyDNAtechnique:Cloning,sequencing

RNAtechnique:Traditionalnorthernblotting

IsolatedRNAElectrophoresisBlotting1.Estimatedtimetogetresults:2-3days2.ExpressedGene(mRNA)checked:1-8species3.Accuracy:Lowtomoderate

ProbingDevelopingLabellingonprobes!!RNAtechnique:High-throughputmethod:Microarray

LabelingonsamplemRNAasprobecDNAoroligonucleotidespottedonchips

1.Estimatedtimetogetresults:5-7days2.ExpressedGene(mRNA)checked:thousands3.Accuracy:moderatetohigh

dataanalysisClusteredgenesClusteredexperimentsAndnowfortheproteomeAbbottA.

2001;409,7471gene=1

protein?

1geneisnolongerequaltooneprotein

Infact,thedefinitionofageneis

debatable..(ORF,promoter,pseudogene,

geneproduct,etc)

1gene

=

howmanyproteins

?Co-andPost-translationalmodification

Co-translationalmodifiedPost-translationalmodifiedEF-Tuhas41proteinspotsWhyProteomics?(summary)Annotationofgenomes,i.e.functionalannotationGenome+proteome=annotationProteinFunctionProteinPost-TranslationalModificationProteinLocalizationandCompartmentalizationProtein-ProteinInteractionsProteinExpressionStudiesTypesofProteomicsProteinExpressionQuantitativestudyofproteinexpressionbetweensamplesthatdifferbysomevariableStructuralProteomicsGoalistomapoutthe3-DstructureofproteinsandproteincomplexesFunctionalProteomicsTostudyprotein-proteininteraction,3-Dstructures,cellularlocalizationandproteintranslationmodifications(PTMs)inordertounderstandthephysiologicalfunctionofthewholesetofproteome.TraditionalProteintechnique:

peptidesequencingProteinpurification:necessaryProteinidentified:1perpurifiedsampleCutdesiredbandPeptideNterminalsequencingDatabasesearchingforhomologHighthroughputtechnique:

2Delectrophoresis+Massspectrometry

Proteinpurification:notnecessaryProteinidetified:uptothousandsperunpurifiedsample蛋白质组学vs传统的蛋白质研究个体 整体分析静态性质 比较动态变化孤立个体相互作用结构功能小规模、非连续高通量、自动化整体性pH4.5pH7.0动态性种属；机体；器官；组织；细胞同一机体发育阶段；生理状态时间；地点；环境蝴蝶的变化同一基因组表现出不同的表型，不同的表现型具有不同的蛋白质组2-DPAGEgelsoftheextracellularproteinsafterculturingthethermophilicbacteriumB.stearothermophilusP1inthepresenceof0.5%(v/v)oliveoilat65℃).Dyingwithsilverstaining.12h24h36h48h72h96hpH3pH10pH3pH10

网络性Howtocarryoutproteomics

FieldsS.ProteomicsinGenomeland2001;291,1221-1224

基因组时代→后基因组时代

研究重点的转移及其标志

功能基因组学的主要任务2.Thedevelopmentofproteomics1860Identifiedacidandbasicproteincomponentsincellnuclei

Friedrich

Miescher1967Proteinsequencingdefinedandautomated(EdmanandBegg)1970KenrickandMargolisisoelectricfocusingandgradientgelelectrophoresis:atwo-dimensionaltechnique

1972BernsteinetalTheProteinDataBankwithacollectionoftenX-raycrystallographicproteinstructuresTwomaintechniquesforsolvingproteinstructures:x-raycrystallographyandNuclearMagneticResonance(NMR).1975O'FarrellThemodernformof2-Delectrophoresisofproteins1981Useof2-Dpolyacrylamidegelelectrophoresis(2-DPAGE)asthecoremethodologyforpharmaceuticalandtoxicologicalstudies(Anderson)1986Creationofthefirstprotein-sequencedatabase--SWISS-PROT--atUniversityofGeneva,Switzerland1987Formationofthefirstproteomicscompany-LargeScaleBiologyCorporationGoal:

develop,manufactureandcommercializeplant-madepharmaceuticalproteinsandvaccines

1995WilkinsDefinitionoftheproteome1997WilkinsetalPublicationofthefirstbookonproteomics2000MarchPublicationofthemostcompleteproteomeofawholeorganism,thebacteriumMycoplasmagenitalium2001Sequencingofthehumangenomecompleted2001年的Science杂志把蛋白质组学列为六大研究热点之一1996年澳大利亚建立了世界上第一个蛋白质组研究中心：Australia

Proteome

Analysis

Facility

(

APAF

)丹麦、加拿大、日本、瑞士、美国先后成立了蛋白质组研究中心。国际美国国立癌症研究院（NCI）投资1000万美元建立肺、直肠、乳腺、卵巢肿瘤的蛋白质组数据库。NCI和FDA共同投资数百万美元建立癌症不同阶段的蛋白质组数据库。英国建立三个蛋白质组研究中心对已完成或即将完成全基因组测序的生物体进行蛋白质组研究。

