米酒的检验技术及规范操作课件

米酒的检验技术及规范操作米酒的检验技术及规范操作1内容背景1检验依据2检验项目3记录及报告4内容背景1检验依据2检验项目3记录及报告42背景总批数合格数不合格数不合格项合格率78780/100%孝感市食品药品检验检测中心米酒检验概况表12015年度米酒微生物检验汇总表背景总批数合格数不合格数不合格项合格率78780/100%3米酒检验标准NY/T1885-2010绿色食品米酒1DB42/T27-2009孝感米酒23四十九类食品产品生产许可证审查细则汇编米酒检验标准NY/T1885-2010绿色食品米酒1D4米酒检验标准NY/T1885-2010绿色食品米酒适用于各类绿色食品米酒表2卫生指标项目指标菌落总数b，cfu/g≤50大肠菌群b，MPN/g＜3致病菌（沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌）不得检出商业无菌商业无菌a

仅适用于罐头包装产品。b

仅适用于非罐头包装产品。米酒检验标准NY/T1885-2010绿色食品米酒表25大肠菌群GB4789.3-2010沙门氏菌GB4789.4-2010溶血性链球菌GB4789.11-2014金黄色葡萄球菌GB4789.10-2010菌落总数GB4789.2-2010志贺氏菌GB4789.5-2012NY/T1885-2010绿色食品米酒米酒检验标准大肠菌群沙门氏菌溶血性链球菌金黄色葡萄球菌菌落总数志贺氏菌N6DB42/T27-2009孝感米酒适用于孝感市孝南区生产的以孝感籼糯为主要原料，经特种酒曲发酵，可添加白砂糖、木耳、桂花、红枣等辅料，加工制成的固形物小于48%的孝感米酒饮品。米酒检验标准表3微生物指标项目要求细菌总数/（cfu/g）≤100大肠菌群/（MPN/100g）≤6致病菌（沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌）不得检出DB42/T27-2009孝感米酒米酒检验标准表3微生7大肠菌群GB/T4789.3-2003沙门氏菌GB4789.4-2010溶血性链球菌GB4789.11-2014金黄色葡萄球菌GB4789.10-2010菌落总数GB4789.2-2010志贺氏菌GB4789.5-2012DB42/T27-2009孝感米酒米酒检验标准大肠菌群沙门氏菌溶血性链球菌金黄色葡萄球菌菌落总数志贺氏菌D8四十九类食品产品生产许可证审查细则汇编附件34：其他酒生产许可证审查细则（2006版）检验项目：发证检验、监督检验、出厂检验分别按下表列出的相应检验项目进行。出厂检验项目栏中注有“*”标记的，企业应当每年检验2次。米酒检验标准序号项目名称发证监督出厂备注9肠道致病菌√√*仅对发酵酒表4产品质量检验项目表四十九类食品产品生产许可证审查细则汇编米酒检验标准序号项目名9菌落总数大肠菌群沙门氏菌志贺氏菌金黄色葡萄球菌检验项目溶血性链球菌菌落总数大肠菌群沙门氏菌志贺氏菌金黄色葡萄球菌检验项目溶血性10菌落总数检验标准：GB4789.2-2010食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定菌落总数：食品检样经过处理，在一定条件下（如培养基、培养温度和培养时间等）培养后，所得每g检样中形成的微生物菌落总数。菌落总数检验标准：11菌落总数菌落总数12制备1:100样品匀液制备1:10样品匀液制备10倍样品匀液取样并制备平板称取25g

样品置盛有225mL

磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8000r/min～10000r/min均质1min～2min，或放入盛有225mL稀释液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min～2min，制成

1:10

的样品匀液。

用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1mL，沿管壁缓慢注于盛有9mL稀释液的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1:100

的样品匀液。按上一步操作程序，制备10倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用1次1mL无菌吸管或吸头。选择2个～3个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），在进行10倍递增稀释时，吸取1mL样品匀液于无菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。同时，分别吸取1mL空白稀释液加入两个无菌平皿内作空白对照。及时将15mL～20mL

冷却至46℃

的平板计数琼脂培养基（可放置于46℃±1℃恒温水浴箱中保温）倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。1、样品的稀释菌落总数制备1:100样品匀液制备1:10样品匀液制备10倍样品匀液13菌落总数2、培养2.1待琼脂凝固后，将平板翻转，36℃±1℃培养48h±2h。2.2如果样品中可能含有在琼脂培养基表面弥漫生长的菌落时，可在凝固后的琼脂表面覆盖一薄层琼脂培养基（约4mL），凝固后翻转平板，按2.1条件进行培养。菌落总数2、培养141选取菌落数在30CFU～300CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于30CFU的平板记录具体菌落数，大于300CFU的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。3当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。2其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2，代表一个平板菌落数。菌落总数3、菌落计数可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位（colony-formingunits，CFU）表示。1选取菌落数在30CFU～300CFU之间、无蔓延菌15菌落总数4、结果与报告4.1菌落总数的计算方法4.1.1若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每g（mL）样品中菌落总数结果。4.1.2若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按公式（1）计算

