基因重组与基因工程和

第十四章

基因重组与基因工程姚真真生物化学与分子生物学教研室Generecombination&Geneengineering中心法则

逆转录转录

RNA翻译

蛋白质复制DNA生物体环境

基因的表达调控适应环境了解中心法则

对天然的DNA进行改造为人类服务基因工程即DNA重组技术。在分子水平上进行遗传操作，按设计的蓝图，从供体中提取或人工合成目的基因，使其与载体构建成重组DNA，再转移到受体细胞。目的基因在受体细胞中表达，获得新的遗传性状。

基因工程苏云金芽胞杆菌（BT）毒素蛋白基因

荧光蛋白酶基因转胃安素番茄高锌西洋番茄转虾青素胡萝卜痢疾疫苗土豆乳汁中分泌人凝血因子的转基因山羊

乳汁中分泌人蛋白因子的转基因猪主要内容DNA重组重组DNA技术重组DNA与医学的关系不同同DNA之之间间发发生生共共价价连连接接形形成成新新的的DNA分分子子。。基因因移移动动和和重重组组是是生生物物界界普普遍遍现现象象，，是是生生物物进进化化的的动动力力，，DNA重重组组具具有有重重要要的的生生物物学学意意义义DNA重重组概念念第一节DNA重组组DNA重重组的类类型位点特异异性重组组（site-specificrecombination））接合(conjugation)转化(tranformation)转导(transduction)同源重组组（homologousrecombination）转座重组组（transpositionrecombination）细菌的基基因转移移与重组组一、细菌菌的基因因转移与与重组接合(conjugation)转化(tranformation)转导(transduction)（一）接接合作用用(conjugation)指通过细细胞的直接接触(如如菌毛)，遗遗传信息息从供体体细胞单向转移移到受体细细胞的过过程。接合转移F因子染色体DNA性鞭毛Griffith肺肺炎球菌菌转化实实验（二）转转化（transformation）相关概念念：转化：细胞从周周围介质质中吸收收裸露的DNA,而获获得新的的遗传表表型。感受态细细胞（competentcell）:具有摄取取周围介介质中游游离DNA分子能力力的细菌菌细胞。。转化化过过程程：：DNA片断细菌摄取DNA片断重组细菌性状改变（三三））转转导导（（transduction））通过过病病毒毒（（噬噬菌菌体体））介介导导发发生生在在供供体体细细胞胞与与受受体体细细胞胞之之间间的的DNA转转移移和和重重组组过过程程。。溶菌感染重组感染细菌噬菌体转导导溶菌菌途途径径溶原原途途径径噬菌菌体体感感染染宿宿主主后后的的两两种种结结局局cI基因因cro基因因溶原原状状态态cI基因因cro基因因溶菌菌状状态态噬菌菌体体感感染染宿宿主主菌菌后后的的两两种种状状态态是是由由噬噬菌菌体体的的cI和和cro两两个个基基因因编编码码调调控控蛋蛋白白控控制制的的，，溶溶原原状状态态，，cI表表达达；；溶溶菌菌状状态态，，cro表表达达。。除除了了控控制制其其他他基基因因表表达达外外，，cI和和cro两两个个基基因因编编码码调调控控蛋蛋白白是是互互为为阻阻遏遏蛋蛋白白。。结合合协协同同cI基因因cro基因因溶原原状状态态cI基因因cro基因因溶菌菌状状态态思考考：：当含含噬噬菌菌体体的的细细菌菌用用紫紫外外线线轻轻度度照照射射后后，，cI蛋蛋白白被被降降解解,接接下下去去会会发发生生什什么么？？停停止止照照射射后后会会怎怎样样？？为为什什么么会会进进化化成成这这种种机机制制？？结合合协协同同二、、同同源源重重组组（homologousrecombination））不需要要特异异DNA序序列，，而是是依赖赖两分分子之之间序序列的的相同同或相相似性性而进进行的的重组组。同源序序列愈愈长，，同源源重组组率愈愈高，，反之之，则则不易易发生生重组组。概念同源重重组意意义同源重重组发发生在在任何何生物物中。。细菌如如果通通过接接合或或转化化获得得的外外源DNA与宿宿主DNA充分分同源源，那那末外外源DNA就可可以整整合进进宿主主的染染色体体。同源重重组也也是DNA损伤伤修复复的重重要机机制ElectronmicrographofaHollidayJunctionHollidayJunction(A)ThestructureofaHollidayjunctionboundbyCrerecombinase(gray),abacteriophageprotein.(B)AschematicviewofaHollidayjunction.5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´分支迁移(recA)5´3´5´3´5´3´5´3´

