添加干酪乳杆菌的益生菌酸乳生产工艺条件的优化

添加干酪乳杆菌的益生菌酸乳生产工艺条件的优化药璐通讯作者：陈历俊，chlj@263.net基金资助：国家科技部“863”计划(2011AA100903)通讯作者：陈历俊，chlj@263.net基金资助：国家科技部“863”计划(2011AA100903)作者简介：药璐(1987-)，女，硕士，研究方向为食品生物化学工程与功能性食品（1.吉林农业大学，吉林长春130118；2.北京三元食品股份有限公司，北京100076）摘要：以添加干酪乳杆菌的益生菌酸乳代替传统的保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌发酵的酸乳，采用单因素和正交试验设计，对影响酸乳生产工艺的的菌种配比、接种量、发酵温度及发酵时间等主要因素进行了优化组合试验，以发酵过程中及后熟24h后的pH、酸度变化，并结合后熟酸乳的质构测定、感官评分和活菌数为综合指标，通过极差分析和方差分析，确定最佳生产工艺条件。本试验最终确定的最佳生产工艺条件为：乳酸菌（嗜热链球菌:保加利亚乳杆菌=1:1）:干酪乳杆菌=2:1，接种量3%，发酵温度40℃，发酵时间为9h，在此生产条件下得到酸乳的感官评分为93.65分，硬度、稠度、凝聚性和粘度分别为138.975g、3448.022g·s、99.018g和299.117g·s，后熟24h后的酸度和活菌数也分别达到122°T和3.13×1011cfu/mL。该试验方法所得到的最佳生产工艺参数真实可靠，具有实际意义。关键词：干酪乳杆菌；酸乳；正交试验；优化OptimizingtheprocessconditionsfortheprobioticyogurtaddedwithlactobacilluscaseiYaolu1.2，Minwei-hong1，JIANGtie-min2，CHENli-jun2,*（1.JilinAgricultureUniversity,JilinChangchun130118,China;2.BeijingSanyuanFoodsCo.,Ltd,Beijing100076,China）Abstract：UsingtheprobioticyogurtaddedwithLactobacilluscaseiinplaceofthetraditionalyogurtonlyincludingLactobacillusbulgaricusandStreptococcusthermophilus,anddeterminetheoptimumprocessconditionsofmainfactorssuchasstrainsinoculatingproportion,inoculationamount,fermentationtemperatureandfermentationtimebyusingsinglefactorandorthogonalexperiment.AccordingtothechangesofthepHandtheacidityinthefermentationprocessandafterripening,andtakethetexture,thesensoryscoreandtheviablecountoftheprobioticyogurtintoconsideration,determinedtheoptimumprocessconditionsbytherangeanalysisandvarianceanalysis.Theoptimumprocessconditionswereasfollows:lactobacillus(Streptococcusthermophilus:Lactobacillusbulgaricus=1:1）:Lactobacilluscasei=2:1,inoculationamount3%,fermentationtemperature40℃,fermentationtime9h.Intheoptimumprocessconditionsthesensoryscoreofyogurtreached93.65points,andfirmness,consistency,cohesivenessandviscositywere138.975g、3448.022g·s、99