N=∑C/(n1+0.1n2)d………………（1）式中：N——样品中菌落数；∑C——平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和；n1——第一稀释度（低稀释倍数）平板个数；n2——第二稀释度（高稀释倍数）平板个数；d——稀释因子（第一稀释度）。

菌落总数4、结果与报告16菌落总数4.2菌落总数的报告4.2.1菌落数小于100CFU时，按“四舍五入”原则修约，以整数报告。4.2.2菌落数大于或等于100CFU时，第3位数字采用“四舍五入”原则修约后，取前2位数字，后面用0代替位数；也可用10的指数形式来表示，按“四舍五入”原则修约后，采用两位有效数字。4.2.3若所有平板上为蔓延菌落而无法计数，则报告菌落蔓延。4.2.4若空白对照上有菌落生长，则此次检测结果无效。4.2.5称重取样以CFU/g为单位报告，体积取样以CFU/mL为单位报告。菌落总数4.2菌落总数的报告17大肠菌群计数检验标准：GB/T4789.3-2003食品卫生微生物学检验大肠菌群测定检验程序见下图大肠菌群计数检验标准：18大肠菌群计数GB4789.3-2010食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数大肠菌群：在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽孢杆菌。包括肠杆菌科的埃希氏菌属、柠檬酸杆菌属、肠杆菌属和克雷伯氏菌属。大肠菌群与肠道致病菌的来源相同，在外界中的生存力接近，在检验方法上，也以大肠菌群的检验计数简便易行，因此可作为水、土壤、乳品、食品饮料等被粪便污染的间接指标。大肠菌群计数GB4789.3-2010食品安全国家标准19大肠菌群计数GB4789.3-2010第一法大肠菌群MPN计数法检验程序如下图大肠菌群计数GB4789.3-2010第一法大肠菌群M20大肠菌群计数大肠埃希氏菌大肠杆菌（Escherichiacoli，E.coli）革兰氏阴性短杆菌，大小0.5×1～3微米。周生鞭毛，能运动，无芽孢。能发酵多种糖类产酸、产气，是人和动物肠道中的正常栖居菌，婴儿出生后即随哺乳进入肠道，与人终身相伴，几乎占粪便干重的1/3。大肠菌群计数大肠埃希氏菌21大肠菌群计数液体样品：以无菌吸管吸取25mL样品置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1:10的样品匀液。用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1mL，沿管壁缓缓注入9mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1支1mL无菌吸管反复吹打，使其混合均匀，制成1:100的样品匀液。根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释1次，换用1支1mL无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15min。1、样品的稀释大肠菌群计数液体样品：以无菌吸管吸取25mL样品置盛有22522大肠菌群计数2、初发酵试验每个样品，选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1mL（如接种量超过1mL，则用双料LST肉汤），36℃±1℃培养24h±2h，观察倒管内是否有气泡产生，24h±2h产气者进行复发酵试验，如未产气则继续培养至48h±2h，产气者进行复发酵试验。未产气者为大肠菌群阴性。大肠菌群计数2、初发酵试验23大肠菌群计数3、复发酵试验用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物1环，移种于煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）管中，36℃±1℃培养48h±2h，观察产气情况。产气者，计为大肠菌群阳性管。4、报告按3确证的大肠菌群LST阳性管数，检索MPN表（见附录B），报告每g（mL）样品中大肠菌群的MPN值。大肠菌群计数3、复发酵试验24大肠菌群计数大肠菌群计数25大肠菌群检验标准：GB/T4789.3-2003食品卫生微生物学检验大肠菌群测定检验程序见下图大肠菌群检验标准：26大肠菌群制备1:100样品匀液制备1:10样品匀液制备10倍样品匀液移取样品以无菌操作将检样25g（mL）放于含有225mL灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内（瓶内预置适当数量的玻璃珠）或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨做成1:10的均匀稀释液。固体检样最好用均质器，以8000r/min～10000r/min的速度处理1min，做成1:10的均匀稀释液。