1997年第一次国际“蛋白质组学”会议1998年美国旧金山第二届国际蛋白质组学会议1999年1月英国伦敦应用蛋白质组会议2003年10月北京第三届国际蛋白质组学会议。2009年9月加拿大多伦多第八届国际蛋白质组大会2010年澳大利亚悉尼第九届国际蛋白质组大会2014年西班牙Madrid,第十三届国际蛋白质组大会国际“蛋白质组学”会议1998年启动了蛋白质组学研究2003成立了中国人类蛋白质组组织（CHHUPO）至2013年已举办12届中国蛋白质组学学术大会2013年9月在重庆召开了第12届全国蛋白质组学会议。国内科技部已将疾病蛋白质组研究列入我国“973”计划项目和“863”计划项目；国家自然科学基金委员会也将“蛋白质组研究”列为重点项目。在鼻咽癌、白血病、肝癌和肺癌蛋白质组以及细菌外膜蛋白质组学研究方面取得了较大的进展。从文献量看国际和中国新药研究中蛋白质组学发展情况(1995-2004)Publicationsin2004Publicationsin2004蛋白质组学研究的重要性1．蛋白质执行着几乎所有生物功能的控制2．蛋白质和蛋白质之间的相互作用控制着绝大多

数的细胞发育过程3．疾病是在蛋白质水平上发生并被处理4．蛋白质是药物的“靶子”或被制成药品3.Thecontentsofproteomics蛋白质组学研究角度从蛋白质化学角度对蛋白质进行研究2.从生物学角度对差异蛋白质进行研究蛋白质组学研究的任务1．诠释基因功能2．寻找功能蛋白质3．研究生理和病理现象4．开发蛋白质资源5．进行基础研究分析－计算机图像分析与大规模数据处理技术三大支撑技术分离－双向电泳技术鉴定－质谱技术4.ThetechnologyandmethodsCommonprocessforproteomicsresearch

1.双向凝胶电泳(一)蛋白质分离技术第一项等电聚焦（等电点信息）第二项为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（分子量信息）2.两维/多维分离技术亲和色谱、反相色谱、毛细管电泳技术分离度高、耗样量少、易于与质谱检测技术实现在线连接

FirstDimensionChromatofocusingSecondDimensionReversed-PhaseHPCFchromatofocusingcolumnHPRPreversed-phasecolumnSolvents:StartBuffer(pH8.5)1MNaClEluentBuffer(pH4.0)WaterSolvents:A=0.10%TFA-WaterB=0.08%TFA-AcetonitrileFlowrate=0.2mL/minFlowrate=0.75mL/minColumntemperature=ambientColumntemperature=50°CGradient=pH8.5-4.0Gradient=0-100%Bin30minutesFractioncollection:0.1~0.3pHintervalsduringpHgradientand5minforotherregionsFractioncollection:timeintervalorpeakDetection:pHandabsorbanceat280nmDetection:absorbanceat214nmProteomeLabPF2DSystem:1stand2nd-DimensionSeparationMethods无孔硅胶(1.5um)反相色谱柱(3.3x0.46cm)色谱聚焦柱(25x0.2cm)进样量是毫克级(可达5-10mg)等电点和疏水性分离的结合来分离完整蛋白,同时又是一个开放平台,可与毛细管电泳仪和目标蛋白快速鉴定系统共享控制系统,分离后收集的所有组分都在溶液中，分离的蛋白覆盖面广，回收率高,特别有利于低丰度蛋白质的分离,获得的蛋白质完整性好。总的分辨率高、分离速度快、重复性好、简单自动化独有的软件系统/最佳的重现性，实现蛋白质差异显示和差异蛋白质回收。获得在溶液中的高度简化的蛋白质组分，减少污染药效学研究

(Dosage/Time)ColonCancerCellLine123412341234****

未处理药物处理差异3.蛋白芯片技术1958年，诺贝尔化学奖（二）蛋白质分析鉴定技术－生物质谱FSanger研究胰岛素结构时因发明蛋白质测序生物大分子质谱技术发明美国科学家芬恩J．B，Fenn日本科学家田中耕一K．Tanaka瑞士科学家kurtWuthrich2002年诺贝尔化学奖1.两种功不可没的软电离离子化技术基质辅助激光解吸电离（Matrix-assistedLaserDesorptionIonition,MALDI）电喷雾电离（ElectrosprayIonization,ESI)2.生物质谱成为分析鉴定蛋白质的理论基础质谱主要用于测定蛋白质的一级结构，包括分子量、肽链氨基酸排列及多肽或二硫键的数目和位置。序列测定三种方法肽质量指纹图谱

