免疫原和抗血清制备技术

免疫原和抗血清制备技术第一节免疫原的制备第二节免疫血清的制备第三节抗体的纯化和鉴定第一节免疫原的制备一、细胞性抗原的制备二、可溶性抗原制备及鉴定三、半抗原免疫原的制备四、佐剂

绵羊红细胞的制备流程图摇动15-20min

4℃可保存3周取适量NS洗涤3次2000r/min10minNS稀释至2～5%

细菌细胞抗原的制备流程图液体培养或斜面培养37℃24h100℃水浴2～2.5h杀菌无菌试验NS稀释成8～10亿/mlO菌体抗原返回来源:组织和细胞，其成分比较复杂。1.组织和细胞成分混合抗原制备2.蛋白质抗原制备3.核酸抗原制备4.类脂多糖抗原制备5.免疫球蛋白片段制备6.纯化抗原的鉴定

二、可溶性抗原制备及鉴定可溶性抗原:蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、酶类、补体、脂多糖、细菌外毒素和核酸二、可溶性抗原制备及鉴定返回

组织和细胞成分混合抗原制备程序上清液澄清所用材料必须是新鲜或低温保存的去除包膜或结缔组织脏器进行灌洗洗去血迹及污物NS内含0.5g／LNaN2冷浴中组织剪碎装入捣碎机简内高速粉碎制成组织匀浆液3000r／min×10min取上清液去除细胞碎片及微小组织离心

细胞破碎技术及评价1.酶处理法2.冻融法3.超声破碎法4.表面活性剂处理细胞破碎技术及评价

常用酶类：溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶等

1.酶处理法1.酶处理法方法：在一定的条件下，能消化细菌和组织细胞。

特点：①此法适用多种微生物；②具有作用条件温和；③内含物成分不易受到破坏；④细胞壁损坏的程度可以控制。

2.冻融法原理：因突然冷冻，细胞内冰晶的形成及胞内外溶剂浓度的突然改变而破坏细胞。2.冻融法完方法：将待破碎的细胞置冰箱内冻结，然后缓慢融化，如此反复两次，大部分组织细胞及细胞内的颗粒可被融破。特点：此法适用于组织细胞，对微生物细胞作用较差。