.018gand299.117g·srespectively,theacidityandviablecountalsoreached122°Tand3.13×1011cfu/mLafterripening24h,Itwasshowedthattheoptimumtechnologicalparameterswerereliable,andithadpracticalsignificance.Keywords:Lactobacilluscasei；yogurt；orthogonaltest；optimization中图分类号：TS252.54文献标识码：B随着国际上对发酵乳制品的不断需求，我国酸乳产量和品种也日益增长。大量资料表明[1-4]，目前市面上销售的酸乳主要由嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌为发酵剂高温短时间发酵生产，发酵时间3~5h，生产周期短，成本低。但近年来，添加益生菌的发酵酸乳制品越来越受到更多消费者的喜爱。为了更好地满足市场需求，益生菌等其它菌种被添加到酸乳中生产新型发酵酸乳。益生菌是指一类非致病的经过消化系统对人体健康产生积极作用的微生物[5]，它们通过改善人体内的微生态平衡进而促进人体健康。近年来，益生菌依靠其特有的疗效，被消费者普遍认可，特别是在维持胃肠道健康方面，因此含益生菌的食品越来越受到人们的关注[6]。干酪乳杆菌作为益生菌的一种，其良好的耐酸性使其能在胃液中长期存活[7]，起到调节肠内菌群平衡、促进人体消化吸收等作用[8-9]。同时，对益生菌的抗癌研究显示，食用干酪乳杆菌的菌体或其做成的酸奶后可激活单球巨噬细胞的活性，增强全身性免疫应答，从而起到抗肿瘤的作用[10-11]。此外干酪乳杆菌还具有防治腹泻，降低血压，缓解乳糖不耐症等保健作用[10]。因此，生产含有干酪乳杆菌的益生菌产品越来越成为研究、开发、生产的焦点。本试验将正交试验设计应用到添加干酪乳杆菌的益生菌酸乳生产中，以发酵过程中及后熟24h后的pH、酸度变化结合后熟酸乳的感官评定、活菌数、质构分析为综合指标，通过极差和方差分析，优化干酪乳杆菌益生菌酸乳的生产工艺参数，得到最佳生产工艺条件，从而为实际生产提供理论依据。1材料与方法1.1材料与仪器嗜热链球菌（Streptococcusthermophilus,St,St-BODY-3）、保加利亚乳杆菌（Lactobacillusbulgaricus,Lb,Lb340）、干酪乳杆菌（Lactobacilluscasei,Lc,LC-11）购自丹尼斯克（中国）有限公司；脱脂乳粉新西兰进口脱脂乳粉；MRS培养基购自北京陆桥技术有限责任公司；NaCl分析纯。LRH-250型生化培养箱上海一恒科技有限公司；PB-10型pH计赛多利斯科学仪器有限公司；自动高压蒸汽灭菌锅北京发恩科贸有限公司；TA-XTPlus质构仪英国Stablemicrosystems公司。1.2试验方法1.2.1菌种活化方法将脱脂乳粉复原成12%（W/V）的脱脂乳，放置半小时，使蛋白质充分复水后分装于三角瓶中，110℃灭菌10min，冷却至室温，然后分别接种保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌和干酪乳杆菌，置于恒温培养箱中进行凝乳培养，反复传代至活菌数达到试验保加利亚乳杆菌活化的最适温度为42℃，嗜热链球菌活化的最适温度为42℃，干酪乳杆菌活化的最适温度为1.2.2酸乳生产工艺流程脱脂乳粉12%复原→灭菌（110℃，10min）→冷却→接菌→分装→发酵→冷藏后熟（4℃，24h）1.2.3检验方法感官评定方法：根据我国国家标准GB19302-2010发酵乳感官评定要求，并结合质构仪测定数据对试验所得的产品进行感官评定，评定标准如表1所示，。pH测定方法：采用pH计进行测定，设定测定时间为发酵结束时和后熟24h后。酸度值测定方法：以我国国家标准GB5413.34-2010中对酸度的测定为标准，利用浓度为0.1mol/L的NaOH溶液对酸乳的酸度进行滴定，设定测定时间为发酵结束时和后熟24h后。菌落计数方法：以我国国家标准GB4789.2-2010为标准，利用平板计数法对发酵酸乳中活菌数进行测定，设定测定时间为发酵后熟24h后。