用1mL无菌吸管吸取1:10稀释液1mL，注入含有9mL灭菌生理盐水或其他稀释液的试管中，振摇试管混合均匀，制成1:100的样品匀液。另取1mL灭菌吸管，按上条操作依次做10倍递增稀释液，每递增稀释一次，换用1支1mL灭菌吸管。根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计，选择三个稀释度，每个稀释度，接种三管。1、样品的稀释大肠菌群制备1:100样品匀液制备1:10样品匀液制备10倍27大肠菌群2、乳糖发酵试验将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内，接种量在1mL以上者，用双料乳糖胆盐发酵管，1mL及以下者，用单料乳糖胆盐发酵管。每一稀释度接种三管，置36℃±1℃培养24h±2h，如所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则可报告为大肠菌群阴性，如有产气者，则按下列程序进行。3、分离培养将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上，置36℃±1℃温箱内，培养18h~24h，然后取出，观察菌落形态，并做革兰氏染色和证实试验。伊红美蓝琼脂：伊红Y和美蓝抑制绝大部分革兰氏阳性菌的生长。伊红Y为酸性染料，美蓝为碱性染料，琼脂是凝固剂。大肠菌群发酵乳糖产酸时，细菌带正电荷，所以染上伊红(红色)，再与美蓝结合形成紫黑色菌落，大部分有金属光泽。大肠菌群2、乳糖发酵试验伊红美蓝琼脂：伊红Y和美蓝抑制绝大部28大肠菌群4、证实试验在上述平板上，挑取可疑大肠菌群菌落1~2个进行革兰氏染色，同时接种乳糖发酵管，置36℃±1℃培养24h±2h，观察产气情况，凡乳糖管产气、革兰氏染色为阴性的无芽孢杆菌，即可报告为大肠菌群阳性。5、报告根据证实为大肠菌群阳性的管数，查MPN检索表，报告每100mL（g）大肠菌群的MPN值。大肠菌群4、证实试验29沙门氏菌沙门氏菌是一种食源性致病菌94%沙门氏菌感染是由于摄食受污染的食品在养殖动物中广泛存在常通过动物源性食品传递给人是引起食物中毒爆发的主要病原菌之一革兰氏阴性杆菌，通常有鞭毛，不形成芽孢沙门氏菌沙门氏菌是一种食源性致病菌30沙门氏菌检验标准：GB4789.4-2010食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验检验程序如下图沙门氏菌检验标准：31沙门氏菌操作步骤1、前增菌称取25g（mL）样品放入盛有225mLBPW的无菌均质杯中，以8000r/min～10000r/min均质1min～2min，或置于盛有225mLBPW的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min～2min。若样品为液态，不需要均质，振荡混匀。如需测定pH值，用1mol/mL无菌NaOH或HCl调pH至6.8±0.2。无菌操作将样品转至500mL锥形瓶中，如使用均质袋，可直接进行培养，于36℃±1℃培养8h～18h。如为冷冻产品,应在45℃以下不超过15min,或2℃～5℃不超过18h解冻。2、增菌轻轻摇动培养过的样品混合物，移取1mL，转种于10mLTTB内，于42℃±1℃培养18h～24h。同时，另取1mL，转种于10mLSC内，于36℃±1℃培养18h～24h。沙门氏菌操作步骤32沙门氏菌3、分离分别用接种环取增菌液1环，划线接种于一个BS琼脂平板和一个XLD琼脂平板（或HE琼脂平板或沙门氏菌属显色培养基平板）。于36℃±1℃分别培养18h～24h（XLD琼脂平板、HE琼脂平板、沙门氏菌属显色培养基平板）或40h～48h（BS琼脂平板），观察各个平板上生长的菌落，各个平板上的菌落特征见下表。沙门氏菌3、分离33沙门氏菌沙门氏菌分别在BS、XLD、HE、显色培养基平板上的菌落特征图沙门氏菌沙门氏菌分别在BS、XLD、HE、显色培养基平板上的34沙门氏菌4、生化试验5、血清学鉴定6、结果与报告综合以上生化试验和血清学鉴定的结果，报告25g（mL）样品中检出或未检出沙门氏菌。沙门氏菌4、生化试验35志贺氏菌(Shigella)，也称志贺菌或者痢疾杆菌，是一类革兰氏阴性、不活动、不产生孢子的杆状细菌，可引起人和其他哺乳类动物的细菌性痢疾。大小为0.5～0.7×2～3μm，无芽胞，无荚膜，无鞭毛，多数有菌毛，革兰氏阴性杆菌。细菌性痢疾简称菌痢。是志贺菌属引起的肠道传染病。临床表现主要有发冷、发热、腹痛、腹泻、里急后重、排粘液脓血样大便。菌痢常年散发，夏秋多见，是我国的常见病、多发病。志贺氏菌志贺氏菌(Shigella)，也称志贺菌或者痢疾杆菌，是一类36志贺氏菌检验标准：GB4789.5-2012食品安全国家标准食品微生物学检验志贺氏菌检验检验程序如下图志贺氏菌检验标准：37志贺氏菌操作步骤：1、增菌以无菌操作取检样25g（mL），加入装有灭菌225mL志贺氏菌增菌肉汤的均质杯，用旋转刀片式均质器以8000r/min～10000r/min均质；或加入装有225mL志贺氏菌增菌肉汤的均质袋中，用拍击式均质器连续均1min～2min，液体样品振荡混匀即可。于41.5℃±１℃，厌氧培养16h～20h。志贺氏菌操作步骤：38志贺氏菌2、分离取增菌后的志贺氏增菌液分别划线接种于XLD琼脂平板和MAC琼脂平板或志贺氏菌显色培养基平板上，于36℃±1℃培养20h～24h，观察各个平板上生长的菌落形态。宋内氏志贺氏菌的单个菌落直径大于其他志贺氏菌。若出现的菌落不典型或菌落较小不易观察，则继续培养至48h再进行观察。志贺氏菌在不同选择性琼脂平板上的菌落特征见表1。