3.超声破碎法原理：利用超声波的机械振动而使细胞破碎。由于超声波发生空化作用（cavitation）使得液体形成局部减压引起液体内部发生流动，漩涡生成与消失时，产生很大的压力，使细胞破碎。超声波使用的频率从1kHz～20kHz不等，间歇进行，避免长期超声产热，导致抗原破坏。3.超声破碎法特点：①操作简单，重复性较好，节省时间；②多用于微生物和组织细胞的破碎。4.表面面活性剂剂处理原理：在适当的的温度、、pH及及低离子子强度的的条件下，表表面活性性剂能与与脂蛋白白形成微微泡，使膜的渗渗透性改改变或使使之溶解解。4.表面面活性剂剂处理常用的有有：十二烷基基硫酸钠钠(SDS,阴阴离子型型)、二乙胺十十六烷基基溴（阳阳离子型型）、聚聚山梨酯酯（非离子子型）、、新洁尔尔灭等。。应用：①破碎细细菌，且且作用比比较温和和；②提取核核酸时，，常用此此法破碎碎细胞。。蛋白质抗抗原制备备蛋白质是是良好的的抗原，，要制备备特异性性高的抗血清清通常需需要纯化化。可采采用：1.超速速离心法法2.选择择性沉淀淀法3.凝胶胶层析法法4.离子子交换层层析法5.亲合合层析法法蛋白质抗抗原制备备1．超速速离心法法原理:利用各颗颗粒在梯梯度液中中沉降速速度不同同，使具有不不同沉降降速度的的颗粒,处于不不同密度度的梯度层层内，达达到彼此此分离的的目的。。1．超速速离心法法特点：用超速离离心或梯梯度密度度离心法法纯化抗抗原，极难难将某一一抗原成成分分离离出来。。应用：用于少部部分大分分子抗原原和一些些比较轻轻的抗原物物质的分分离，如如IgM、C1q、甲甲状腺球球蛋白、载载脂蛋白白A、B等。2、选择择性沉淀淀法原理：根据各蛋蛋白质理理化特性性的差异异，采用用各种沉淀淀剂或改改变某些些条件促促使蛋白白质抗原原成分沉淀淀，从而而达到纯纯化的目目的。2、选择择性沉淀淀法常用方法法：盐析沉淀淀法（不不同盐浓浓度则溶溶解度不同））；常用用33～～50％％饱和度度的硫酸酸胺。特点：简单方便便，纯度度不高，，粗提球球蛋白。。应用：在大量制制备中先先用此法法粗提，，再纯化化。3．凝胶胶层析法法（凝胶胶过滤法法）原理：凝胶具有有三维空空间多孔孔网状结结构的物物质，经适当溶溶液平衡衡后，装装入层析析柱。当当含有各各种分子大小小不一的的混合物物加在凝凝胶床面面时，大大分子物质不不能进入入凝胶颗颗粒的网网孔结构构内，在在凝胶颗粒之之间的空空隙中很很快地通通过凝胶胶床，短短时间内被洗洗脱出来来；而分分子较小小的物质质则进入入凝胶网孔结结构内，，反复受受到阻滞滞，洗脱脱较慢。。分成大、中中、小三三种类型型。3．凝胶胶层析法法（凝胶胶过滤法法）4．离子子交换层层析法原理：利用带离离子基团团的纤维维素或凝凝胶，吸吸附交换换带相反反电荷的的蛋白质质抗原。。各种蛋蛋白质的的等电点点不同，，所带电电荷不同同，与纤纤维素结结合的能能力有差差别。当当梯度洗洗脱时，，逐步增增加流动动相的离离子强度度，使加加入的离离子与蛋蛋白质竞竞争纤维维素上的的电荷位位置，，从而使使血清中中的蛋白白质分成成γ球蛋蛋白、αα球蛋白白、β球球蛋白和和清蛋白白等几个个部分而而被洗脱脱下来，，达到分分离纯化化的目的的。4．离子子交换层层析法5．亲和和层析法法（亲和和色谱））原理：依据抗原原抗体的的生物学学活性进进行分离离和提纯纯的技术术。将纯纯化的抗抗IgG附着于惰惰性的固固相基质质上，制制成免疫疫吸附层层析柱。。当样品品流过此此柱时，，待分离离的IgG可选择性性地与免免疫吸附附剂上的的特异性性配体(抗IgG)结合；当当改变洗洗脱条件件可重新新解离，，将待分分离的Ig洗脱下来来，达到到纯化的的目的。。优点：提取纯度度高、抗抗原抗体体不失活活性。5．亲和和层析法法（亲和和色谱））正常细胞胞＋标记细胞胞洗滴标记细胞胞被酶裂解解加入特异异性抗体其它蛋白白洗涤流失失SDS分离蛋白白亲和层析析法示意意图核酸抗原原制备大分子的的核酸具具有免疫疫原性。。