质构仪测试时的参数：测试模式为compression，测试前下降速度为1.0mm/s，测试速度为1.0mm/s，测试后速度为10.0mm/s，测试距离为30mm，采用A/BE探头，直径40mm。表1酸乳的感官评定标准Table1Thestandardofsensoryevaluationofyogurt评定项得分标准色泽（30分）色泽均匀一致，呈乳白色或微黄色（30分）色泽不均匀一致，呈乳白色或微黄色（15～30分）呈现其它颜色（0～15分）滋气味（30分）酸乳特有的滋味和气味较浓（30分）酸乳特有的滋味和气味不浓或基本没有（15～30分）有其它异味（0～15分）组织状态（40分）细腻、均匀、有少量乳清析出（40分）细腻、均匀、有大量乳清析出（20～40分）不细腻、不均匀、有大量乳清析出（0～20分）1.2.4添加干酪乳杆菌的益生菌酸乳的工艺优化设计单因素试验分别以菌种配比、接种量、发酵温度和发酵时间为影响因素，通过测定酸乳在发酵过程中和后熟24h后的pH、酸度变化，并结合其后熟酸乳的感官评分、活菌数和质构分析，得出酸乳的最优工艺条件。在单因素试验中，菌种配比依次采用嗜热链球菌+保加利亚乳杆菌：干酪乳杆菌为1:1、1:2、1:3、1:4、2:1、3:1；接种量依次采用2%、3%、4%、5%、6%、7%；发酵温度依次采用34、36、38、40、42、44℃；发酵时间依次采用7、8、9、10、11、12h；每个试验均做3次平行试验后正交试验以菌种配比、接种量、发酵温度和发酵时间为4个影响因素，采用L9(34)正交试验确定最佳工艺条件。正交试验因素水平表见表2所示。表2L9(34)Table2OrthogonallayoutoffactorsandnumberoflevelL9(34)水平因素A菌种配比B接种量(%)C发酵温度(℃)D发酵时间(h)1231:31:42:134536384089102结果与分析2.1单因素试验2.1.1菌种配比对酸乳品质的影响范利华[12]注：图中实线为pH曲线；虚线为酸度曲线。注：图中实线为pH曲线；虚线为酸度曲线。图1不同菌种配比的酸乳在发酵过程中pH及酸度的变化Fig.1Thechangeofthe图1不同菌种配比的酸乳在发酵过程中pH及酸度的变化usingvarioustheratioofstrains图2图2不同菌种配比的酸乳发酵后熟24h的酸度和感官评分Fig.2Theacidityandthesensoryscoreoftheyogurtusingvarioustheratioofstrainsafterripening由图1可知，产酸速度随着菌种配比的改变而变化，三种菌以3:1的配比进行发酵时pH变化最快，且凝乳时间也最短，在发酵进行至7h时已经开始凝乳并有少量乳清析出。在发酵过程中，如果pH下降较快即酸度增加较快，容易引起酸乳产品的后酸化度过高，并且不利于风味物质的产生。而以1:4的配比进行发酵时pH下降最缓和，在发酵进行至9h时pH下降到4.73。不同菌种配比的酸乳发酵到9h，即达到发酵终点时，将其放入-4℃冰箱中后熟24h，测定后熟酸乳的pH与酸度并进行感官评分（图2）。结果发现3:1配比发酵的酸乳后熟24h的酸度最高，为105°T，而以1:4配比发酵的酸乳后熟24h的酸度最小，为80°T，且感官评分最高，为90.0分。因此确定菌种的最佳配比比例为嗜热链球菌+保加利亚乳杆菌：干酪乳杆菌=1:4，在正交试验中菌种的配比比例选取1:3、1:4和2:2.1.2接种量对酸乳品质的影响接种量除能引起酸乳口感上的酸度差异之外，还会影响酸乳的风味与组织状态。接种量不足，会导致发酵过程中酸度增加缓慢，乙醛等风味物质生成量少。反之，当接种量过多时，发酵过程中酸度增加过快，乙醛等风味物质会由于酸度变化过快而生成量较少。图3不同接种量图3不同接种量的酸乳在发酵过程中pH及酸度的变化注：图中实线为pH曲线；虚线为酸度曲线。Fig.3ThechangeofthepHandtheacidityinthefermentationoftheyogurtusingthevariousinoculationamount图4图4不同接种量的酸乳发酵后熟24h的酸度和感官评分Fig.4Theacidityandthesensoryscoreoftheyogurtusingthevariousinoculationamountafterripening由图3与图4可以看出，当接种量为2%时，酸乳的酸度变化过慢，且在发酵过程中凝乳时间也较长。