酶分子的化学修饰课件

第五章酶分子的化学修饰

酶分子化学修饰：就是在分子水平上对酶进行改造，以达到改构和改性的目的。在体外将酶分子通过人工的方法与一些化学物质，特别是一些有生物相容性的物质进行共价连接，从而改变酶的结构和性质。这些化学物质称为修饰试剂，酶化学修饰主要用于基础酶学的研究和疾病治疗。第五章酶分子的化学修饰酶分子化学修饰：就是在分子1酶化学修饰的应用领域在基础酶学研究上探测酶活性必需氨基酸的性质和数目酶蛋白一级结构的测定酶蛋白的结构变化与运动酶蛋白部分区域的构象状态酶的作用机理与催化反应历程酶分子的拓扑学以及寡聚酶的亚基结合状态酶的固定化技术酶纯度的分析与检测酶化学修饰的应用领域在基础酶学研究上2在疾病治疗上克服酶在体内的不稳定性消除或降低酶的抗原性有助于酶分子到达并集中于病灶细胞在工业上的应用酶稳定性提高，使生产成本降低反应条件的改善和酶寿命的延长导致生产工艺的技术革新和改进。在疾病治疗上3主要研究内容第一节酶分子的化学修饰方法第二节酶化学修饰的基本要求第三节酶蛋白肽链的大分子修饰第四节修饰酶的化学性质主要研究内容第一节酶分子的化学修饰方法4第一节酶分子的化学修饰方法一、酶的表面修饰（一）化学固定化：一般是直接通过酶表面的氨基酸残基将酶分子共价连接到惰性载体上；由于载体的引入，使酶所处的微环境发生改变，进而改变了酶的性质，特别是动力学性质发生了改变。第一节酶分子的化学修饰方法一、酶的表面修饰5（二）酶的小分子修饰作用主要是利用一些小分子修饰试剂，通过共价结合来修饰酶的一些基团（如-COO-、-NH3+、-SH、-OH、咪唑基等），提高酶的稳定性。常用的小分子修饰试剂有乙基、糖基和甲基等。（二）酶的小分子修饰作用6（三）酶的大分子修饰作用可分为非共价修饰和共价修饰两大类：1、大分子非共价修饰：利用一些大分子试剂通过与酶非共价相互作用，对酶进行有效的保护。例如聚乙二醇、右旋糖苷等通过氢键固定于酶分子的表面，同时又有效地与外部水相连，从而保护酶的活力；一些多元醇、多糖、多聚氨基酸、多胺等能通过调节酶的微环境来保护酶活力；另外一些蛋白质可以通过相互作用，排除分子表面的水分子，降低介电常数，使酶的稳定性增加。（三）酶的大分子修饰作用72、大分子共价修饰：利用一些可溶性大分子，通过共价键连接于酶分子的表面，形成一层覆盖层，形成的可溶性酶具有许多有用的性质。例如用聚乙二醇共价修饰超氧化物歧化酶（SOD），不仅可以降低或消除酶的抗原性，而且提高了抗蛋白酶的能力，延长了半衰期，从而提高了药效。2、大分子共价修饰：利用一些可溶性大分子，通过共价键连接于酶8（四）分子内交联：增加酶分子表面的交联键数目是提高酶稳定性的有效方法之一，例如胰凝乳蛋白酶上的羧基经过羰二亚胺活化后，可以与一系列二胺发生作用，使酶的稳定性得到改善。（四）分子内交联：增加酶分子表面的交联键数目是提高酶稳定性的9（五）分子间交联：利用一些双功能或多功能试剂将不同的酶交联在一起形成杂化酶。例如用戊二醛把胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶交联在一起，可以降低胰凝乳蛋白酶的自溶性；将胰蛋白酶与碱性磷酸脂酶交联形成的杂化酶可作为部分代谢途径的模型。（五）分子间交联：利用一些双功能或多功能试剂将不同的酶交联在10（六）脂质体包埋：一些医药用酶，如SOD、溶菌酶等，由于分子量较大，不易进入人体细胞内，而且在体内半衰期短，产生免疫原性反应；用脂质体包埋法纪可解决这些问题。制止提是天然脂类或类固醇组成的微球体，酶分子包埋在其内部，可以通过与细胞的膜融合或内吞作用而进入细胞内。（六）脂质体包埋：一些医药用酶，如SOD、溶菌酶等，由于分11（七）反相胶团微囊化：这是近年来发展起来的酶在有机相中进行催化的技术，反相胶团中酶的稳定性大大提高；一些表面活性剂溶解在非极性有机溶剂中时可自发地形成近似球状的反相胶团，反相胶团是表面活性剂的疏水尾部朝外而极性头部朝内的微胶团，其内部可容纳一定量的水，酶溶解在其中避免变性（见图）。（七）反相胶团微囊化：这是近年来发展起来的酶在有机相中进行催12