（PeptideMassFingerprint,PMF）肽段碎片离子鉴定法

(PeptideFragmentsIdentification)多肽序列标签法

(PeptideSequenceTag,PST)3.生物质谱技术的发展MSMS-MS基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术（MALDI-TOF-MS）ESI-MS技术MALDI-TOF-TOFMALDI-Q-TOFESI-MS-MS（三）蛋白质组学相关的生物信息学2-D数据库支持质谱数据的蛋白质鉴定数据库分析蛋白与蛋白相互作用的数据库5.Thetendencyfordevelopment

Rual,etal.Nature,2005,437,1173Protein-proteininteractionsNetworkregulationNetworkregulationMetabolomicsSystemsbiology谢谢！ChapterIIThePreparationofProteins79一、样品制备原则二、样品制备流程三、亚蛋白质组成分的提取四、特殊样品的制备五、蛋白质含量测定六、出现问题和解决办法80蛋白质样品的制备是蛋白质组分析的基础

目的分辨率有限目前双向电泳（1000-5000个spot)，而样品中的蛋白种类可达到10万种以上浓缩样品，增加蛋白质拷贝：大部分蛋白质拷贝数都少。81蛋白质样品制备原则应使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态（包括多数疏水性蛋白），且制备方法应具有可重现性。防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀。防止在样品制备过程中发生样品的抽提后化学修饰（如酶性或化学性降解等）。完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白，从而保证待研究蛋白的可检测性。82蛋白质样品制备步骤分离：将生物提取液中的蛋白质与其他物质进分开提取：从总的蛋白质溶液中提取目标蛋白纯化：从总的蛋白质中或从目标蛋白质中分离出杂质使蛋白质单一化83SampleCategoriesPlasmaSerumBloodSamplesDiluteBiofluids:Urine,amnioticfluidBiofluid(nolysis)BacteriaYeastAnimal

TissuesandTumorsAnimalandPlantCellCulturesPlantTissuesTissueorCell(requireslysis)SampleType84可溶性样品

固体组织样品

细胞不同样品的基本处理方法样品的分级处理通过采用亚细胞分级、液相电泳和选择性沉淀等方法对蛋白质样品进行分级处理，可降低样品的复杂性并富集低丰度蛋白质。当前最简单有效的处理是采用分级抽提，按样品溶解度不同进行分离。85FrequentlyappliedtreatmentsCellwashingCelldisruptionRemovalofcontaminantMicrodialysis

ElectrophreticdesaltingPrecipitationmethodsProteaseinhibitor861.CellwashingToremovecontaminantmaterial.FrequentusedbufferPBS:phosphatebuffersaline,sodiumchloride,145mM(0.85%)inphosphatebuffer,150mMpH7.2Trisbuffersucrose(10mMTris,250mMsucrose,pH7,2)Enoughosmoticumtoavoidcelllysis872.CelldisruptionGentlelysismethod

Osmoticlysis(culturedcells)Suspendcellsinhypoosmoticsolution.Repeatedfreezingandthawing(bacteria)FreezeusingliquidnitrogenDetergentlysis(yeastandfungi)Lysisbuffer(containingureaanddetergent)SDS(havetoberemovedbeforeIEF)Enzymaticlysis(plant,bacteria,fungi)Lysomzyme(bacteria)Celluloseandpectinase(plant)Lyticase(yeast)88Vigorouslysismethod

Sonicationprobe(cellsuspension)Avoidoverheat,coolonicebetweenburst.Frenchpressure(microorganismwithcellwall)Cellsarelysedbyshearforce.Mortarandpestle(solidtissue,microorganism)Grindsolidtissuetofinepowderwithliquidnitrogen.Samplegrindingkit(forsmallamountofsample)Forprecioussample.Glassbead(cellsuspension,microorganism)Usingabrasivevortexedbeadtobreakcellwalls.89

Keyvariableforsuccessfulextraction

fromcrudematerial1.Themethodofcelllysis2.ThecontrolofpH3.Thecontroloftemperature4.Avoidanceofproteolyticdegradation903.RemovalofcontaminantsMajortypeofcontaminants:DNA/RNALipidspolysaccharidesSolidmaterialSalt91DNA/RNAcontaminantDNA/RNAcanbestainedbysilverstaining.Theycausehorizontalstreakingattheacidicpartofthegel.TheyprecipitatewiththeproteinswhensampleapplyingatbasicendofIEFgelHowtoremove:1.precipitationofproteins2.DNase/RNasetreatment3.sonication(mechanicalbreakage)4.DNA/RNAextractionmethod(phenol/chroloform)92RemovalofothercontaminantsRemovaloflipids:>2%detergentPrecipitationRemovalofpolysaccharides:EnzymaticprocedurePrecipitationRemovalofsolidmaterialCentrifugationRemovalofsaltsMicrodialysisPrecipitation934.MicrodialysisSpeciallydesignforsmall

volumesamplesMembranecut-offisabout8000DaDrawbacks:1.Timeconsuming(someproteasemightbeactiveanddigestproteinsduringthedialysis)2.Someproteinsprecipitationafterdialsis.945.Electrophoreticdesalting