提取核酸酸的主要要步骤：：核酸抗原原制备破碎碎细细胞胞核酸酸从从细细胞胞中中游游离离出出来来酸沉沉淀淀核核除去去蛋蛋白白质质乙醇醇酚和和氯氯仿仿类脂脂多多糖糖抗抗原原制制备备苯酚酚法法提提取取LPS：：干燥燥菌菌体体或或湿湿菌菌体体水中中混匀匀激烈烈搅搅匀匀加热热5min冰水水急冷冷降至至10℃℃以以下下离心心上层层的的水水层层(含含LPS)下层层的的酚酚层层菌体体残残渣渣于于底底部部吸取取水层层透析析除酚酚加热热超速速离离心心浓缩缩LPS在在上上层层沉沉淀淀的的透透明明胶胶状状部部内内绞出出悬于于水水中中离心心得纯纯化化LPS类脂脂多多糖糖抗抗原原制制备备同温温的的苯苯酚酚免疫疫球球蛋蛋白白片片段段制制备备1．．酶酶裂裂解解法法酶对对免免疫疫球球蛋蛋白白的的水水解解有有极极好好的专专一一性性，，不不同同的的酶酶可可将将免免疫疫球球蛋蛋白白裂裂解解为不不同同的的片片段段。。免疫疫球球蛋蛋白白片片段段制制备备2．．氧氧化化法法和和还还原原法法是将将免免疫疫球球蛋蛋白白轻轻、、重重链分分开开的的两两种种常常用用方方法法。。3.还可可用用强变变性性剂剂或利利用用改变变pH将免免疫疫球球蛋蛋白亚亚单单位位分分开开。。酶水水解解免免疫疫球球蛋蛋白白示示意意图图Fc段段，，用用以以制制备备抗抗重重链链血血清清F(ab’’)2，常常作作为为抗抗体体试试剂剂用用于于试试验验木瓜瓜蛋蛋白白酶酶（papain)胰蛋蛋白白酶酶(pepsin)胃蛋蛋白白酶酶(pepsin)1.氧氧化化法法：：优点点是是切切开开后后，，肽肽链链不不能能重重新新形成成二二硫硫键键、、便便于于肽肽链链纯纯化化；；缺点点是是色色氨氨酸酸侧侧链链容容易易被被破破坏坏。。氧化化法法和和还原原法法评评价价返回回2.还还原原法法：：将二二硫硫键键还还原原成成琉琉基基。。但但极极不不稳定定，，易易重重新新形形成成二二硫硫键键，，必必须须及及时时用用碘乙乙酸酸或或碘碘化化酰酰胺胺进进行行羧羧甲甲基基化化。。纯化化抗抗原原的的鉴鉴定定1.含含量量鉴鉴定定2.理理化化性性质质鉴鉴定定①凝凝胶胶层层析析技技术术测测定定②聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶电电泳泳③凝凝胶胶管管状状电电泳泳④超超速速离离心心3.纯纯度度鉴鉴定定常用用醋醋酸酸纤纤维维膜膜电电泳泳4.免免疫疫活活性性鉴鉴定定常用用双双向向琼琼脂脂扩扩散散试试验验纯化化抗抗原原的的鉴鉴定定蓝色色1．．含含量量鉴鉴定定在一一定定范范围围内内，，颜颜色色深深浅浅与与蛋蛋白白质质浓浓度度呈呈直直线线相相关关。。方法法：：酚酚试试剂剂法法鉴鉴定定主要要试试剂剂：：磷磷钼钼酸酸-钨钨酸酸的的混混合合酸酸原理理：：蛋白白质质中中的的酪酪氨氨酸酸、、半半胱胱氨氨酸酸、、色色氨氨酸酸等等能能钨酸酸、、钼钼酸酸还原原3H2OP205·13WO3·5MoO3·10H20和3H2P205·14WO3·4MoO3·10H20络合合物物的的双双缩缩脲脲法法蛋白白质质＋＋Ca2+碱性性加深深含量量鉴鉴定定蓝色色理化化性性质质鉴鉴定定已知知分分子子量量的的标标准准品品测未未知知分分子子量量：：将样样品品在在同同一一凝凝胶胶柱柱上上，，同同一一条条件下下层层析析、、洗洗脱脱、、测测保保留留体体积积，，并并查查出出分分子子量量。。此法简便、、样品用量量少，有一一定的实用用价值。凝胶柱保留体积分子量的对对数2.理化性性质鉴定绘制标准曲曲线①凝胶层析析技术进行行测定垂直电泳聚合成大分分子凝胶②聚丙烯酰胺胺凝胶电泳泳（PAGE）有分子筛效效应、电荷荷效应及浓浓缩效应，，能精确地分离和和鉴定高分分子物质。。PAG的分分子筛效应应测定蛋白白质抗原的的分子量。。