加H2O

疏水尾部

亲水头部

加酶液

S

PEEE

图：反相胶团的结构和酶的分布加H2O疏水尾部亲水头部加酶液SPEEE图：反13二、酶分子的内部修饰（一）非催化活性基团的修饰：通过对非催化残基的修饰可以改变酶的动力学性质，改变酶对特殊底物的亲和力；通常可被修饰的氨基酸残基既可以是亲核的，也可以是亲电子的，还可以是是可氧化残基。（二）酶蛋白主链的修饰：主要是靠酶法进行修饰，用蛋白酶对主联进行部分水解，可以改变酶的催化特性。二、酶分子的内部修饰14（三）催化活性基团的修饰：通过选择性修饰催化活性氨基酸的侧链来实现氨基酸残基的取代，使一种氨基酸侧链转化为另一种氨基酸侧链，这种方法又称为化学突变法。（四）肽链伸展后的修饰：酶蛋白经过脲、盐酸胍处理，使肽链充分伸展，对酶分子内部的疏水基团进行修饰，然后在适当条件下，重新进行折叠。（三）催化活性基团的修饰：通过选择性修饰催化活性氨基酸的侧链15三、与辅因子相关的修饰对依赖辅因子的酶可用两种方法进行修饰：如果辅因子与酶是非共价结合的,可以将辅因子共价结合于酶分子上；引入新的具有更强反应的辅因子。四、金属酶的金属取代酶分子中的金属离子可以被其他金属离子取代，可以改变酶的专一性、稳定性等。三、与辅因子相关的修饰16第二节酶化学修饰的基本要求一、被修饰酶的性质（一）酶的稳定性：包括热稳定性、酸碱稳定性，作用温度以及pH，酶蛋白解离时的电化学性质，抑制剂的性质等。（二）酶活性中心的状况：包括酶分子活性中心的组成，如参与活性中心的氨基酸残基、辅因子等。酶分子的形状、大小以及寡聚酶的亚基组成。第二节酶化学修饰的基本要求一、被修饰酶的性质17（三）酶侧链基团的性质与反应性质1、对巯基的化学修饰：常用的修饰试剂有烷化剂、汞试剂和Ellman试剂等。2、氨基的化学修饰：常用的修饰试剂有乙酸酐、2，4，6-三硝基苯磺酸、2，4-二硝基氟苯、烷基化试剂、丹磺酰氯(DNS)和苯异硫氰酸酯（PITC）等。（三）酶侧链基团的性质与反应性质183、羧基的化学修饰：水溶性羰二亚胺或氨化反应、硼氟化三甲锌盐反应、甲醇-盐酸酯化反应等。4、咪唑基的修饰反应：焦碳酸二乙酯反应、碘代反应、碘化反应等。3、羧基的化学修饰：195、吲哚基的化学修饰：2-羟基-5-硝基苄溴、光敏试剂、4-硝基苯硫氯等。6、甲硫氨酸侧链基团的化学修饰：H2O2、光敏试剂、碘代乙酰胺等。7、二硫键的化学修饰：2-巯基乙醇、二硫苏糖醇、过甲酸等。5、吲哚基的化学修饰：208、酚基的化学修饰：N-乙酰咪唑、碘化反应、四硝基甲烷、偶氮化试剂、二异丙基氟磷酸。9、胍基的化学修饰：丁二酮、1，2-环己二酮、苯乙二醛等。8、酚基的化学修饰：21二、修饰反应的条件：修饰反应应尽量在酶稳定条件下进行，并尽量不破坏酶活性必需基团，修饰率高，活力回收要高。（一）pH与离子强度：pH决定了酶分子中反应基团的解离状态，酶的解离状态不同，其反应性能也不同；另一方面，有些修饰试剂在不同pH下，与同一种基团反应可以形成不同的产物。离子强度对修饰反应也有重要影响。二、修饰反应的条件：修饰反应应尽量在酶稳定条件下进行，并尽量22（二）修饰反应的温度与时间：