电洗脱Therearesomecasewherethesamplemustnotbedialysed.(halobacterialysate)Someproteinswillgelifdesalted.(Bovinevitreousproteins)

Solutionforabove:lowvoltage(100V)for5hoursbeforeIEFrunning.(A.Gorg,1995)956.PrecipitationmethodsThereasonsforapplyingproteinprecipitationprocedure:1.Concentratelowconcentratedproteinsamples.2.Removalofseveraldisturbingmaterialatthesametime.3.Inhibitionofproteaseactivity.原理：加入适当的试剂使蛋白质分子处于等电点状态或失去水化层，蛋白质的胶体溶液就不在稳定并将产生沉淀。96Fiveprecipitationmethods.1.硫酸铵沉淀（Ammoniumsulfateprecipitation）－中和蛋白质的电荷2.三氯乙酸沉淀（Trichloroaceticacid，TCAprecipitation）－与蛋白质中带正电荷的基团生成不溶性盐3.丙酮沉淀（Acetoneprecipitation）－破坏蛋白质水膜4.三氯乙酸/丙酮沉淀（TCA/Acetoneprecipitation）5.Ammoniumacetate/methodfollowingphenolextraction97AmmoniumsulfateprecipitationProteinstendtoaggregateinhighconcentrationofsalt(saltingout)AddAmmoniumsulfateslowlyintosolutionandstirfor10-30minsHarvestproteinbycentrifugation.LimitationSomeproteinsaresolubleathighsaltconc.AmmoniumsulfateseriouslyaffectIEF.98TCA

precipitationTCAisaveryaffectiveproteinprecipitant.AddTCAtoextracttofinalconc.10-20%.Add10-20%TCAdirectlytotissueorcells.Harvestproteinbycentrifugation.WashaccessTCAbyethanoloracetone.LimitationSometimesthepelletishardtoredissolve.TCAmustremovecomplete.(affectingIEF)Somedegradationormodificationofprotein

occurs99AcetoneprecipitationThemostcommonorganicsolventusedtoprecipitatedproteins,lipidanddetergentremaininsolution.Addatleast3vol.ofice-coldacetoneintoextract.Standoniceforatleast2hours.Harvestproteinbycentrifugation.Removeaccessacetonebyairdrying.LimitationSometimesthepelletishardtoredissolve.Someproteinswouldnotprecipitate.DNA/RNAandglycanalsoprecipitate.100Example,AcetoneprecipitationWithAcetoneprecipitationCrudeextractbylysisbuffer101TCA/acetoneprecipitationThemethodismoreactivethanTCAoracetone

alone.Mostcommonlyusedin2-DE.Suspensionsamplesin10%TCA/Acetonewith0.07%2-mercaptoethanolor20mMDTT.Standon-20Cforatleast45mins.Harvestproteinbycentrifugation.Washthepelletbyacetonewith0.07%2-mercaptoethanolor20mMDTT.Removeaccessacetonebyairdry.LimitationSometimesthepelletishardtoredissolve.TCAmustremovecomplete.(affectingIEF)Somedegradationormodificationofproteinoccurs102PrecipitationwithammoniumacetateinmethanolfollowingphenolextractionThemethodismoresuitableforplantsample

withhighlevelofinterferingsubstanceProteinsareextractedintobuffersaturatedphenol.Precipitatedbyammoniumacetate/methanol.Harvestproteinbycentrifugation.Washwithammoniumacetate/methanolfollowedbyacetone.LimitationComplicated.Timeconsuming.103ACDB823spots757spots969spots899spotsAcetoneIsopropanolTCATCA/AcetoneABDC1047.Proteaseinhibitor抑制蛋白质降解方法强变性剂(8mol／Lurea，10％TCA或2％SDS)低温:蛋白酶低温下无活性高pH:蛋白酶

pH超过9.0的时候失活。因此，在样品裂解液中出现Tris、碳酸钠和载体两性电解质时也可以抑制蛋白降解。蛋白酶抑制剂：105“蛋白酶抑制剂鸡尾酒（proteaseinhibitorcocktail）”1.PMSF(苯甲基磺酰氟)：是一种不可逆抑制剂，常用浓度为1mmol／L，灭活丝氨酸蛋白酶和一些半胱氨酸蛋白酶，但是其局限在于可在水溶液中迅速失活。因此，现用现加效果较好；另外，在二硫苏糖醇（DTT）或者β—巯基乙醇溶液中PMSF的抑制效果可能会减少。因此，含巯基的试剂可在晚些时候加入。2.AEBSF(PefablocTMSC)：通常工作浓度为4mmol／L，作用与PMSF相似，但溶解性较好，且毒性低。但是AEBSF可能改变蛋白的等电点。3.金属蛋白酶抑制剂乙二胺四乙酸、乙二醇双四乙酸(EDTA、EGTA)：通常应用1mmol／L的工作浓度，通过螯合自由的金属离子来抑制金属蛋白酶活性。

