miR-125a和miR-206在乳腺癌及其癌旁组织的表达情况,肿瘤学论文

miR-125a和miR-206在乳腺癌及其癌旁组织的表达情况,肿瘤学论文乳腺癌是全球发病率最高的女性恶性肿瘤，早期发现乳腺癌并准确分析其分子生物学特点对预后有重要意义。微小ＲNA(microＲNA，miＲ)是一种长度约18～25个核苷酸、进化上高度保守的非编码单链小ＲNA，通过与靶标mＲNA结合，抑制相关mＲNA翻译，诱导相关mＲNA降解，使目的蛋白表示出水平发生变化。一些miＲNA具有类似癌基因或抑癌基因功能，在乳腺癌侵袭、发展中发挥重要作用［1］。miＲ-125a和miＲ-206被以为具有类似抑癌基因的功能，Tavazoie等［2］发现miＲ-206在高转移性乳腺癌细胞株中表示出下调，在细胞中上调miＲ-206的表示出，细胞的侵袭、转移能力显着下降。ScottGK等［3］发现，miＲ-125a可通过靶向作用于人类表皮生长因子受体2(HEＲ-2)和HEＲ-3mＲ-NA下调HEＲ-2和HEＲ-3蛋白质表示出水平，抑制了乳腺癌细胞的迁移和侵袭。当前miＲ-125a和miＲ-206与乳腺癌患者临床病理特征之间的关系还不明确，它们介入乳腺癌发生发展的详细机制仍然存在争议。因而，本研究通过探寻求索miＲ-125a和miＲ-206在乳腺癌及其癌旁组织的表示出情况，分析它们与乳腺癌患者临床病理特征之间的相关性。1材料与方式方法1.1一般资料收集2020年1月1日～2020年12月1日手术切除并经病理学证实为浸润性导管癌的女性乳腺癌患者35例，42～62岁，中位年龄51岁，具有完好的临床病理学资料，行乳腺癌改进根治术或保存乳腺癌根治术，肿瘤直径1.6～4.5cm(平均2.2cm)，术中在无菌条件下留取癌组织以及距离癌边缘3cm癌旁腺体组织。标本获取后立即用无ＲNA酶的0.9%NaCl冲洗，ＲNA酶抑制剂处理，4℃过夜，置－80℃冰箱内保存。患者术前均未接受任何治疗(新辅助化疗及内分泌治疗)，组织学分类均参考NCCN2020年指南进行。在取材前，所有患者均签署了知情同意书，本研究得到了伦理委员会批准。1.2方式方法1.2.1试剂Trizol试剂购自美国Invitrogen公司，M-MLV逆转录酶、ＲNA酶抑制剂、oligodT、dNTPs、KOD-plus、SYBＲMastermix等购自日本Takara公司，引物由上海生工合成。乳腺癌HEＲ-2/neu(17q12)/TOP2A(17q21)/CSP17多色检测试剂盒购自广州安必平医药科技有限公司。1.2.2miＲ-125、miＲ-206检测将所获得的50～100mg新鲜组织，提取总ＲNA，用500ng总ＲNA分别以miＲNA茎环反转录(reversetrasnscription，ＲT)引物进行逆转录，反响条件为10L体系，16℃30min，42℃15min，85℃5s;以20L反响体系进行实时定量PCＲ(real-timepolymerasechainreaction，Ｒeal-timePCＲ)，相关引物系列见表1。miＲNA检测反响体系包括1LＲT产物、1SYBＲGreenIMastermix、0.5Ixmol/LmiＲNA特异前向引物、0.5Ixmol/L通用的反向引物。Ｒeal-timePCＲ条件为:95℃10min，95℃15s，60℃1min，40个循环。PCＲ产物经8%聚丙酰胺凝胶电泳分析，记录每个反响管中的Ｒeal-timePCＲ荧光信号到达所设定的域值时所经历的循环数即Ct值。以U6作为内参，分析miＲNA的表示出，表1为相关引物序列，采用定量PCＲ中的相对定量法，以2－△△Ct表示肿瘤组织目的基因的表示出相对于配对的癌旁组织的倍数变化，华而不实△△Ct=(CtmiＲNA－CtU6)肿瘤组织－(CtmiＲNA－CtU6)癌旁组织。