志贺氏菌2、分离39志贺氏菌志贺氏菌在XLD、MAC培养基平板上的菌落特征图志贺氏菌志贺氏菌在XLD、MAC培养基平板上的菌落特征图40志贺氏菌3、生化试验4、血清学鉴定5、结果与报告综合以上生化试验和血清学鉴定的结果，报告25g（mL）样品中检出或未检出志贺氏菌。志贺氏菌3、生化试验41金黄色葡萄球菌检验标准：GB4789.10-2010食品安全国家标准食品微生物学检验金黄色葡萄球菌检验程序如下图金黄色葡萄球菌检验标准：42金黄色葡萄球菌操作步骤1、样品的处理称取25g样品至盛有225mL7.5%氯化钠肉汤或10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤的无菌均质杯内，8000r/min～10000r/min均质1min～2min，或放入盛有225mL7.5%氯化钠肉汤或10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min～2min。若样品为液态，吸取25mL样品至盛有225mL7.5%氯化钠肉汤或10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤的无菌锥形瓶(瓶内可预置适当数量的无菌玻璃珠)中，振荡混匀。金黄色葡萄球菌操作步骤43金黄色葡萄球菌2、增菌和分离培养2.1将上述样品匀液于36℃±1℃培养18h～24h。金黄色葡萄球菌在7.5%氯化钠肉汤中呈混浊生长，污染严重时在10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤内呈混浊生长。2.2将上述培养物，分别划线接种到Baird-Parker平板和血平板，血平板36℃±1℃培养18h～24h。Baird-Parker平板36℃±1℃培养18h～24h或45h～48h。金黄色葡萄球菌2、增菌和分离培养44金黄色葡萄球菌2.3金黄色葡萄球菌在Baird-Parker平板上，菌落直径为2mm～3mm，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一混浊带，在其外层有一透明圈。用接种针接触菌落有似奶油至树胶样的硬度，偶然会遇到非脂肪溶解的类似菌落；但无混浊带及透明圈。在血平板上，形成菌落较大，圆形、光滑凸起、湿润、金黄色（有时为白色），菌落周围可见完全透明溶血圈。挑取上述菌落进行革兰氏染色镜检及血浆凝固酶试验。金黄色葡萄球菌2.3金黄色葡萄球菌在Baird-Park45金黄色葡萄球菌3鉴定3.1染色镜检：金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球菌，排列呈葡萄球状，无芽胞，无荚膜，直径约为0.5μm～1μm。3.2血浆凝固酶试验：挑取、Baird-Parker平板或血平板上可疑菌落1个或以上，分别接种到5mLBHI和营养琼脂小斜面，36℃±1℃培养18h～24h。取新鲜配置兔血浆0.5mL，放入小试管中，再加入BHI培养物0.2mL～0.3mL，振荡摇匀，置36℃±1℃温箱或水浴箱内，每半小时观察一次，观察6h，如呈现凝固（即将试管倾斜或倒置时，呈现凝块）或凝固体积大于原体积的一半，被判定为阳性结果。同时以血浆凝固酶试验阳性和阴性葡萄球菌菌株的肉汤培养物作为对照。结果如可疑，挑取营养琼脂小斜面的菌落到5mLBHI，36℃±1℃培养18h～48h，重复试验。金黄色葡萄球菌3鉴定46金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌革兰氏染色镜检图金黄色葡萄球菌血浆凝固酶实验图金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌474、结果与报告4.1结果判定符合2.3、3，可判定为金黄色葡萄球菌4.2结果报告在25g（mL）样品中检出或未检出金黄色葡萄球菌。金黄色葡萄球菌4、结果与报告金黄色葡萄球菌48溶血性链球菌溶血性链球菌又称沙培林,对热和化学清毒剂均敏感，常引起扁桃体、咽部、中耳等感染。亦为肾盂肾炎、产褥热、猩红热的病原体。链球菌呈球形或椭圆形，直径0.6-1.0μm，呈链状排列，长短不一，从4-8个至20-30个菌细胞组成不等，链的长短与细菌的种类及生长环境有关。该菌不形成芽胞，无鞭毛，易被普通的碱性染料着色，革兰氏阳性，老龄培养或被中性粒细胞吞噬后，转为革兰氏阴性。溶血性链球菌溶血性链球菌又称沙培林,对热和化学清毒剂均敏感，49检验标准GB4789.11-2014食品安全国家标准食品微生物学检验β型溶血性链球菌检验β型溶血：在菌落周围形成完全透明的溶血环，红细胞完全溶解。β型溶血性链球菌：能够产生β型溶血的化脓（或A群）链球菌（Streptococcuspyogenes）和无乳（或B群）链球菌（Streptococcusagalactiae）。溶血性链球菌检验标准溶血性链球菌50检验程序如下图溶血性链球菌检验程序如下图溶血性链球菌51操作步骤1、样品处理及增菌按无菌操作称取检样25g（mL），加入盛有225mLmTSB的均质袋中，用拍击式均质器均质1min～2min；或加入盛有225mLmTSB的均质杯中，以8000r/min～10000r/min均质1min～2min。若样品为液态，振荡均匀即可。36℃±1℃培养18h～24h。溶血性链球菌操作步骤溶血性链球菌522、分离将增菌液划线接种于哥伦比亚CNA血琼脂平板，36℃±1℃厌氧培养18h～24h，观察菌落形态。溶血性链球菌在哥伦比亚CNA血琼脂平板上的典型菌落形态为直径约2mm～3mm，