原理：双丙烯酰胺胺N,N-methylenebisacrylamide,Bis丙烯酰胺(acrylamide,Acr)催化剂3.纯度度鉴定方法：醋酸纤维膜膜电泳进行行鉴定。返回纯度鉴定原理：蛋白质在一一定pH下下都带有电电荷，由于于各种蛋白质质等电点不不同、分子子量也异，，因此所带电量也也各不相同同，在外加加直流电场场的作用下，它们们泳动的速速度不同，，经一段时时间后即可彼此分分开，形成成电泳谱；；从而判断断蛋白质抗原的纯纯度。特点：快速简便。。三、半抗原原免疫原的的制备1.半抗原原：低分子量的的化学物质质。例如多多糖、多肽、甾族族激素、脂脂肪胺、类类脂质、核核苷、某些药物(包括抗生生素）及其其他化学物物品等。三、半抗原原免疫原制制备2.载体：：蛋白质类多肽聚合物物大分子聚合合物3.半抗原原-载体连连接方法:载体类型1.蛋白质质：人血清白蛋蛋白、牛血清白蛋蛋白、兔血清白蛋白白、牛甲状状腺球蛋白白等。载体类型2.多肽聚聚合物：人工合成的的，常见的的有多聚赖赖氨酸，其分分子量大（（可达十几几万到几十十万)，这种多聚物物和半抗原原结合后，，可刺激免免疫动物产生高效效价、高亲亲和力的抗抗体。3.大聚合合物：羧甲基纤维维素、聚乙乙烯吡咯烷烷酮等，可与半半抗原结合合，加入弗弗氏完全佐佐剂亦可诱发动物物产生抗体体。半抗原-载载体连接方方法1碳化二亚胺胺法：R-NH=CH-R’半抗原＋载载体蛋白质质搅拌1～2h室温24h透吸除去未未反应的半半抗原人工免疫原原半抗原载体体连接方法法1混合混合半抗原-载载体连接方方法2戊二醛法:半抗原-NH2载体蛋白-NH2半抗原-N=CH-(CH2)3-CH=NH-载体体蛋白OHC-(CH2)3-CHO*戊二醛是是常用的带带有两个活活性基团的的双功能联接剂剂半抗原载体体连接方法法2半抗原-载载体连接方方法3氯甲酸异丁丁脂法：半抗原-COOH载体蛋白-NH2Cl-COO-CH2CH(CH3)2半抗抗原原-COO-COO-CH2CH(CH3)2半抗抗原原-CO-NH-载体体蛋蛋白白半抗抗原原载载体体连连接接方方法法3简便便，，用用于于类类固固醇醇抗抗原原制制备备HO-CH2CH(CH3)2＋半抗抗原原-载载体体连连接接方方法法4琥珀珀酸酸酐酐法法：：用于于不不含含羧羧基基衍衍生生物物半半抗抗原原制制备备半抗抗原原-CH2OHCH2-COCH2-CO带羧羧基基的的半半抗抗原原琥琥珀珀酸酸衍衍生生物物半抗抗原原-CH2-OOC-CH2-CH2-COOH返回回吡啶啶再经经氯氯甲甲酸酸异异丁丁脂脂法法或或碳碳化化二亚亚胺胺法法制制备备载载体体半半抗抗原原半抗抗原原载载体体连连接接方方法法4四、、佐佐剂剂*概概念念：：与抗抗原原同同时时或或预预先先注注射射于于机机体体，，能能增增加机机体体免免疫疫应应答答或或改改变变免免疫疫应应答答类类型型的的物物质质。。四、、佐佐剂剂条件件：：①增增加加抗抗原原的的表表面面积积；；②改改变变抗抗原原的的活活性性基基团团构构型型；；③佐佐剂剂与与抗抗原原混混合合能能延延长长抗抗原原在在局局部部组织织的的存存留留时时间间；；④可可直直接接或或间间接接激激活活免免疫疫活活性性细细胞胞；；⑤无无毒毒性性或或无无副副作作用用。。（二二））常常用用佐佐剂剂的的种种类类和和制制备备1.氢氢氧氧化化铝铝佐佐剂剂：：5%硫硫酸酸铝铝5%氢氢氧氧化化钠钠氢氧氧化化铝铝沉沉淀淀制成成悬悬液液即为为佐佐剂剂强烈烈搅搅拌拌NS洗洗二次次NS等体体积积抗抗原原免疫疫接接种种（二二））常常用用佐佐剂剂的的种种类类和和制制备备2.明明矾矾佐佐剂剂10%硫硫酸酸钾钾铝铝氢氧氧化化钠钠校校正正pH值值至至6.5沉淀淀乳状状悬悬液液*明矾矾佐佐剂剂抗抗原原常常用用用用于于肌肌肉肉注注射射，，皮皮下下注注射射易引引起起肉肉芽芽种种和和脓脓肿肿。。