内切酶(recBCD)5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´3´3´5´5´

内切酶(recBCD)5´3´3´3´DNA侵扰(recA)3´5´5´3´5´3´5´3´

DNA连接酶Holiday中间体5´3´5´3´5´3´5´3´E.coli的同源源重组组过程程：5´3´Holiday中间体5´3´5´3´5´3´3´5´5´5´5´3´3´3´内切酶(ruvC)内切酶(ruvC)5´5´5´5´3´3´3´3´5´3´5´5´5´3´3´3´DNA连接酶3´5´5´5´5´3´3´3´拼接重组体DNA连接酶5´5´5´5´3´3´3´3´片段重组体Holliday模模型同同源重重组步步骤①两个个同源源染色色体DNA排列列整齐齐②一个个DNA的的一条条链断断裂、、并与与另一一个DNA对应应的链链连接接，形形成Holliday中中间体体③通过过分支支移动动产生生异源源双链链DNA④Holliday中间间体切切开并并修复复，形形成两两个双双链重重组体体DNA，，分别别为：：片段重组体(patchrecombinant)拼接重组体(splicerecombinant)片段重重组体体（见模模型图图右边产物物）：：切开的的链与与原来来断裂裂的是是同一一条链链，重重组体体含有有一段段异源源双链链区，，其两两侧来来自同同一亲亲本DNA。5´5´5´5´3´3´3´3´片段重组体拼接重重组体体（见模模型图图左边产物物）：：切开的的链并并非原原来断断裂的的链，，重组组体异异源双双链区区的两两侧来来自不不同亲亲本DNA。3´5´5´5´5´3´3´3´拼接重组体位点特特异性性重组组：由整合合酶催催化，，在两两个DNA位点点特异异的短短序列列之间间发生生的切切割和和连接接反应应:噬噬菌体体DNA整整合细菌特特异位位点重重组免疫球球蛋白白基因因的重重排三、位位点特特异性性重组组（一））λ噬噬菌体体DNA的的整合合λ噬菌菌体的的整合合酶识识别噬噬菌体体和宿宿主染染色体体的特特异靶靶位点点发生生选择择性整整合；；反转录录病毒毒整合合酶可可特异异地识识别、、整合合反转转录病病毒cDNA的的长末端重复序序列(longterminalrepeat,LTR)。attPattBE.coliDNAInt,IHFInt,IHF,XisDNA噬菌体DNA的整合和切切除att:attachmentsite,Int:integrase,IHF:integrationhostfactor,Xis:excisionasePOP´BOB´BOP´POB´attLattR整合切除hix为反向重复序序列，它们之之间的H片段段可在Hin控制下进行行特异位点重重组(倒位)。H片段上有两两个启动子P，其一驱动动hin基因表达，另另一正向时驱驱动H2和rH1基因表表达，反向(倒位)时H2和rH1不表达。rH1为H1的阻遏蛋白白基因。（二）细菌的的特异位点重重组沙门氏菌H片片段特异位点重组组(倒位)决定鞭鞭毛相转变DNAH片段

h1H2与阻遏基因mRNAHin重组酶H2鞭毛素阻遏蛋白(a)

hinh2阻遏基因rh1启动序列hinmRNAPPhixhix

hinh2阻遏基因rh1H片段倒位

h1hinmRNAH1mRNAHin重组酶H1鞭毛素(b)

hinPP沙门氏菌H片片段特异位点重组组(倒位)决定鞭鞭毛相转变（二）细菌的的特异位点重重组（三）、免疫疫球蛋白基因因的重排免疫球蛋白(Ig)，由由两条轻链(L链)和两两条重链(H链)组成，，分别由三个个独立的基因因族编码，其其中两个编码码轻链(和)，一个编码码重链。轻链的基因片片段：重链的基因片片段：LVJCLV