当接种量为7%时，可以明显看到酸乳在发酵过程中酸度变化过快，后熟24h的酸乳中乳清析出过多且风味和组织状态都不良。而接种量为6%的酸乳，后熟之后呈现异味，感官评分最差。综合以上因素，确定菌种的最佳接种量为3%，在正交试验中菌种的接种量选取3%、4%、5%。2.1.3发酵温度对酸乳品质的影响嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌的最适生长温度一般为40~42℃，干酪乳杆菌生长的最适温度在35~40℃之间。若发酵温度过低，则会造成酸乳酸味不足且会延长达到规定酸度的时间。若选用较高的发酵温度，则杆菌生长旺盛，酸乳会出现较强的刺激性酸味。由图5、6可知，在单因素试验中，发酵液酸度的增长速度因不同的发酵温度而存在差异。发酵温度为34℃时，酸乳酸度变化过慢，且发酵后熟24h后的酸度值仍未达到规定标准，不符合要求。当温度为42℃或44℃时，产酸速度过快，当发酵进行至4h左右时就已经凝乳且有少量乳清析出，后熟24h后有强烈的刺激性酸味。当温度为38℃时，酸乳的凝乳时间为6h左右，在0~4h的时候发酵产酸较慢，4~6h的时候酸度变化较大，之后酸度变化趋于平缓，且发酵后熟24h的酸乳感官评分也最高达到89.50分，冷藏过程中酸度增加少，后酸化能力弱。综合以上因素，确定菌种的最佳发酵温度为38℃较为合理，在正交试验中菌种的发酵温度选取36、38、40℃。这与黄文利等[13]研究的干酪乳杆菌LC-15的最适生长温度在38℃，最高生长温度在46图5不同发酵温度的酸乳在发酵过程中图5不同发酵温度的酸乳在发酵过程中pH及酸度的变化注：图中实线为pH曲线；虚线为酸度曲线。Fig.5ThechangeofthepHandtheacidityinthefermentationoftheyogurtusingthevariousfermentationtemperature图6图6不同发酵温度的酸乳发酵后熟24h的酸度和感官评分Fig.6Theacidityandthesensoryscoreoftheyogurtusingthevariousfermentationtemperatureafterripening2.1.4发酵时间对酸乳品质的影响试验中发现嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌和干酪乳杆菌单菌发酵的凝乳时间均比较长，而当嗜热链球菌与保加利亚乳杆菌混菌发酵时，凝乳时间明显缩短，由此可以看出二者之间存在相互共生。由图7与图8可以看出，加入益生菌干酪乳杆菌之后的酸乳当发酵到6h的时候，便开始凝固并且状态开始增强。酸乳的后熟度随着发酵时间的延长而增加，酸乳后熟24h后都出现不同程度的乳清析出，但7与12h的乳清析出最为严重，而最终发酵时间为9h的酸乳发酵过程中变化较为平稳，且发酵至6h的时候酸度就已经达到了75°T，后熟酸度则为107°T，符合国家标准，容易被消费者所接受。而最终发酵时间为11h的酸乳则后熟酸度过大，达到117°T左右，此时的酸乳有种强烈的异味，不容易被接受，且发酵时间过长容易造成生产成本过大，不利于生产化。综合以上因素，确定菌种的最佳发酵时间为9h，在正交试验中菌种的发酵时间选取8、9、10h。图7图7不同发酵时间的酸乳在发酵过程中pH及酸度的变化注：图中实线为pH曲线；虚线为酸度曲线。Fig.7ThechangeofthepHandtheacidityinthefermentationoftheyogurtusingthevariousfermentationtime图8不同发酵时间的酸乳发酵后熟24h的酸度和感官评分图8不同发酵时间的酸乳发酵后熟24h的酸度和感官评分Fig.8Theacidityandthesensoryscoreoftheyogurtusingthevariousfermentationtimeafterripening2.2正交试验2.2.1添加干酪乳杆菌的益生菌酸乳生产工艺参数确定的正交设计与结果根据单因素试验结果选取菌种配比、接种量、发酵温度和发酵时间4个影响因素，采用L9(34)正交试验确定酸乳的最佳生产工艺条件。正交试验结果见表3所示，正交试验方差分析表见表5所示。