严格控制反应温度和时间可以减少或消除一些非专一性的修饰反应。（三）反应体系中酶与修饰剂的比例：

酶与修饰试剂的比例可以控制酶分子的修饰程度。（二）修饰反应的温度与时间：23三、酶蛋白修饰反应的主要类型酯化及相关反应烷基化反应氧化还原反应芳香环取代反应溴化氰裂解反应三、酶蛋白修饰反应的主要类型24第三节酶蛋白肽链的大分子修饰一、聚乙二醇及其修饰反应：聚乙二醇（PEG）是线性大分子，具有良好的生物相容性和水溶性，在体内无毒性、无残留、无免疫原性，并可消除酶分子的抗原性，被广泛用于酶的修饰。第三节酶蛋白肽链的大分子修饰一、聚乙二醇及其修饰反应：聚25聚乙二醇末端活化后可以与酶产生交联，使酶分子被覆盖上一层疏松的亲水外壳，导致动力学发生改变，从而产生许多有用的性质，如可以在广泛的pH范围内溶解、不被离子交换剂吸附，电泳迁移率下降等。主要的修饰方法有：叠氮法、琥珀酸酐法、羰二亚胺法、重氮法。聚乙二醇末端活化后可以与酶产生交联，使酶分子被覆盖上一层疏松26二、糖类的修饰反应右旋糖苷及右旋糖苷硫酸酯修饰反应：右旋糖苷是由-葡萄糖通过-1，6-糖苷键连接而成的高分子多糖，具有良好的生物相容性和水溶性，其双羟基经过活化后可与酶分子上的游离氨基相结合。主要的修饰方法有：溴化氰法、高碘酸氧化法。二、糖类的修饰反应27糖肽（Glycopeptide)的修饰反应:

糖肽是由人纤维蛋白或-球蛋白经蛋白酶水解后得到的产物，其分子上具有游离氨基，活化后可与酶分子上的氨基反应。主要方法有：2，3-异氰酸甲苯活化法、戊二醛法。聚乳糖修饰反应：聚乳糖在一定温度下，通过适当的还原剂可与酶分子上氨基反应。糖肽（Glycopeptide)的修饰反应:糖肽是由人纤28三、合成大分子多聚物修饰酶聚N-乙烯吡咯烷酮(PVP):用水溶性的分子量为10,000的PVP,经过开环水解,活化后,与酶结合。聚乙烯醇(PVA):PVA与对硝基苯氧酰氯反应，其硝基再用连二亚硫酸钠还原为氨基，与酶分子中的羧基共价连接。聚丙烯醇(PAA):用分子量为250，000的PAA，经过N-羟基琥珀酰亚胺活化后与酶的氨基反应。三、合成大分子多聚物修饰酶29聚顺丁烯二酸酐:用分子量为98，000的聚顺丁烯二酸酐，可以直接与酶分子的氨基发生反应。聚氨基酸：用分子量为5，700的聚赖氨酸做修饰剂时，其氨基与酶分子上的羧基通过羰二亚胺产生交联。用丙氨酸的二肽或三肽做修饰剂时，其酸酐可以与酶发生反应。聚顺丁烯二酸酐:用分子量为98，000的聚顺丁烯二酸酐，可以30四、天然大分子对酶的修饰反应肝素：肝素由氨基葡萄糖和两种糖醛酸组成，平均分子量约为20，000，是一种含硫酸酯的黏多糖；经过肝素修饰的酶具有良好的稳定性，不仅可以提高酶的疗效，而且具有抗血凝、抗血栓、降血脂等活性。目前常用羰二亚胺法、三氯均嗪法和溴化氰法活化肝素，对酶分子进行修饰。四、天然大分子对酶的修饰反应31人血清蛋白：常用戊二醛法、羰二亚胺法和活性酯法对人血清蛋白进行活化，然后对酶分子进行修饰。人血清蛋白：常用戊二醛法、羰二亚胺法和活性酯法对人血清蛋白进32第四节修饰酶的化学性质一、热稳定性：一般来说，经过化学修饰的酶，热稳定性有较大的提高。主要是由于修饰试剂的多个功能基团与酶分子的多个功能基团相互交联增加了酶分子构象的稳定性（表5-1）。二、抗原性：修饰酶的抗原性与修饰剂有关，目前比较公认的是PEP和人血清白蛋白在消除酶分子抗原性方面效果较好（表5-2）。第四节修饰酶的化学性质一、热稳定性：一般来说，经过化学修33表5-1天然酶和修饰酶的热稳定性比较酶修饰剂修饰酶天然酶处理条件(℃/时间)残留酶活(%)酰苷脱氢酶