106

4.肽蛋白酶抑制剂：亮抑酶肽(leupeptin)，它是可逆性蛋白酶抑制剂，在含DTT的溶液中以低浓度的形式保持活性，抑制一些丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶的活性；胃蛋白酶抑制剂A（pepstatinA），抑制天冬氨酸蛋白酶(如酸性蛋白酶)的活性；抑蛋白酶肽(aprotinin),抑制许多丝氨酸蛋白酶；苯丁抑制素(bestatin)，抑制氨基蛋白酶。但是，这些蛋白酶抑制剂价格昂贵，而且它们是小肽片段，可能会出现在二维电泳图谱中，其中胃蛋白酶抑制剂A在pH=9的时候不能抑制蛋白酶。

5.甲苯磺酰赖氨酰氯甲酮(TLCK)，甲苯磺酰笨丙氨酰氯甲酮（TPCK)：通常作用浓度在0.1~0.15mmol/L,这些相同的成分不可逆抑制许多丝氨酸蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶。

6.Benzamidine：通常作用浓度为1~2mmol/L，抑制丝氨酸蛋白酶。107样品的溶解是2-DE成功分离蛋白质的最关键因素之一。溶解的目标：

1.样品中非共价结合的蛋白质复合物和聚积体完全破坏，从而形成各个多肽的溶解液（否则样品中结合牢固的蛋白复合物可能使2-DE中出现新的蛋白点，相应的表示单个多肽的点的强度会下降）；

2.必须允许可能干扰2-DE分离的盐、脂类、多糖和核酸等物质的去除；

3.保证样品在电泳过程中保持溶解状态。108增加样品溶解性的手段变性剂：通过改变溶液中的氢键结构使蛋白质充分伸展，将其疏水中心完全暴露，降低接近疏水残基的能量域。其典型代表是尿素和硫尿。表面活性剂：经过变性剂处理而暴露蛋白质的疏水基团后，还常需至少一种表面活性剂来溶解疏水基团。常用的表面活性剂有离子去污剂SDS、非离子去污剂TritonX-100和NP-40、两性离子去污剂CHAPS、OBG等。其中CHAPS和SB3-10最好。还原剂：在变性剂和表面活性剂联用条件下，加用还原剂可使已变性的蛋白质展开更完全，溶解更彻底。常用含自由巯基的DTT或-巯基乙醇，以及不带电荷的三丁基膦（TBP）进行还原。109起载体作用的两性电解质：即便在变性剂和表面活性剂存在的情况下，某些蛋白质也需要在盐离子的作用下才能保持其处于溶解状态，否则这些蛋白质在其处于PI点时会发生沉淀。Carrierampholytes的作用在于捕获样品中的少量盐分，从而保证蛋白质的溶解性。应用时，两性电解质的浓度应小于0.2％（w/v)。浓度过高会使IEF的速度降低。另外，为了保证实验的精确性，在选择不同pH范围的IPG胶条时，也应使两性电解质的pH值与之相符合。110样品液的准备ReagentAmount8Murea47mlof8.5stockor24gureain25mlH2O50mMDTTor2mMTBP385mgor500ulof200mMTBPstock4%CHAPS2g0.2%carrierampholytesSeenexttable0.0002%bromophenolblue100ulof0.1%stockddH2OTo50ml111IPGpHRangeBio-LyteAmpholyte(stock)rangeBio-LyteAmpholyte(stock)Conc.(w/v)SampleSolutionVolumePer5mlSampleSolutionVolumePer50ml3-103/1040%25l250l4-74/640%12.5l125l5/740%12.5l125l3-63/540%25l250l4/640%12.5l125l5-85/840%25l250l7-107/940%12.5l125l8/1020%25l250lSuggestedBio-lyteampholytecompositionforIPGuse112ReagentAmount7Murea4.1mlof8.5stockor2.1gureain3mlH2O2MThiourea760mg2mMTBP50ulof200mMTBPstock4%CHAPS200mg0.2%carrierampholytesSeetable0.0002%bromophenolblue10ulof0.1%stockddH2OTo5mlMultiplechaotropicagentsolutionpreparation113ReagentAmount5Murea2.9mlof8.5stockor1.5gureain3mlH2O2MThiourea760mg2mMTBP50ulof200mMTBPstock2%CHAPS100mg2%SB3-10100mg0.2%carrierampholytesSeetable40mMTris24.2mg0.0002%bromophenolblue10ulof0.1%stockddH2OTo5mlMultiplesurfactantsolutionpreparation114组织匀浆