NS搅搅拌拌NS洗洗二次次离心心抗原原备用用防腐腐剂剂作用用大大于于不不完完全全佐佐剂剂局部部形形成成肉肉芽芽种种和和溃溃疡疡不能能用用于于人人体体弗氏氏完完全全佐佐剂剂3.弗弗氏氏佐佐剂剂(Freundadjuvant)液体体石石蜡蜡完全全乳乳化化备用用＋高压压灭菌菌加热热抗原原弗氏氏不不完完全全佐佐剂剂卡介介苗苗羊毛毛脂脂鉴定定一滴滴乳剂剂乳剂剂不不散散浮浮于于液液面面水中中混合合4.佐佐剂剂应应用用原原则则和和评评价价目的的:①增增强强抗抗原原对对机机体体的的免免疫疫原原性性；；②增增强强抗抗体体的的产产生生能能力力；；③为为制制备备出出高高效效价价的的免免疫疫血血清清；；④增增强强可可溶溶性性抗抗原原的的免免疫疫原原性性；；⑤在在某某种种情情况况下下，，改改变变Ag免免疫疫应应答答类类型型；；⑥延延长长抗抗原原在在免免疫疫动动物物的的时时间间；；⑦改改变变抗抗原原的的分分布布；；⑧增增强强局局部部对对变变应应原原的的超超敏敏反反情情况况；；4.佐佐剂剂应应用用原原则则和和评评价价应用用佐佐剂剂的的缺缺点点①佐剂剂常常混混有有微微量量其其它它物物质质，，这这些些物物质质进进入体体内内后后也也可可引引起起抗抗体体的的产产主主，，影影响响抗抗血清清的的特特异异性性；；应用用佐佐剂剂的的缺缺点点②注射射佐佐剂剂可可引引起起局局部部形形成成肉肉芽芽肿肿和和无无菌菌性脓脓肿肿；；③反复复注注射射，，易易发发生生超超敏敏反反应应，，使使局局部部组组织坏坏死死，，甚甚至至引引起起动动物物死死亡亡。。第二二节节免免疫疫血血清清的的制制备备1.免免疫疫动动物物选选择择2.免免疫疫方方法法3.动动物物采采血血法法4.免免疫疫血血清清的的分分离离及及保保存存一、、免免疫疫动动物物选选择择能作作免免疫疫接接种种用用的的动动物物主主要要是是哺哺乳乳类类和和禽禽类类。。兔、、绵绵羊羊、、豚豚鼠鼠、、鸡鸡、、山山羊羊和和马马。。一、、免免疫疫动动物物选选择择1.抗抗原原与与免免疫疫动动物物种种属属差差异异越越远远越越好好；；2.动动物物必必须须适适龄龄、、健健壮壮、、无无感感染染的的正正常常动动物物、、体重重合合乎乎要要求求；；3.不不同同动动物物种种类类对对同同一一免免疫疫原原有有不不同同的的免免疫疫应答答；；4.按按需需要要量量选选择择大大小小不不同同的的动动物物。。二、、免免疫疫方方法法3.免免疫疫方方案案①全全量量免免疫疫法法：：弗弗氏氏佐佐剂剂抗抗原原多多次次注注射射②微微量量免免疫疫法法：：卡卡介介苗苗7天天弗氏氏佐佐剂剂1月月抗原原③混混合合免免疫疫法法：：综综合合皮皮下下、、淋淋巴巴结结和和静静脉脉二、、免免疫疫方方法法1.免免疫疫原原的的注注射射剂剂量量2.免免疫疫途途径径：：免免疫疫反反应应产产生生速速度度依依次次为为静静脉脉＞＞腹腔腔＞＞肌肌肉肉＞＞皮皮下下＞＞皮皮内内＞＞淋淋巴巴结结＞＞足足掌掌三、、动动物物采采血血法法1.颈颈动动脉脉放放血血法法：：最最常常用用的的方方法法2.心心脏脏采采血血法法：：要要求求操操作作熟熟练练3.静静脉脉采采血血法法：：1.4℃℃保保存存：：可可保保存存3～～6个个月月2.低低温温保保存存：：-20～～-40℃℃，，可可保保存存2～～3年年3.冰冰冻冻干干燥燥保保存存：：可可保保存存3～～5年年三、、动动物物采采血血法法四、、免免疫疫血血清清的的分分离离和和保保存存第三三节节抗抗体体的的纯纯化化和和鉴鉴定定1.抗抗体体特特异异性性的的纯纯化化2.特特异异性性IgG类类抗抗体体的的纯纯化化3.特特异异性性抗抗体体的的鉴鉴定定一、、抗抗体体特特异异性性的的纯纯化化1.亲亲合合层层析析法法：：将交交叉叉抗抗原原交交联联到到Sepharose4B上上，，装装柱柱后后，，将将预预吸吸收收的的抗抗体体通通过过亲亲合合层层析柱柱，，杂杂抗抗体体吸吸附附在在柱柱上上，，流流出出液液则则是是特特异异性抗抗体体。。