1.2.3雌激素受体和孕激素受体肿瘤标本经石蜡包埋处理切片4m，采用免疫组化SP法，检测雌激素受体(estrogenreceptor，EＲ)和孕激素受体(progesteronereceptor，PＲ)的表示出。结果判定:EＲ和PＲ蛋白表示出以胞质内出现弥漫的棕黄色颗粒为阳性。染色强度评分:0分为未着色，1分为弱染呈淡黄色，2分为中度染色呈黄色，3分为强染呈棕黄色，4分为很强呈褐色。观察高倍视野(400)计数100个细胞中阳性细胞所占百分比，0分为阴性，1分为阳性细胞25%，2分为＞25%～50%，3分为＞50%～75%，4分为＞75%。染色强度与阳性细胞的分值相加，0分为阴性(－)，1～4分为弱阳性(+)，5～8分为强阳性(++)，弱阳性也归为阴性表示出，强阳性定义为阳性表示出。1.2.4HEＲ-2和DNA拓扑异构酶2A(TOP2A)的表示出荧光原位杂交法(FISH)检测肿瘤标本切片厚4m。显微镜下计数:在清楚明晰的肿瘤区域，在60个核内计数位点特异探针(GSP)HEＲ-2(红色)、GSPTOP2A(绿色)和CSP17(CSP指着丝粒探针)(青色)信号，分别记录GSPHEＲ-2、GSPTOP2A和CSP17的信号总数、GSPHEＲ-2与CSP17比值及GSPTOP2A与CSP17比值。HEＲ-2、TOP2A结果断定标准:(1)GSPHEＲ-2、TOP2A(红色、绿色)分别出现诸多信号连接成簇;(2)GSPHEＲ-2、TOP2A/CSP17(红色、绿色/青色)比值分别2.2、2;(3)GSPHEＲ-2、TOP2A/CSP17(红色、绿色/青色)比值分别＜1.8、0.8;(4)GSPHEＲ-2、TOP2ACSP17(红色、绿色/青色)的比值分别为1.8～2.2、0.8～2.0［4］。若知足情况(1)或(2)，断定为HEＲ-2、TOP2A基因扩增;若知足情况(3)，断定为HEＲ-2、TOP2A基因无扩增;若知足情况(4)，需要再计数20个细胞核中的信号，或由另一位实验人员重新计数，如仍为临界值，则应在检测报告中注明，假设在计数区域存在信号弱或高背景情况，有可能干扰到信号判定，应再拿一张组织切片重新进行实验。1.3统计学方式方法采用SPSS13．0统计软件对表示出差异进行分析，因本研究样本例数较少，得出数据非正态分布，miＲNA的表示出数据均以中位数和四分位间距［M(IQＲ)］表示。配对设计资料采用非参数Wilcoxon符号秩检验，两组之间比拟采用Mann-WhitneyU检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。2结果2.1miＲ-125a、miＲ-206表示出35例乳腺癌中，miＲ-125a的相对表示出量为0.02～3.97，华而不实28例(80%)miＲ-125a的相对表示出量小于1，7例(20%)大于1，四分位间距为0.57～0.97，中位数为0.79，采用配对样本Wilcoxon符号秩检验，癌组织与癌旁组织miＲ-125a表示出量差异具有统计学意义(P＜0.05)。miＲ-206的相对表示出量范围是0.06～1.82，35例乳腺癌中，30例(86%)miＲ-206的相对表示出量小于1，5例(14%)大于1，四分位间距为0.64～0.92，中位数为0.85，采用配对样本Wilcoxon符号秩检验，癌组织与癌旁组织miＲ-125a表示出量差异具有统计学意义(P＜0.05)。2.2HEＲ-2、TOP2A表示出35例乳腺癌患者中，HEＲ-2基因扩增16例(45.7%)，表现为多点状红色或成簇红色;Top2A基因扩增18例(51.4%)，表现为多点状绿色或成簇绿色。HEＲ-2、TOP2A阴性主要表现为17号染色体特异信号呈单一青色或缺失。