胰蛋白酶

过氧化氢酶

溶菌酶

尿激酶糜蛋白酶

右旋糖苷

右旋糖苷

右旋糖苷

右旋糖苷

人血清白蛋白

肝素

37/100min

100/30min

50/10min

100/30min

37/48h

37/24h

70

100

46

64

40

90

20

99

80

0

95

50表5-1天然酶和修饰酶的热稳定性比较酶修饰剂修饰酶34酶L-Asn酶SOD酶Gln-Aln酶尿酸酶腺苷脱氢酶Arg酶过氧化氢酶胰蛋白酶抗原性修饰剂-葡萄糖苷酶核糖核酸酶酶PEGPEGPEGPEGPEGPEG白蛋白白蛋白白蛋白Poly-DL-Ala消除消除消除消除消除消除消除降低降低消除表5-2修饰酶的抗原性变化酶L-Asn酶SOD酶Gln-Aln酶尿酸酶腺苷脱氢酶35三、对各类失活因子的抵抗力:化学修饰酶与天然酶相比,对蛋白酶、抑制剂等失活因子的抵抗力均有不同程度的提高（表5-3）。四、修饰酶在体内的半衰期：多数修饰酶在体内的半衰期得到有效延长（表5-4）。三、对各类失活因子的抵抗力:化学修饰酶与天然酶相比,对蛋白酶36五、最适pH:大多数酶经化学修饰后，最适pH发生了变化，这在应用上具有重要意义（表5-5）。六、Km的变化:有些酶经化学修饰后，Km变大，这可能是由于屏蔽效应引起的。五、最适pH:大多数酶经化学修饰后，最适pH发生了变化，这在37表5-3天然酶和修饰酶抗失活因子能力比较酶抗抑制剂抗蛋白酶修饰剂抗失活剂过氧化氢酶核糖核酸酶溶菌酶胰蛋白酶-葡萄糖苷酶尿激酶右旋糖苷右旋糖苷右旋糖苷右旋糖苷白蛋白右旋糖苷抗胰蛋白酶抗蛋白酶抗糜蛋白酶抗胰蛋白酶抗SDS抗大豆抑制剂抗胃蛋白酶抗胎盘抑制剂——抗尿素抗SDS表5-3天然酶和修饰酶抗失活因子能力比较酶抗抑制剂抗蛋白酶38表5-4天然酶与修饰酶的半衰期比较酶羧肽酶Arg酶Gln-Asn酶尿酸酶超氧化物岐化酶过氧化氢酶修饰剂半衰期天然酶修饰酶白蛋白白蛋白糖肽右旋糖苷右旋糖苷PEG3.5h17h1.4h1h4h6min6h12h8h20h4h8h表5-4天然酶与修饰酶的半衰期比较酶羧肽酶Arg酶Gln39表5-5天然酶与修饰酶的最适pH酶修饰酶天然酶修饰剂糜蛋白酶猪肝尿酸酶吲哚-3-链烷羟化酶猪肝尿酸酶产沅假丝酵母尿酸酶白蛋白PEGPEG聚丙烯酸肝素10.57.4-8.55.0-5.59.08.83.58.28.28.09.0表5-5天然酶与修饰酶的最适pH酶修饰酶天然酶修饰剂糜蛋白40THANKYOUTHANKYOU41第五章酶分子的化学修饰

