素材：DNA限制性核酸内切酶问题释疑 高二下学期生物人教版选择性必修3

DNA限制性核酸内切酶问题释疑DNA限制性核酸内切酶是一种基因工程的工具酶，这类酶的最大功能特点有特异性，特异性体现序列和位点的切割。选择性必修3教材对限制性内切酶介绍过于简单，在做试题时，会产生多种疑问。新教材选择性必修3第100页1.为什么叫限制性核酸内切酶？20世纪30年代，微生物学家发现，微生物的噬菌体不能交叉感染，如EcoliK株的噬菌体只能感染EcoliK株，不能感染其他株，反之亦然。这种现象称为“限制现象”。1962年，W．Arber提出一个假设来解释上述现象。他认为这是细菌中有2种以上功能不同的酶，一种是核酸内切酶，能识别并切断外来DNA分子的某些部位，使外来DNA失去活性，限制外来噬菌体的繁殖，把这类酶称为限制性核酸内切酶。2.限制性核酸内切酶在微生物中的作用限制性核酸内切酶是由细菌产生的，其生理意义是提高自身的防御能力，限制酶一般不切割自身的DNA分子，只切割外源DNA。3.细菌的限制性核酸内切酶为什么不切割自己的DNA？细菌自身的DNA没有被分解的原因可以是通过自身的DNA甲基化，甲基化是常见的修饰作用，可使腺嘌呤A和胞嘧啶C甲基化而受到保护，即让它们在甲基转移酶的作用下，与甲基发生共价结合。通过甲基化作用达到识别自身遗传物质和外来遗传物质的目的。当然，也有可能不存在自身限制性核酸内切酶的识别序列。4.限制性核酸内切酶能不能切割RNA目前为止，还没有资料说明有切割RNA的限制性核酸内切酶。在进化的角度去看，理由可能是只能切割稳定的DNA，RNA本身一般是单链结构不稳定，不需要进行切割防御。事实证明，熟悉的限制性核酸内切酶的识别序列都有碱基T。5.不同的限制性内切酶（同尾酶）切割连接后，还能不能这两种酶的某一种切开？不一定，除非是产生平末端的限制性内切酶，因为粘性末端配对后，序列可能发生了改变，这两种酶就无法切开（见下列试题）。试题解析

试题：下表中列出了几种限制性核酸内切酶识别序列及其切割位点，图1、图2中箭头表示相关限制性核酸内切酶的酶切位点。请回答下列问题：

（1）用图中质粒和目的基因构建重组质粒，应选用

两种限制性核酸内切酶切割，酶切后的载体和目的基因片段，通过

酶作用后获得重组质粒。（2）为了筛选出转入了重组质粒的大肠杆菌，应在筛选平板培养基中添加

。（3）若BamHⅠ酶切的DNA末端与BclⅠ酶切的DNA末端连接，连接部位的6个碱基对序列为

，对于该部位，这两种酶

(填“都能”“都不能”或“只有一种能”)切开。（4）若用Sau3AⅠ切割质粒，最多可能获得

种大小不同的DNA片段。答案：（1）BclⅠ和HindⅢDNA连接（2）四环素（3）都不能（4）7解析：（1）在构建重组质粒时，需用限制性核酸内切酶切割质粒和目的基因，为提高重组效率使用两种限制性核酸内切酶，使质粒和目的基因两端产生不同的粘性末端，从而防止自身环化和倒接。选择BclⅠ和HindⅢ两种限制性核酸内切酶切割，酶切后的载体和目的基因片段，通过DNA连接酶作用后获得重组质粒。Sau3AⅠ和BamHⅠ可以产生与BclⅠ相同的粘性末端，而且BamHⅠ在质粒的四环素抗性基因和氨苄青霉素抗性基因都有酶切点，使用BamHⅠ酶切后质粒将被破坏，所以上述两种酶不能用。(2)当选择BclⅠ和HindⅢ两种限制性核酸内切酶切割质粒后，氨苄青霉素抗性基因被破坏，而四环素抗性基因完整可作为标记基因，为了筛选出转入了重组质粒的大肠杆菌，应在筛选平板培养基中添加四环素，这样导入质粒或重组质粒的大肠杆菌可以生长，其余不能生长。(3)用BamHⅠ酶切的DNA末端为，而BclⅠ酶切的DNA末端为，若将两者连接，则重新连接部位的6个碱基对序列为，若旋转180°就是。而对重新连接部位用BamHⅠ酶和BclⅠ酶都不能识别，也不能切开。(4)仔细观察表中Sau3AⅠ与其他酶的识别序列和酶切位点，可以发现Sau3AⅠ能切开BamHⅠ和BclⅠ的识别序列，这样用Sau3AⅠ切图1质粒，就有3个不同切点，如图，若3个切点同时切开会出现①②③3个片段，但S