硫酸铵分级离子交换凝胶过滤亲和层析

一种目的蛋白经五个纯化步骤（分别取样）的凝胶电泳图115用超离心技术分离出细胞器、质膜和细胞核等成分，再用适当的蛋白质溶解液进行溶解。其优点是不仅大大减少样品的复杂性，而且可对分离的蛋白质进行亚细胞定位。但该法需要专业仪器，有时会出现假阳性。顺序抽提法：根据细胞蛋白溶解性的差异，用具有不同溶解能力的蛋白溶解液进行抽提的方法。第一步：用Tris碱溶液裂解细胞提取高溶解性蛋白；第二步：把未溶解的pellet用标准IEF样品液溶解提取高疏水性蛋白；第三步：用含复合表面活性剂的蛋白溶解液，最后抽提前两次抽提后不能溶解的膜蛋白约占整个样品的11%（W/W）。三、亚蛋白质组成分的提取116ForveryhydrophobicproteinsMembraneproteinsdonoteasilygointosolution.Alotofoptimizationworkisrequired.1.Thioureaprocedure2.SDSprocedure3.Newzwitterionicdetergentandsulfobetains117Thioureaprocedure7Murea+2Mthiourea(Rabilloud,1998)Pros:Increasespotnumberconsiderably.Cons:Causingartifactspots.

Causingverticalstreakingatacidicarea.118Example,thioureaprocedureLysisbuffer,8MureaLysisbuffer,7Murea+2Mthiourea119SDSprocedureForemergencycase.Upto2%SDScanbeused.HavetodiluteSDSsamplesatleast20fold

withureaananonorzwitterionicdetergentcontainingsolutions.ThemajorreasonsforusingSDS:1.Formationofoligomerscanbeprevented2.Dissolvedtoughcellwallssamples(withboiling)3.Dissolvedveryhydrophobicproteins120Newzwitterionicdetegentandsulfobetains

Threemajortypesofdetergent1.NonionicdetergentTritonx-100,Tween20,Brij-352.IonicdetergentSDS,CTAB,Digitonin3.ZwittergentCHAPS,CHAPSO,Zwittergent3-08,3-10,3-12…121亚细胞器的分离

亚细胞器的差速离心及密度梯度离心分离

122

细胞分离

激光捕获微解剖(LaserCaptureMicrodissection,LCM)

方法

激光捕获微切割仪

激光捕获微切割流程

123乙烯乙酸乙烯酯膜激光捕获微切割位置

激光捕获微切割结果对比

124低丰度蛋白的分离：尽管增加上样量和提高总蛋白的溶解度能增加分离时的低丰度蛋白的量，但同时增加了高丰度蛋白的负荷，且造成蛋白的叠加效应而影响分离。现常用预分级＋窄pH胶的微制备技术进行分离：即将总蛋白组分成蛋白质组亚群，再用pH梯度小于2个pH单位的IPG胶进行窄pH范围的分离。

四、特殊样品的制备125强碱性蛋白质（如核糖体）的处理：先将蛋白预处理以富集，再用特殊pH梯度的IPG胶条（如pH3－12、4-12或10-12）进行等电聚焦。其中窄范围碱性IPG胶（如pH10-12）的挑战是克服反向、阴极向阳极、电渗流和水平条纹模式，而宽范围的碱性IPG胶（如pH3-12、4-12）等消除了窄范围胶所需要的专门水化液。126极端分子量的蛋白质：小于8kD和大于200kD的蛋白在常规IPG-2D上不易看到，这可能是在Tris/glycine缓冲液中，样品和游离的dodelcylsulfateions持续积累浓缩，与小分子量的蛋白质发生对流混合，产生茸毛状的或模糊的带，从而降低小蛋白的分辨率；在胶底端，高浓度的十二磺酸使蛋白固定致染色困难。至于高分子量蛋白少的原因可能是在变性条件下，蛋白质复合物变成了多肽，或者可能是大分子。127

Measuretheproteinconc.inyoursamples.WidelyusedproteinassaymethodsBiuretLowrymethods.Bradfordmethods.UVmethods.SpecialmethodsOthercommercialmethods.BCAassay(bicinchoninicacidassay,Pierce)DCproteinassay(detergentcompatible,Bio-rad)DC/RCproteinassay(detergent/reducingagentcompatible,Bio-rad)BeforerunninngIEF,youshould…五、蛋白质含量测定128

Principle:Thereactivityofthepeptidebondswiththecopper[II]ionsunderalkalineconditionstoformpurplebiuretcomplex.Interferingsubstance:Ammoniumsulfate,Tris,etc.Sensitivity:>1-20mg1.BiuretmethodAwhite,crystalline,nitrogenoussubstance,C2O2N3H5,formedbyheatingurea.Itisintermediatebetweenureaandcyanuricacid.