酶分子化学修饰：就是在分子水平上对酶进行改造，以达到改构和改性的目的。在体外将酶分子通过人工的方法与一些化学物质，特别是一些有生物相容性的物质进行共价连接，从而改变酶的结构和性质。这些化学物质称为修饰试剂，酶化学修饰主要用于基础酶学的研究和疾病治疗。第五章酶分子的化学修饰酶分子化学修饰：就是在分子42酶化学修饰的应用领域在基础酶学研究上探测酶活性必需氨基酸的性质和数目酶蛋白一级结构的测定酶蛋白的结构变化与运动酶蛋白部分区域的构象状态酶的作用机理与催化反应历程酶分子的拓扑学以及寡聚酶的亚基结合状态酶的固定化技术酶纯度的分析与检测酶化学修饰的应用领域在基础酶学研究上43在疾病治疗上克服酶在体内的不稳定性消除或降低酶的抗原性有助于酶分子到达并集中于病灶细胞在工业上的应用酶稳定性提高，使生产成本降低反应条件的改善和酶寿命的延长导致生产工艺的技术革新和改进。在疾病治疗上44主要研究内容第一节酶分子的化学修饰方法第二节酶化学修饰的基本要求第三节酶蛋白肽链的大分子修饰第四节修饰酶的化学性质主要研究内容第一节酶分子的化学修饰方法45第一节酶分子的化学修饰方法一、酶的表面修饰（一）化学固定化：一般是直接通过酶表面的氨基酸残基将酶分子共价连接到惰性载体上；由于载体的引入，使酶所处的微环境发生改变，进而改变了酶的性质，特别是动力学性质发生了改变。第一节酶分子的化学修饰方法一、酶的表面修饰46（二）酶的小分子修饰作用主要是利用一些小分子修饰试剂，通过共价结合来修饰酶的一些基团（如-COO-、-NH3+、-SH、-OH、咪唑基等），提高酶的稳定性。常用的小分子修饰试剂有乙基、糖基和甲基等。（二）酶的小分子修饰作用47（三）酶的大分子修饰作用可分为非共价修饰和共价修饰两大类：1、大分子非共价修饰：利用一些大分子试剂通过与酶非共价相互作用，对酶进行有效的保护。例如聚乙二醇、右旋糖苷等通过氢键固定于酶分子的表面，同时又有效地与外部水相连，从而保护酶的活力；一些多元醇、多糖、多聚氨基酸、多胺等能通过调节酶的微环境来保护酶活力；另外一些蛋白质可以通过相互作用，排除分子表面的水分子，降低介电常数，使酶的稳定性增加。（三）酶的大分子修饰作用482、大分子共价修饰：利用一些可溶性大分子，通过共价键连接于酶分子的表面，形成一层覆盖层，形成的可溶性酶具有许多有用的性质。例如用聚乙二醇共价修饰超氧化物歧化酶（SOD），不仅可以降低或消除酶的抗原性，而且提高了抗蛋白酶的能力，延长了半衰期，从而提高了药效。2、大分子共价修饰：利用一些可溶性大分子，通过共价键连接于酶49（四）分子内交联：增加酶分子表面的交联键数目是提高酶稳定性的有效方法之一，例如胰凝乳蛋白酶上的羧基经过羰二亚胺活化后，可以与一系列二胺发生作用，使酶的稳定性得到改善。（四）分子内交联：增加酶分子表面的交联键数目是提高酶稳定性的50（五）分子间交联：利用一些双功能或多功能试剂将不同的酶交联在一起形成杂化酶。例如用戊二醛把胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶交联在一起，可以降低胰凝乳蛋白酶的自溶性；将胰蛋白酶与碱性磷酸脂酶交联形成的杂化酶可作为部分代谢途径的模型。（五）分子间交联：利用一些双功能或多功能试剂将不同的酶交联在51（六）脂质体包埋：一些医药用酶，如SOD、溶菌酶等，由于分子量较大，不易进入人体细胞内，而且在体内半衰期短，产生免疫原性反应；用脂质体包埋法纪可解决这些问题。制止提是天然脂类或类固醇组成的微球体，酶分子包埋在其内部，可以通过与细胞的膜融合或内吞作用而进入细胞内。（六）脂质体包埋：一些医药用酶，如SOD、溶菌酶等，由于分52（七）反相胶团微囊化：这是近年来发展起来的酶在有机相中进行催化的技术，反相胶团中酶的稳定性大大提高；一些表面活性剂溶解在非极性有机溶剂中时可自发地形成近似球状的反相胶团，反相胶团是表面活性剂的疏水尾部朝外而极性头部朝内的微胶团，其内部可容纳一定量的水，酶溶解在其中避免变性（见图）。（七）反相胶团微囊化：这是近年来发展起来的酶在有机相中进行催53