灰白色、半透明、光滑、表面突起、圆形、边缘整齐，并产生β型溶血。溶血性链球菌2、分离溶血性链球菌536、鉴定7、结果与报告综合以上试验结果，报告每25g（mL）检样中检出或未检出溶血性链球菌。溶血性链球菌6、鉴定溶血性链球菌54米酒原始记录米酒原始记录55米酒的检验技术及规范操作米酒的检验技术及规范操作56内容背景1检验依据2检验项目3记录及报告4内容背景1检验依据2检验项目3记录及报告457背景总批数合格数不合格数不合格项合格率78780/100%孝感市食品药品检验检测中心米酒检验概况表12015年度米酒微生物检验汇总表背景总批数合格数不合格数不合格项合格率78780/100%58米酒检验标准NY/T1885-2010绿色食品米酒1DB42/T27-2009孝感米酒23四十九类食品产品生产许可证审查细则汇编米酒检验标准NY/T1885-2010绿色食品米酒1D59米酒检验标准NY/T1885-2010绿色食品米酒适用于各类绿色食品米酒表2卫生指标项目指标菌落总数b，cfu/g≤50大肠菌群b，MPN/g＜3致病菌（沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌）不得检出商业无菌商业无菌a

仅适用于罐头包装产品。b

仅适用于非罐头包装产品。米酒检验标准NY/T1885-2010绿色食品米酒表260大肠菌群GB4789.3-2010沙门氏菌GB4789.4-2010溶血性链球菌GB4789.11-2014金黄色葡萄球菌GB4789.10-2010菌落总数GB4789.2-2010志贺氏菌GB4789.5-2012NY/T1885-2010绿色食品米酒米酒检验标准大肠菌群沙门氏菌溶血性链球菌金黄色葡萄球菌菌落总数志贺氏菌N61DB42/T27-2009孝感米酒适用于孝感市孝南区生产的以孝感籼糯为主要原料，经特种酒曲发酵，可添加白砂糖、木耳、桂花、红枣等辅料，加工制成的固形物小于48%的孝感米酒饮品。米酒检验标准表3微生物指标项目要求细菌总数/（cfu/g）≤100大肠菌群/（MPN/100g）≤6致病菌（沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌）不得检出DB42/T27-2009孝感米酒米酒检验标准表3微生62大肠菌群GB/T4789.3-2003沙门氏菌GB4789.4-2010溶血性链球菌GB4789.11-2014金黄色葡萄球菌GB4789.10-2010菌落总数GB4789.2-2010志贺氏菌GB4789.5-2012DB42/T27-2009孝感米酒米酒检验标准大肠菌群沙门氏菌溶血性链球菌金黄色葡萄球菌菌落总数志贺氏菌D63四十九类食品产品生产许可证审查细则汇编附件34：其他酒生产许可证审查细则（2006版）检验项目：发证检验、监督检验、出厂检验分别按下表列出的相应检验项目进行。出厂检验项目栏中注有“*”标记的，企业应当每年检验2次。米酒检验标准序号项目名称发证监督出厂备注9肠道致病菌√√*仅对发酵酒表4产品质量检验项目表四十九类食品产品生产许可证审查细则汇编米酒检验标准序号项目名64菌落总数大肠菌群沙门氏菌志贺氏菌金黄色葡萄球菌检验项目溶血性链球菌菌落总数大肠菌群沙门氏菌志贺氏菌金黄色葡萄球菌检验项目溶血性65菌落总数检验标准：GB4789.2-2010食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定菌落总数：食品检样经过处理，在一定条件下（如培养基、培养温度和培养时间等）培养后，所得每g检样中形成的微生物菌落总数。菌落总数检验标准：66菌落总数菌落总数67制备1:100样品匀液制备1:10样品匀液制备10倍样品匀液取样并制备平板称取25g