一、、抗抗体体特特异异性性的的纯纯化化2.吸吸附附法法：：利用用不不含含特特异异性性抗抗原原的的抗抗原原液液，，直直接加加到到免免疫疫血血清清中中，，抗抗原原则则与与抗抗体体结结合合，，上上清液液则则为为无无杂杂抗抗体体的的单单价价特特异异性性抗抗体体。。二、、特特异异性性IgG类类抗抗体体的的纯纯化化1.盐盐吸吸沉沉淀淀法法：：经硫硫酸酸铵铵盐盐吸吸提提取取γγ球球蛋蛋白白3次次，，基基本本为为IgG类类抗抗体体，，但但不不纯纯。。二、、特特异异性性IgG类类抗抗体体的的纯纯化化2.A蛋蛋白白亲亲和和层层析析：：SPA与与IgG的的Fc段段有有很很强强的的特异异性性的的亲亲和和力力，，细细菌菌表表面面不不同同位位点点独独立立地地与抗抗体体结结合合，，一一个个A蛋蛋白白至至少少可可以以结结合合二二个个IgG分分子子。。适适合合纯纯化化细细胞胞培培养养上上清清中中的的McAb。。3.其其它它：：凝胶胶过过滤滤、、离离子子交交换换层层析析等等三、特特异性性抗体体的鉴鉴定1.抗抗体效效价的的鉴定定：即为抗抗体活活性滴滴定三、特特异性性抗体体的鉴鉴定2.抗抗体特特异性性鉴定定：①细菌菌类抗抗原的的抗体体用凝凝集试试验②可溶溶性抗抗原的的抗体体用双双向琼琼脂扩扩散试试验3.抗抗体的的纯度度鉴定定：免疫电电泳分分析法法4.抗抗体亲亲和力力鉴定定：亲和力力高则则灵敏敏度好好第四节节单单克克隆抗抗体技技术单克隆隆抗体体：由B细细胞杂杂交瘤瘤产生生的只只识别别抗原原分子上一种种抗原决定定簇的抗体体分子。多克隆抗体体：识别抗原分分子上各种种抗原决定定簇的多种抗体体的混合制制剂。一、杂交瘤瘤技术的原原理及流程程二、单克隆隆抗体的应应用返回一、杂交瘤技术术的原理及及流程二、单克隆隆抗体的应应用1.医学检检验试剂：：①传染病的的快速诊断断②寻找TSA及检测测TAA③免疫细胞胞抗原检测测④激素测定定⑤血中药物物浓度监测测⑥HLA分分型监测二、单克隆隆抗体的应应用2.导向治治疗作用3.抗原物物质的分离离和提纯9、静夜四四无邻，，荒居旧旧业贫。。。12月-2212月-22Thursday,December29,202210、雨雨中中黄黄叶叶树树，，灯灯下下白白头头人人。。。。03:52:3403:52:3403:5212/29/20223:52:34AM11、以我我独沈沈久，，愧君君相见见频。。。12月月-2203:52:3403:52Dec-2229-Dec-2212、故故人人江江海海别别，，几几度度隔隔山山川川。。。。03:52:3503:52:3503:52Thursday,December29,202213、乍见翻疑疑梦，相悲悲各问年。。。12月-2212月-2203:52:3503:52:35December29,202214、他乡生白白发，旧国国见青山。。。29十二二月20223:52:35上上午03:52:3512月-2215、比比不不了了得得就就不不比比，，得得不不到到的的就就不不要要。。。。。十二二月月223:52上上午午12月月-2203:52December29,202216、行动出成成果，工作作出财富。。。2022/12/293:52:3503:52:3529December202217、做前，能能够环视四四周；做时时，你只能能或者最好好沿着以脚脚为起点的的射线向前前。。3:52:35上上午3:52上上午03:52:3512月-229、没有有失败败，只只有暂暂时停停止成成功！！。12月月-2212月月-22Thursday,December29,202210、很多事事情努力力了未必必有结果果，但是是不努力力却什么么改变也也没有。。。03:52:3503:52:3503:5212/29/20223:5