加H2O

疏水尾部

亲水头部

加酶液

S

PEEE

图：反相胶团的结构和酶的分布加H2O疏水尾部亲水头部加酶液SPEEE图：反54二、酶分子的内部修饰（一）非催化活性基团的修饰：通过对非催化残基的修饰可以改变酶的动力学性质，改变酶对特殊底物的亲和力；通常可被修饰的氨基酸残基既可以是亲核的，也可以是亲电子的，还可以是是可氧化残基。（二）酶蛋白主链的修饰：主要是靠酶法进行修饰，用蛋白酶对主联进行部分水解，可以改变酶的催化特性。二、酶分子的内部修饰55（三）催化活性基团的修饰：通过选择性修饰催化活性氨基酸的侧链来实现氨基酸残基的取代，使一种氨基酸侧链转化为另一种氨基酸侧链，这种方法又称为化学突变法。（四）肽链伸展后的修饰：酶蛋白经过脲、盐酸胍处理，使肽链充分伸展，对酶分子内部的疏水基团进行修饰，然后在适当条件下，重新进行折叠。（三）催化活性基团的修饰：通过选择性修饰催化活性氨基酸的侧链56三、与辅因子相关的修饰对依赖辅因子的酶可用两种方法进行修饰：如果辅因子与酶是非共价结合的,可以将辅因子共价结合于酶分子上；引入新的具有更强反应的辅因子。四、金属酶的金属取代酶分子中的金属离子可以被其他金属离子取代，可以改变酶的专一性、稳定性等。三、与辅因子相关的修饰57第二节酶化学修饰的基本要求一、被修饰酶的性质（一）酶的稳定性：包括热稳定性、酸碱稳定性，作用温度以及pH，酶蛋白解离时的电化学性质，抑制剂的性质等。（二）酶活性中心的状况：包括酶分子活性中心的组成，如参与活性中心的氨基酸残基、辅因子等。酶分子的形状、大小以及寡聚酶的亚基组成。第二节酶化学修饰的基本要求一、被修饰酶的性质58（三）酶侧链基团的性质与反应性质1、对巯基的化学修饰：常用的修饰试剂有烷化剂、汞试剂和Ellman试剂等。2、氨基的化学修饰：常用的修饰试剂有乙酸酐、2，4，6-三硝基苯磺酸、2，4-二硝基氟苯、烷基化试剂、丹磺酰氯(DNS)和苯异硫氰酸酯（PITC）等。（三）酶侧链基团的性质与反应性质593、羧基的化学修饰：水溶性羰二亚胺或氨化反应、硼氟化三甲锌盐反应、甲醇-盐酸酯化反应等。4、咪唑基的修饰反应：焦碳酸二乙酯反应、碘代反应、碘化反应等。3、羧基的化学修饰：605、吲哚基的化学修饰：2-羟基-5-硝基苄溴、光敏试剂、4-硝基苯硫氯等。6、甲硫氨酸侧链基团的化学修饰：H2O2、光敏试剂、碘代乙酰胺等。7、二硫键的化学修饰：2-巯基乙醇、二硫苏糖醇、过甲酸等。5、吲哚基的化学修饰：618、酚基的化学修饰：N-乙酰咪唑、碘化反应、四硝基甲烷、偶氮化试剂、二异丙基氟磷酸。9、胍基的化学修饰：丁二酮、1，2-环己二酮、苯乙二醛等。8、酚基的化学修饰：62二、修饰反应的条件：修饰反应应尽量在酶稳定条件下进行，并尽量不破坏酶活性必需基团，修饰率高，活力回收要高。（一）pH与离子强度：pH决定了酶分子中反应基团的解离状态，酶的解离状态不同，其反应性能也不同；另一方面，有些修饰试剂在不同pH下，与同一种基团反应可以形成不同的产物。离子强度对修饰反应也有重要影响。二、修饰反应的条件：修饰反应应尽量在酶稳定条件下进行，并尽量63（二）修饰反应的温度与时间：