样品置盛有225mL

磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8000r/min～10000r/min均质1min～2min，或放入盛有225mL稀释液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min～2min，制成

1:10

的样品匀液。

用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1mL，沿管壁缓慢注于盛有9mL稀释液的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1:100

的样品匀液。按上一步操作程序，制备10倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用1次1mL无菌吸管或吸头。选择2个～3个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），在进行10倍递增稀释时，吸取1mL样品匀液于无菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。同时，分别吸取1mL空白稀释液加入两个无菌平皿内作空白对照。及时将15mL～20mL

冷却至46℃

的平板计数琼脂培养基（可放置于46℃±1℃恒温水浴箱中保温）倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。1、样品的稀释菌落总数制备1:100样品匀液制备1:10样品匀液制备10倍样品匀液68菌落总数2、培养2.1待琼脂凝固后，将平板翻转，36℃±1℃培养48h±2h。2.2如果样品中可能含有在琼脂培养基表面弥漫生长的菌落时，可在凝固后的琼脂表面覆盖一薄层琼脂培养基（约4mL），凝固后翻转平板，按2.1条件进行培养。菌落总数2、培养691选取菌落数在30CFU～300CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于30CFU的平板记录具体菌落数，大于300CFU的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。3当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。2其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2，代表一个平板菌落数。菌落总数3、菌落计数可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位（colony-formingunits，CFU）表示。1选取菌落数在30CFU～300CFU之间、无蔓延菌70菌落总数4、结果与报告4.1菌落总数的计算方法4.1.1若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每g（mL）样品中菌落总数结果。4.1.2若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按公式（1）计算

N=∑C/(n1+0.1n2)d………………（1）式中：N——样品中菌落数；∑C——平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和；n1——第一稀释度（低稀释倍数）平板个数；n2——第二稀释度（高稀释倍数）平板个数；d——稀释因子（第一稀释度）。