表3添加干酪乳杆菌的益生菌酸乳生产工艺参数优化的正交试验结果Table3Theresultanalysesoforthogonalexperimentaboutoptimizingtheprocessconditionsfortheprobioticyogurtofaddinglactobacilluscasei试验编号因素感官评分（分）ABCD1111189.862122290.003133386.714212386.295223186.146231284.577313293.868321388.869332189.14K1266.57270.01263.29265.14K2257.00265.00265.43268.43K3271.86260.42266.71261.86k188.8690.0087.7688.38k285.6788.3388.4889.48k390.6286.8188.9087.29R4.99主→次A＞B＞D＞C最优组合A3B1C3D表4添加干酪乳杆菌的益生菌酸乳发酵后熟24h后的质构指标Table4Thetextureoftheprobioticyogurtofaddinglactobacilluscaseiafterripening试验号感官评分（分）硬度（g）稠度（g·s）凝聚性（g）粘度（g·s）189.86109.3462828.00690.448275.124290.00116.4492990.95895.671295.190386.71154.5644011.252115.774312.835486.29112.5992978.27398.293276.583586.14121.8703273.39699.167302.065684.57102.8182739.64884.153268.064793.86139.9053445.14299.134298.888888.86121.8043029.98881.852267.164989.14124.6143132.70084.286249.224质构分析能够较为准确的表示酸奶内部的物理组织特性状态，并以形象的图形和数据化的形式显示出来，从而使得感官评分更加有科学依据，因此本试验采用了质构分析仪测定酸乳的质构状况。由表4可以看出，不管从硬度、稠度、凝聚性还是粘度来说，第3组都明显高于其它各组，分别达到154.564g、4011.252g·s、115.774g、312.835g·s，而第6组的硬度、稠度和凝聚性均最低分别达到102.818g、2739.648g·s、84.153g、268.064g·s，且感官评分也最低仅为84.57分，这主要是因为凝块不结实且存在大量气孔，酸乳固有的滋气味不浓烈所致。第7组的感官评分最高，因其组织状态细腻、均匀，酸乳固有的滋气味较浓；结合质构分析结果显示其硬度、稠度、凝聚性和粘度都较适中，容易被消费者所接受。因此结合质构分析结果和感官得分，第7组的各项指标均达到最优。由表3中的极差分析可知，四个因素对添加干酪乳杆菌的益生菌酸乳发酵后熟24h后感官评分的影响从主到次依次为：A＞B＞D＞C，即菌种配比＞接种量＞发酵时间＞发酵温度。在感官评分为标准的分析下最适的生产工艺条件为A3B1C3D2，与第7组相符，也与综合评分得出的最优组相一致。即最适的菌种配比为2:1，接种量为3%，发酵温度为40表5添加干酪乳杆菌的益生菌酸乳发酵后熟24h后的感官评分方差分析Table5Thesensoryscorevarianceanalysisoftheprobioticyogurtofaddinglactobacilluscaseiafterripening方差来源偏差平方和自由度F比F临界值显著性菌种配比37.82122.4274.460*接种量（%）15.33820.9844.460发酵温度（℃）1.99020.1284.460发酵时间（h）7.19420.4624.460误差62.348注：其中“*”表示差异显著（p＜0.05）。由方差分析可知，四个因素中菌种配比对益生菌酸乳的感官评分影响最显著，而发酵温度对酸乳的感官评分影响最不显著，与极差分析结果一致。