129

Principle:Thereactivityofthepeptidenitrogen[s]withthecopper[II]ionsunderalkalineconditionsandthesubsequentreductionoftheFolin-Ciocalteayphosphomolybdicphosphotungsticacidtoheteropolymolybdenumbluebythecopper-catalyzedoxidationofaromaticacids(Try,Try).Interferingsubstance:aminoacidderivatives,certainbuffers,drugs,lipids,sugars,salts,nucleicacids,ammoniumions,zwitterionicbuffers,nonionicbuffersandthiolcompounds.Sensitivity:>0.1mg2.Lowrymethod130

Principle:TheassayisbasedontheobservationthattheabsorbancemaximumforanacidicsolutionofCoomassieBrilliantBlueG-250shiftsfrom465nmto595nmwhenbindingtoproteinoccurs.TheCoomassie®dyebindsprimarilywithbasicandaromaticsidechains.Theinteractionwitharginineisverystrongandlessstrongwithhistidine,lysine,tyrosine,tryptophan,andphenylalanine.About1.5to3moleculesofdyebindperpositivechargeontheprotein.Interferingsubstance:aminoacidderivatives,certainbuffers,drugs,lipids,sugars,salts,nucleicacids,ammoniumions,zwitterionicbuffers,nonionicbuffersandthiolcompounds.Sensitivity:>10-100ug3.Bradfordmethod131

4.UVmethodsPrinciple:Thearomaticgroups(Phe,Tyr,Trp)andthepeptidebondshavemaximumUVabsorbancearound280nmand200nm.280nmwasusedmostfrequently.Interferingsubstance:anythingcontainingSensitivity:>0.1–1mg132

5.SpecialmethodsPrinciple:Someproteinscontainfunctionalgroups,eg:Hemeinperoidase,hemoglobinandtransferrincanbedetectedat403nm,Cd2+insomephytochelatins.Interferingsubstance:similarfunctionalgroups.Sensitivity:various133

6.CommercialmethodsA.BCAassay(bicinchoninicacidassay,Pierce)B.DCproteinassay(detergentcompatible,Bio-rad)C.DC/RCproteinassay(detergent/reducingagentcompatible,Bio-rad)Thisprocessisatwo-stepreaction.Protein+Cu2++OH-Cu1+Cu1++2BCACu1+/BCAchromophore(562nm).134