菌落总数4、结果与报告71菌落总数4.2菌落总数的报告4.2.1菌落数小于100CFU时，按“四舍五入”原则修约，以整数报告。4.2.2菌落数大于或等于100CFU时，第3位数字采用“四舍五入”原则修约后，取前2位数字，后面用0代替位数；也可用10的指数形式来表示，按“四舍五入”原则修约后，采用两位有效数字。4.2.3若所有平板上为蔓延菌落而无法计数，则报告菌落蔓延。4.2.4若空白对照上有菌落生长，则此次检测结果无效。4.2.5称重取样以CFU/g为单位报告，体积取样以CFU/mL为单位报告。菌落总数4.2菌落总数的报告72大肠菌群计数检验标准：GB/T4789.3-2003食品卫生微生物学检验大肠菌群测定检验程序见下图大肠菌群计数检验标准：73大肠菌群计数GB4789.3-2010食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数大肠菌群：在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽孢杆菌。包括肠杆菌科的埃希氏菌属、柠檬酸杆菌属、肠杆菌属和克雷伯氏菌属。大肠菌群与肠道致病菌的来源相同，在外界中的生存力接近，在检验方法上，也以大肠菌群的检验计数简便易行，因此可作为水、土壤、乳品、食品饮料等被粪便污染的间接指标。大肠菌群计数GB4789.3-2010食品安全国家标准74大肠菌群计数GB4789.3-2010第一法大肠菌群MPN计数法检验程序如下图大肠菌群计数GB4789.3-2010第一法大肠菌群M75大肠菌群计数大肠埃希氏菌大肠杆菌（Escherichiacoli，E.coli）革兰氏阴性短杆菌，大小0.5×1～3微米。周生鞭毛，能运动，无芽孢。能发酵多种糖类产酸、产气，是人和动物肠道中的正常栖居菌，婴儿出生后即随哺乳进入肠道，与人终身相伴，几乎占粪便干重的1/3。大肠菌群计数大肠埃希氏菌76大肠菌群计数液体样品：以无菌吸管吸取25mL样品置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1:10的样品匀液。用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1mL，沿管壁缓缓注入9mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1支1mL无菌吸管反复吹打，使其混合均匀，制成1:100的样品匀液。根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释1次，换用1支1mL无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15min。1、样品的稀释大肠菌群计数液体样品：以无菌吸管吸取25mL样品置盛有22577大肠菌群计数2、初发酵试验每个样品，选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1mL（如接种量超过1mL，则用双料LST肉汤），36℃±1℃培养24h±2h，观察倒管内是否有气泡产生，24h±2h产气者进行复发酵试验，如未产气则继续培养至48h±2h，产气者进行复发酵试验。未产气者为大肠菌群阴性。大肠菌群计数2、初发酵试验78大肠菌群计数3、复发酵试验用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物1环，移种于煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）管中，36℃±1℃培养48h±2h，观察产气情况。产气者，计为大肠菌群阳性管。4、报告按3确证的大肠菌群LST阳性管数，检索MPN表（见附录B），报告每g（mL）样品中大肠菌群的MPN值。大肠菌群计数3、复发酵试验79大肠菌群计数大肠菌群计数80大肠菌群检验标准：GB/T4789.3-2003食品卫生微生物学检验大肠菌群测定检验程序见下图大肠菌群检验标准：81大肠菌群制备1:100样品匀液制备1:10样品匀液制备10倍样品匀液移取样品以无菌操作将检样25g（mL）放于含有225mL灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内（瓶内预置适当数量的玻璃珠）或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨做成1:10的均匀稀释液。固体检样最好用均质器，以8000r/min～10000r/min的速度处理1min，做成1:10的均匀稀释液。