见图1。2.3miＲ-125a、miＲ-206与乳腺癌临床病理的关系miＲ-125a的高表示出与乳腺癌患者的淋逢迎阴性、HEＲ-2阴性及TOP2A阴性患者具有相关性(P＜0.05)，与肿块大小、年龄、月经状态、EＲ状态、PＲ状态无关。miＲ-206的高表示出与相对小的肿瘤体积、EＲ阴性、PＲ阴性及HEＲ-2阴性具有相关性(P＜0.05)，与乳腺癌患者的年龄、月经状态、淋逢迎转移情况以及TOP2A的表示出程度无关。见表2。3讨论研究已证实miＲ的表示出变化与多种人类恶性肿瘤的发生及发展相关，但是它们的调控机制复杂，调控目的蛋白多样，因而，miＲ功能探寻求索仍然是一个较为复杂的难题。成熟miＲ-125a(hsa-mir-125a)位于染色体19q13.41，包含处于同一前体的2条miＲ(miＲ-125a.5p和miＲ-125a.3p)，与线虫的lin-4同源。Li等［5］的研究发现miＲ-125a在乳腺癌中能够发生种系突变，并与乳腺癌的发生发展相关，其可能突变的位点包括rs10404453、rs12975333和rs143525573三个扩增片段。miＲ-125a还直接下调CEＲBB2、ＲNA结合蛋白、HuＲ、Ｒho激酶-1、锌指蛋白KLF13和神经母细胞瘤相关AＲID3B等基因的mＲNA和蛋白的水平，发挥肿瘤抑制作用［2，6－9］。miＲ-206定位于人染色体6p12.2，被以为是骨骼肌和心肌相关的miＲ，通过下调DNA聚合酶的P180亚基和肌转录因子促进肌肉分化［10］。随后发现miＲ-206在多种人类恶性肿瘤中均表示出下调，最近的研究发现其与乳腺癌的关系密切，主要通过下调EＲ以及EＲ共调节蛋白的mＲNA和蛋白表示出，依靠EGF/MAPK途径抑制乳腺癌细胞增殖［11－12］。miＲ-206还直接作用于Notch3、cy-clinD2、Cdc42等蛋白，抑制癌细胞的侵袭、转移［13－15］，近期SNP研究发现miＲ-206在rs6920648位点发生突变，并与乳腺癌发生相关［16］。在本实验中，乳腺癌患者肿瘤组织中miＲ-125a和miＲ-206的相对表示出量明显低于癌旁组织，结合文献乳腺癌患者血清中miＲ-125a和miＲ-206浓度亦明显低于健康女性血清中的表示出，提示它们有潜力能够作为乳腺癌肿瘤标记物，用于乳腺癌的早期诊断［17］。本研究结果显示，miＲ-125a与淋逢迎转移呈负相关，miＲ-206与肿块大小呈负相关，提示miＲ-125a、miＲ-206可能作为抑癌基因，对乳腺癌的发展起到抑制作用，此结果与之前文献报道一致［5，18］。当前临床上基于乳腺癌的EＲ、PＲ及HEＲ-2表示出情况将乳腺癌分为三型(激素受体阳性型、HEＲ-2阳性型、三阴性型)，对评价乳腺癌预后、选择个体化治疗方案有重要的意义。HEＲ-2阳性的乳腺癌恶性程度较高，术后容易复发及转移，赫赛汀靶向治疗是其治疗的重大进展之一。本研究中miＲ-125a的高表示出与HEＲ-2阴性表示出具有相关性，提示miＲ-125a可能对HEＲ-2的表示出具有调节作用，miＲ-125a已被证明能够直接抑制HEＲ-2和HEＲ-3的表示出［3］。miＲ-125a在接受恩替诺特治疗的HEＲ-2阳性乳腺癌患者中表示出上调，这种表示出上调作用是恩替诺特发挥作用的重要机制，所以miＲ-125a对于开发新的抗HEＲ-2药物和克制赫塞汀耐药有重要意义［19］。TOP2A高表示出的乳腺癌有更具侵袭性的生物学行为，在蒽环类单药或蒽环类联合化疗中可获得较好疗效。在本研究中，miＲ-125a在TOP2A阴性患者中的表示出水平高于阳性患者，提示miＲ-125a可能调节TOP2A基因。三阴性乳腺癌是具有恶性程度高、易复发、易转移、治疗手段少等特点。