严格控制反应温度和时间可以减少或消除一些非专一性的修饰反应。（三）反应体系中酶与修饰剂的比例：

酶与修饰试剂的比例可以控制酶分子的修饰程度。（二）修饰反应的温度与时间：64三、酶蛋白修饰反应的主要类型酯化及相关反应烷基化反应氧化还原反应芳香环取代反应溴化氰裂解反应三、酶蛋白修饰反应的主要类型65第三节酶蛋白肽链的大分子修饰一、聚乙二醇及其修饰反应：聚乙二醇（PEG）是线性大分子，具有良好的生物相容性和水溶性，在体内无毒性、无残留、无免疫原性，并可消除酶分子的抗原性，被广泛用于酶的修饰。第三节酶蛋白肽链的大分子修饰一、聚乙二醇及其修饰反应：聚66聚乙二醇末端活化后可以与酶产生交联，使酶分子被覆盖上一层疏松的亲水外壳，导致动力学发生改变，从而产生许多有用的性质，如可以在广泛的pH范围内溶解、不被离子交换剂吸附，电泳迁移率下降等。主要的修饰方法有：叠氮法、琥珀酸酐法、羰二亚胺法、重氮法。聚乙二醇末端活化后可以与酶产生交联，使酶分子被覆盖上一层疏松67二、糖类的修饰反应右旋糖苷及右旋糖苷硫酸酯修饰反应：右旋糖苷是由-葡萄糖通过-1，6-糖苷键连接而成的高分子多糖，具有良好的生物相容性和水溶性，其双羟基经过活化后可与酶分子上的游离氨基相结合。主要的修饰方法有：溴化氰法、高碘酸氧化法。二、糖类的修饰反应68糖肽（Glycopeptide)的修饰反应:

糖肽是由人纤维蛋白或-球蛋白经蛋白酶水解后得到的产物，其分子上具有游离氨基，活化后可与酶分子上的氨基反应。主要方法有：2，3-异氰酸甲苯活化法、戊二醛法。聚乳糖修饰反应：聚乳糖在一定温度下，通过适当的还原剂可与酶分子上氨基反应。糖肽（Glycopeptide)的修饰反应:糖肽是由人纤69三、合成大分子多聚物修饰酶聚N-乙烯吡咯烷酮(PVP):用水溶性的分子量为10,000的PVP,经过开环水解,活化后,与酶结合。聚乙烯醇(PVA):PVA与对硝基苯氧酰氯反应，其硝基再用连二亚硫酸钠还原为氨基，与酶分子中的羧基共价连接。聚丙烯醇(PAA):用分子量为250，000的PAA，经过N-羟基琥珀酰亚胺活化后与酶的氨基反应。三、合成大分子多聚物修饰酶70聚顺丁烯二酸酐:用分子量为98，000的聚顺丁烯二酸酐，可以直接与酶分子的氨基发生反应。聚氨基酸：用分子量为5，700的聚赖氨酸做修饰剂时，其氨基与酶分子上的羧基通过羰二亚胺产生交联。用丙氨酸的二肽或三肽做修饰剂时，其酸酐可以与酶发生反应。聚顺丁烯二酸酐:用分子量为98，000的聚顺丁烯二酸酐，可以71四、天然大分子对酶的修饰反应肝素：肝素由氨基葡萄糖和两种糖醛酸组成，平均分子量约为20，000，是一种含硫酸酯的黏多糖；经过肝素修饰的酶具有良好的稳定性，不仅可以提高酶的疗效，而且具有抗血凝、抗血栓、降血脂等活性。目前常用羰二亚胺法、三氯均嗪法和溴化氰法活化肝素，对酶分子进行修饰。四、天然大分子对酶的修饰反应72人血清蛋白：常用戊二醛法、羰二亚胺法和活性酯法对人血清蛋白进行活化，然后对酶分子进行修饰。人血清蛋白：常用戊二醛法、羰二亚胺法和活性酯法对人血清蛋白进73第四节修饰酶的化学性质一、热稳定性：一般来说，经过化学修饰的酶，热稳定性有较大的提高。主要是由于修饰试剂的多个功能基团与酶分子的多个功能基团相互交联增加了酶分子构象的稳定性（表5-1）。二、抗原性：修饰酶的抗原性与修饰剂有关，目前比较公认的是PEP和人血清白蛋白在消除酶分子抗原性方面效果较好（表5-2）。第四节修饰酶的化学性质一、热稳定性：一般来说，经过化学修74表5-1天然酶和修饰酶的热稳定性比较酶修饰剂修饰酶天然酶处理条件(℃/时间)残留酶活(%)酰苷脱氢酶

胰蛋白酶

过氧化氢酶

溶菌酶

尿激酶糜蛋白酶

右旋糖苷

右旋糖苷