用1mL无菌吸管吸取1:10稀释液1mL，注入含有9mL灭菌生理盐水或其他稀释液的试管中，振摇试管混合均匀，制成1:100的样品匀液。另取1mL灭菌吸管，按上条操作依次做10倍递增稀释液，每递增稀释一次，换用1支1mL灭菌吸管。根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计，选择三个稀释度，每个稀释度，接种三管。1、样品的稀释大肠菌群制备1:100样品匀液制备1:10样品匀液制备10倍82大肠菌群2、乳糖发酵试验将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内，接种量在1mL以上者，用双料乳糖胆盐发酵管，1mL及以下者，用单料乳糖胆盐发酵管。每一稀释度接种三管，置36℃±1℃培养24h±2h，如所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则可报告为大肠菌群阴性，如有产气者，则按下列程序进行。3、分离培养将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上，置36℃±1℃温箱内，培养18h~24h，然后取出，观察菌落形态，并做革兰氏染色和证实试验。伊红美蓝琼脂：伊红Y和美蓝抑制绝大部分革兰氏阳性菌的生长。伊红Y为酸性染料，美蓝为碱性染料，琼脂是凝固剂。大肠菌群发酵乳糖产酸时，细菌带正电荷，所以染上伊红(红色)，再与美蓝结合形成紫黑色菌落，大部分有金属光泽。大肠菌群2、乳糖发酵试验伊红美蓝琼脂：伊红Y和美蓝抑制绝大部83大肠菌群4、证实试验在上述平板上，挑取可疑大肠菌群菌落1~2个进行革兰氏染色，同时接种乳糖发酵管，置36℃±1℃培养24h±2h，观察产气情况，凡乳糖管产气、革兰氏染色为阴性的无芽孢杆菌，即可报告为大肠菌群阳性。5、报告根据证实为大肠菌群阳性的管数，查MPN检索表，报告每100mL（g）大肠菌群的MPN值。大肠菌群4、证实试验84沙门氏菌沙门氏菌是一种食源性致病菌94%沙门氏菌感染是由于摄食受污染的食品在养殖动物中广泛存在常通过动物源性食品传递给人是引起食物中毒爆发的主要病原菌之一革兰氏阴性杆菌，通常有鞭毛，不形成芽孢沙门氏菌沙门氏菌是一种食源性致病菌85沙门氏菌检验标准：GB4789.4-2010食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验检验程序如下图沙门氏菌检验标准：86沙门氏菌操作步骤1、前增菌称取25g（mL）样品放入盛有225mLBPW的无菌均质杯中，以8000r/min～10000r/min均质1min～2min，或置于盛有225mLBPW的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min～2min。若样品为液态，不需要均质，振荡混匀。如需测定pH值，用1mol/mL无菌NaOH或HCl调pH至6.8±0.2。无菌操作将样品转至500mL锥形瓶中，如使用均质袋，可直接进行培养，于36℃±1℃培养8h～18h。如为冷冻产品,应在45℃以下不超过15min,或2℃～5℃不超过18h解冻。2、增菌轻轻摇动培养过的样品混合物，移取1mL，转种于10mLTTB内，于42℃±1℃培养18h～24h。同时，另取1mL，转种于10mLSC内，于36℃±1℃培养18h～24h。沙门氏菌操作步骤87沙门氏菌3、分离分别用接种环取增菌液1环，划线接种于一个BS琼脂平板和一个XLD琼脂平板（或HE琼脂平板或沙门氏菌属显色培养基平板）。于36℃±1℃分别培养18h～24h（XLD琼脂平板、HE琼脂平板、沙门氏菌属显色培养基平板）或40h～48h（BS琼脂平板），观察各个平板上生长的菌落，各个平板上的菌落特征见下表。沙门氏菌3、分离88沙门氏菌沙门氏菌分别在BS、XLD、HE、显色培养基平板上的菌落特征图沙门氏菌沙门氏菌分别在BS、XLD、HE、显色培养基平板上的89沙门氏菌4、生化试验5、血清学鉴定6、结果与报告综合以上生化试验和血清学鉴定的结果，报告25g（mL）样品中检出或未检出沙门氏菌。沙门氏菌4、生化试验90志贺氏菌(Shigella)，也称志贺菌或者痢疾杆菌，是一类革兰氏阴性、不活动、不产生孢子的杆状细菌，可引起人和其他哺乳类动物的细菌性痢疾。大小为0.5～0.7×2～3μm，无芽胞，无荚膜，无鞭毛，多数有菌毛，革兰氏阴性杆菌。细菌性痢疾简称菌痢。是志贺菌属引起的肠道传染病。临床表现主要有发冷、发热、腹痛、腹泻、里急后重、排粘液脓血样大便。菌痢常年散发，夏秋多见，是我国的常见病、多发病。志贺氏菌志贺氏菌(Shigella)，也称志贺菌或者痢疾杆菌，是一类91志贺氏菌检验标准：GB4789.5-2012食品安全国家标准食品微生物学检验志贺氏菌检验检验程序如下图志贺氏菌检验标准：92志贺氏菌操作步骤：1、增菌以无菌操作取检样25g（mL），加入装有灭菌225mL志贺氏菌增菌肉汤的均质杯，用旋转刀片式均质器以8000r/min～10000r/min均质；或加入装有225mL志贺氏菌增菌肉汤的均质袋中，用拍击式均质器连续均1min～2min，液体样品振荡混匀即可。于41.5℃±１℃，厌氧培养16h～20h。志贺氏菌操作步骤：93志贺氏菌2、分离取增菌后的志贺氏增菌液分别划线接种于XLD琼脂平板和MAC琼脂平板或志贺氏菌显色培养基平板上，于36℃±1℃培养20h～24h，观察各个平板上生长的菌落形态。宋内氏志贺氏菌的单个菌落直径大于其他志贺氏菌。若出现的菌落不典型或菌落较小不易观察，则继续培养至48h再进行观察。志贺氏菌在不同选择性琼脂平板上的菌落特征见表1。志贺氏菌2、分离94志贺氏菌志贺氏菌在XLD、MAC培养基平板上的菌落特征图志贺氏菌志贺氏菌在XLD、MAC培养基平板上的菌落特征图95志贺氏菌3、生化试验4、血清学鉴定5、结果与报告综合以上生化试验和血清学鉴定的结果，报告25g（mL）样品中检出或未检出志贺氏菌。志贺氏菌3、生化试验96金黄色葡萄球菌检验标准：GB4789.10-2010食品安全国家标准食品微生物学检验金黄色葡萄球菌检验程序如下图金黄色葡萄球菌检验标准：97金黄色葡萄球菌操作步骤1、样品的处理称取25g样品至盛有225mL7.5%氯化钠肉汤或10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤的无菌均质杯内，8000r/min～10000r/min均质1min～2min，或放入盛有225mL7.5%氯化钠肉汤或10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min～2min。若样品为液态，吸取25mL样品至盛有225mL7.5%氯化钠肉汤或10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤的无菌锥形瓶(瓶内可预置适当数量的无菌玻璃珠)中，振荡混匀。金黄色葡萄球菌操作步骤98金黄色葡萄球菌2、增菌和分离培养2.1将上述样品匀