Summaryofproteinquantitationmethods135六、出现问题和解决办法样品中非蛋白的不纯物质可能干扰蛋白的分离及二维电泳图谱的质量。因此，在样品制备中需考虑清除这些杂质。一、裂解液的影响离子去污剂，如SDS，通常用于蛋白的提取和溶解，但却强烈干扰IEF。SDS与多肽形成复合物。如果SDS不被除去，则不能正确聚焦。通常用含有兼性离子去污剂或非离子去污剂的重泡胀溶液稀释含SDS的样品，因此，其终浓度为0.25％或更低。其他去污剂与之的比率为8：1。通过丙酮沉淀也可去除部分SDS。在高温下沉淀将最大限度除去SDS。但是在-20℃沉淀会更完全。苯酚通常在许多植物组织中出现，通过酶催化的氧化反应来修饰蛋白。通常在组织提取过程中应用还原剂防止苯酚的氧化(如β-巯基乙醇、DTT)，也可通过沉淀方法迅速从酚组分中分离蛋白。或者用抑制剂，如硫脲来灭活多酚氧化酶，或用聚乙烯吡咯烷酮或聚乙烯聚吡咯烷酮吸收酚来清除酚组分。136二、盐浓度的影响盐离子可干扰电泳过程，应尽可能保持低浓度或加以清除。在IPG胶条中，盐离子可导致溶液的电导率增大。通过延长IEF的聚焦时间，直到离子移至胶条末端时聚焦才会完成。水的运动也可能导致胶条一端干燥，一端膨胀，在胶条中的盐离子可能导致较大区域不能聚焦(如水平条纹)。如果IPG胶条在样品中进行重泡胀，则重泡胀溶液的盐浓度，应低于10mmol／L。如果在样品杯中加样，则可耐受50mmol／L左右的盐浓度。然而，当蛋白忽然移到一个低盐环境中时，可能在加样处发生沉淀。通常用透析、旋转透析、凝胶过滤和沉淀／重悬的方法进行脱盐处理。透析是一个很有效的方法，可出现较少的样品丢失，然而耗时较多，并要求较大体积的溶液。尽管旋转透析较迅速，但蛋白吸附于透析膜也是一个问题。它应该在加入尿素和去污剂之前应用。凝胶过滤和沉淀／重悬后同样可导致蛋白丢失。137三、其他影响因素1．内源性小分子内源性小分子，如核酸、代谢物和磷脂等。这些物质通常带负电荷，能发生偏阳极侧的聚焦不全。通常TCA／丙酮沉淀在除去这类物质时特别有效。2．核酸核酸(RNA、DNA)增加样品的黏度，并导致背景弥散；高分子质量的核酸能阻滞凝胶孔径；核酸可能通过电稳态相互作用与蛋白结合，从而阻碍聚焦；如果分离的蛋白通过银染检测，凝胶中的核酸也将染色，导致高背景。通常可用DNase和RNaseA混合物处理样品中的核酸，将其变为单或寡核苷酸。这经常需加入0.1倍体积的含有1mg／LDNase、0.25mg／mLRNaseA的溶液和50mmol／LMgCl2溶液在冰上孵育。然而DNase和RNaseA也可能出现在二维电泳图像中。超离也可用来除去大分子核酸，然而，也会除去相对高分子质量蛋白。当应用低离子强度的提取溶液时，带负电荷的核酸很可能与带正电荷的蛋白形成复合物。高离子强度提取或高pH提取可最大程度减少这些相互作用(注意：提取时所加的盐离子必须在后续步骤中除去)。1383.多糖多糖能阻碍凝胶孔径，或导致沉淀，或延长聚焦时间。或出现水平条纹。某些多糖含有负电荷，能与蛋白质形成复合物。通常用硫酸铵或苯酚／醋酸铵沉淀的方法，随后离心。超速离心可以除去高分子多糖。4.脂肪许多蛋白质，尤其是膜蛋白，可以与脂类形成复合物，这会降低其溶解性，影响其等电点和分子量。脂类也能与去污剂形成复合物，减低其效率。通常用强变性剂和去污剂最大程度减少蛋白与脂类的相互作用，但可能需过多的去污剂。5.不溶物质在样品中的不溶物质能阻碍凝胶孔径，并导致聚焦不良。当应用样品杯时，它能阻碍蛋白进入IPG胶条中。通常在IEF之前，应除去不溶物质。139WashtissueinbufferedisotonicsalinesolutionUselysis-denaturingbufferinratioof0.5mLtissueto2.0mLbufferUseappropriatedisruptiontolysecellsHomogenizer–mechanicalorelectrical(Polytron)Mincetissuewithrazorthenthreecyclesoffreeze-thawandvortexSpin@20,000xginF2402Hrotorfor60minutesat18CExchangesupernatantwithStartBufferonPD10columnUsing0.2-0.3mLofsample,determineproteinconcentrationbyMicroBCAassayInject1-5mgofproteinintothePF2DSamplePreparation:

Tissues/Tumors140WashcellsinbufferedisotonicsalinesolutionSpincellsat6,000xginF0685rotorfor10minutesUselysis-denaturingbufferinratioof0.5mLcellpelletto2.0mLbufferUseappropriatedisruption–sonicate3xfor30seceachorpassthroughFrenchpress2-3xat7,000-10,000psiSpin@20,000xginF2402Hrotorfor60minutesat18CExchangesupernatantwithStartBufferonPD10columnUsing0.2-0.3mLofsample,determineproteinconcentrationbyMicroBCAassayInject1-5mgofproteinintothePF2DSamplePreparation:

BacteriaCellCultures141WashcellsinbufferedisotonicsalinesolutionSpincellsat3,000xginSX4250rotorfor10minutesUselysis-denaturingbufferinratioof0.5mLcellpelletto2.0mLbufferUseappropriatedisruption-sonicate3xfor30seceachorpassthroughFrenchpress2-3xat5,000-20,000psiSpin@20,000xginF2402Hrotorfor60minutesat18CExchangesupernatantwithStartBufferonPD10columnUsing0.2-0.3mLofsample,determineproteinconcentrationbyMicroBCAassayInject1-5mgofproteinintothePF2DSamplePreparation:

YeastCellCultures142WashcellsinbufferedisotonicsalinesolutionForanchoragedependentcells,removecellsfromplatewithtrypsin+EDTAorEDTAonlyandstopwithPBS+CaorplacecellsoniceandscrapeSpincellsat500xginSX4250rotorfor10minutesUselysis-denaturingbufferinratioof0.5mLcellpelletto2.0mLbufferUseappropriatedisruption–vortexvigorouslySpin@20,000xginF2402Hrotorfor60minutesat18CExchangesupernatantwithStartBufferonPD10columnUsing0.2-0.3mLofsample,determineproteinconcentrationbyMicroBCAassayInject1-5mgofproteinintothePF2DSamplePreparation:

AnimalCellCultures143ThePreparationofProteinsKeyforproteomics144ChapterIIISeparationofProteins145一、蛋白质电泳相