表6添加干酪乳杆菌的益生菌酸乳发酵后熟24h后的各项指标测定结果Table6Theindexofthedeterminationresultsoftheprobioticyogurtofaddinglactobacilluscaseiafterripening试验号PH值酸度（°T）乳酸菌活菌数（cfu/mL）14.63841.16×10924.411001.58×10934.111212.32×10944.311093.25×101054.071232.24×101064.031252.215×101074.121202.36×101184.131203.45×10994.341071.21×1010由表6可知，后熟结束后酸度值最小的是第1组，为84°T；最大的是第6组，为125°T。乳酸菌活菌数最高的是第7组，为2.36×1011cfu/mL；活菌数最低的是第1组，达到1.16×109cfu/mL。因此综合后熟酸度和活菌数来看，选择第7组为最优生产工艺条件较合理。表7添加干酪乳杆菌的益生菌酸乳发酵后熟24h后的酸度方差分析Table7Theacidityvarianceanalysisoftheprobioticyogurtofaddinglactobacilluscaseiafterripening方差来源偏差平方和自由度F比F临界值显著性菌种配比843.55621.5164.460*接种量（%）480.88920.8644.460发酵温度（℃）460.22220.8274.460发酵时间（h）441.55620.7934.460误差2226.228注：其中“*”表示差异显著（p＜0.05）。由表7可以看出，四个因素对添加干酪乳杆菌的益生菌酸乳发酵后熟24h后酸度的影响从主到次依次为：菌种配比＞接种量＞发酵温度＞发酵时间。表8添加干酪乳杆菌的益生菌酸乳发酵后熟24h后的乳酸菌活菌数方差分析Table8Thebacterialcountoflacticacidbacteriavarianceanalysisoftheprobioticyogurtofaddinglactobacilluscaseiafterripening方差来源偏差平方和自由度F比F临界值显著性菌种配比1.07×102220.9414.460接种量（%）1.26×102221.1044.460*发酵温度（℃）1.12×102220.9874.460发酵时间（h）1.10×102220.9694.460误差4.55×10228注：其中“*”表示差异显著（p＜0.05）。由表8可以看出，四个因素对添加干酪乳杆菌的益生菌酸乳发酵后熟24h后乳酸菌活菌数的影响从主到次依次为：接种量＞发酵温度＞发酵时间＞菌种配比。综合以上各指标的方差分析与以感官评分为衡量指标的正交试验分析结果可以确定添加干酪乳杆菌的益生菌酸乳的最佳生产工艺组合为第7组，即菌种配比为2:1，接种量为3%，发酵温度为40℃3验证性试验根据以上正交试验结果，可知添加干酪乳杆菌的益生菌酸乳的最佳生产工艺参数为：乳酸菌（嗜热链球菌:保加利亚乳杆菌=1:1）:干酪乳杆菌=2:1，接种量为3%，发酵温度为40℃，发酵时间为9h。在此条件下进行3次平行试验，结果得出酸乳的感官评分为93.65分，此时酸乳的质构指标为：硬度138.975g、稠度3448.022g·s、凝聚性99.018g、粘度299.117g·s，后熟24h后的酸度和活菌数也分别达到122°T和3.13×1011cfu/mL，与理论值基本吻合，说明该试验方法所得到的最佳生产工艺参数真实可靠，具有实际意义。4结论与讨论近年来关于对益生菌的研究已占很大一部分，最佳工艺参数因菌种不同而异。黄文利等[13]研究干酪乳杆菌LC-15与保加利亚乳杆菌与嗜热链球菌的菌种配比为3:1:1，接种量为3%，最适培养温度为39℃；张丽萍等[14]研究的干酪乳杆菌最佳发酵工艺参数为接种量5%，发酵时间9h，发酵温度为36℃。本研究在单因素试验的基础上通过正交试验分析确定添加干酪乳杆菌的益生菌酸乳的最佳生产工艺条件为：乳酸菌（嗜热链球菌:保加利亚乳杆菌=1:1）:干酪乳杆菌=2:1，接种量为3%，发酵温度为40℃，发酵时间为9h。在此生产条件下生产的酸乳组织状态均匀细腻，酸度适中，气味浓郁，感官评分达到93.65分，硬度、稠度、凝聚性和粘度分别为138.975g、3448.022g·s、99.018g和299.117g·s，后熟24h后的酸度和活菌数也分别达到122°T和3.13×1011cfu/mL。该试验方法所得到的最佳生产工艺参数真实可靠，对酸乳工业化的生产有一定的指导意义参考文献：[1]李新玲，张丹凤，赵建荣．酸奶生产中常出现的问题及解决方法