国内赵晓艾等［20］用miＲs芯片技术对三阴性乳腺癌miＲNA差异表示出谱进行研究，挑选获得17个相关miＲ，显着上调的有miＲ-93、miＲ-328，显着下调的有miＲ-145、miＲ-20。本研究中，miＲ-206高表示出与乳腺癌的EＲ阴性、PＲ阴性、HEＲ-2阴性相关，提示miＲ-206可能与三阴性乳腺癌存在相关性，Tavazoie等［2］在体外细胞实验中，将miＲ-206导入转移性乳腺癌细胞株，能够有效抑制乳腺癌细胞的侵袭转移，所以miＲ-206有望成为三阴性乳腺癌治疗的新靶点。除对三阴性乳腺癌抑制外，miＲ-206对EＲ阳性细胞株也有较高的抑制作用，当前以为miＲ-206是乳腺癌从管腔-A型转化为基地样型的开关，并且可能逆转管腔-A型转化为基地样型［21］。所以miＲ-206对于乳腺癌的治疗有重要意义。总之，miＲ-125a和miＲ-206有望作为一种新的肿瘤标志物用于乳腺癌的诊断和预后判定，对于HEＲ-2阳性和三阴性乳腺癌的治疗具有重要意义，但其具体的作用机制以及能否成为真正临床治疗靶向位点，有待于进一步的研究。4以下为参考文献［1］李志华，罗永辉．miＲNA与乳腺癌转移［J］．国际外科学杂志，2018(1):46－48．［2］TavazoieSF，AlarcnC，OskarssonT，etal．EndogenoushumanmicroＲNAsthatsuppressbreastcancermetastasis［J］．Nature，2008(7175):147－152．［3］ScottGK，GogaA，BhaumikD，etal．Coordinatesuppres-sionofEＲBB2andEＲBB3byenforcedexpressionofmi-cro-ＲNAmiＲ-125aormiＲNA-125b［J］．JBiolChem，2007(2):1479－1486．［4］BouchalovK，TrojanecＲ，KolrZ，etal．AnalysisofEＲBB2andTOP2Agenestatususingfluorescenceinsituhybridizationversusimmunohistochemistryinlocalizedbreastcancer［J］．Neoplasma，2006(5):393－401．［5］LiW，DuanＲ，KooyF，etal．Germlinemutationofmi-croＲNA-125aisassociatedwithbreastcancer［J］．JMedGenet，2018(5):358－360．［6］ZhangGaoJS，TangX．MicroＲNA125aanditsregulationofthep53tumorsuppressorgene［J］．FEBSLett，2018(22):3725－3730．［7］GuoX，WuY，HartleyＲS，etal．MicroＲNA-125are-pressescellgrowthbytargetingHuＲinbreastcancer［J］．ＲNABiol，2018(5):575－583．［8］ZhaoX，TangY，QuB，etal．MicroＲNA-125acontrib-utestoelevatedinflammatorychemokineＲANTESlevelsviatargetingKLF13insystemiclupuserythematosus［J］．ArthritisＲheum，2018(11):3425－3435．［9］CowdenDahKD，DahlＲ，KruichakJN，eta1．Theepi-dermalgrowthfactorreceptorresponsivemiＲ-125arepres