D

JCTheorganizationofmouseimmunoglobulingenesegments.Theorganizationingermlinecellsisshownontheleft,andtherearrangedorganizationcharacteristicofmatureBlymphocytesisshowntotherightofthearrows.Therearrangedstatesshownarebutsingleexamplesofthemanypossibilitiesforeachgenefamily.Consensuselementsarelocatedaboveandbelowgermlinevariable-regiongenesthatrecombinetoformgenesencodingimmuno-globulinchains.Theseconsensuselementsarecomplementaryandarearrangedinaheptamer-nonamer,12-bpto23-bpspacerpattern.-Chain-ChainH-Chain231223122312CACAGTGACAAAAACCACAAAAAACCCACAGTG此重排排的重重组酶酶基因因rag(recombinationactivatinggene)共共有两两个，，分别别产生生蛋白白质RAG1和和RAG2。RAG1识识别别九核核苷酸酸序列列，RAG2加加入入复合合物，，切割割七核核苷酸酸序列列位点点等CACAGTGACAAAAACCGTGTCACTGTTTTTGG7核核苷酸酸序列列12/23间间隔序序列9核苷苷酸序序列重组信信号序序列（（RSS））重排机机制：：重链(IgH)基因因的V-D-J重排排和轻轻链(IgL)基因因的V-J重排排均发发生在在特异异位点点上。。在V片段段的下下游，，J片片段的的上游游以及及D片片段的的两侧侧均存存在保保守的的重组组信号号序列列(recombinationsignalsequence,RSS)。V片段J片段RSSRSS间插DNAOHHOVJ单链切开RAG1RAG2分子内转酯酯反应单链切开转移核苷酸酸修复、连接接免疫球蛋白白基因重排排过程-OH亲核核攻击四转座座重组（transposition）由插入序列列和转座子子介导的基基因转移或或重排。许多数细菌菌基因组含含有几十个个拷贝的能能转座DNA片段，，片段长度度从几百到到几万个bp,是遗遗传多样性性的一个重重要来源。。转座重组分分类：插入序列(insertionsequence，IS)转座:由转座酶（（transposase））、一个分分离的反向向重复序（（invertedrepests）列和侧侧翼二个正正向重复序序列（directrepeats）组成。。发生形式：：保守性转座座(conservativetransposition)复制性转座座(duplicativetransposition)转座子（transposon，Tn）转座：：除了有插入入序列的结结构外，，还带有抗抗性或其他他标记基因因。转座序列结结构反向重复序序列反向重复序序列转座酶基因因IS转座酶基因因ampR反向重复序序列Tn3转座酶基因因tetRTn10IS细菌中的三三种转座子子类型插入序列的的复制性转转座转座子(transposons)——可从一一个染色体体位点转移移到另一位位点的分散散重复序列列。转座子组成成：反向重复序序列转座酶编码码基因抗生素抗性性等有用的的基因IRIRTransposaseGene有用基因转座子转座座由转座子介介导的转座座Exonshufflingbytransposition.(a)TranspositionofanexonflankedbyhomologousDNAtransposonsintoanintrononasecondgene.transposasecanrecognizeandcleavetheDNAattheendsofthetransposoninvertedrepeats.Ingene1,ifthetransposasecleavesattheleftendofthetransposonontheleftandattherightendofthetransposonontheright,itcantransposealltheinterveningDNA,includingtheexonfromgene1,toanewsiteinanintronofgene2.Thenetresultisaninsertionoftheexonfromgene1intogene2.转座子转座座---外外显子重组组（混编））外显子混编编（Exonshuffling）：产产生许多新新功能的蛋蛋白质外显子混编编是生物进进化的一个个重要过程程，得益于于真核生物物DNA编编码序列的的组织方式式：断裂基基因含有长长长的内含含子，含有有许多的重重复序列，，并处于外外显子的两两侧。因此此，内含子子的存在提提供了外显显子混编的的基础。有有人提出人人基因组编编码的约6万种蛋白白质是从几几千个独立立的外显子子混编而来来。第二节节重重组组DNA技技术重组DNA技术术相关关概念念及意意义重组DNA技术术的原原理及及过程程重组DNA技术术与医医学关关系一、重重组DNA技术术相关关概念念及意意义（一））有关关DNA克克隆的的相关关概念念克隆（（clone））:通通过无无性繁繁殖过过程所所产生生的与与亲代代完全全相同同的子子代群群体，，这一一群体体可以以是分分子、、细胞胞、动动物或或植物物等。。获取取这一一群体体的过过程称称为克隆化化（cloning）DNA克隆隆(DNAcloning)：是是按按人类类的意意愿，，在体体外对对DNA分分子进进行重重组，，再将将重组组分子子导入入受体体细胞胞，使使其在在细胞胞中扩扩增和和繁殖殖，以以获得得该DNA分子子的大大量拷拷贝。。又称称分子克克隆（（molecularcloning)，，基因因克隆隆（genecloning））、重重组DNA(recombinantDNA)。重组DNA技术术(recombinantDNAtechnology)：是指实实现基基因（（或DNA）克克隆所所采用用的方方法及及技术术路线线等。。又称称基因因工程程（geneengineering）），遗遗传工工程（geneticengineering））等。（二）重组DNA技术的的意义填平了物种间间不可逾越的的鸿沟；缩短进化时间间；对生物定向改改造；基因结构、结结构功能及调调控研究的基基础；疾病诊治二、重组DNA技术的原原理及过程基本过程：分切接转筛（一）工具酶酶工具酶：系指能用于DNA和RNA分子的切割，连接接，聚合，反反转录等有关关的酶系统称为工具酶酶。常用的工工具酶限制性内切核核酸酶(restrictionendonucleases)DNA连接酶(DNAligase)DNA聚合酶I(DNApolymeraseI)多核苷酸激酶酶(polynucleotidekinase)反转录酶(reversetranscriptase)DNA末端转移酶(DNAterminaltransferase)碱性磷酸酶(alkalinephosphatase)在DNA分子内部的特特异性的碱基基序列内部进进行切割将两条以上的的线性DNA分子或片段催催化形成磷磷酸二酯键连连接成一个整整体催化DNA切切口平移反反应，制备高高比活探针；；DNA末端标记记，合成cDNA的第二二链催化将把一个个磷酸分子加加到多核苷酸酸链的5’－OH末端上以RNA为模板合成互互补的cDNA链线性双链或或单链DNA分子的3’－－OH末端加上同聚物尾尾去除DNA,RNA,dNTP的5’末端的磷酸基团工具酶酶主要要功功能能1、限限制性性核酸酸内切切酶（（restrictionendonuclease）定义：是一一类能能识别别和切切割双双链DNA分子子中特特定碱碱基序序列的的核酸酸水解解酶。。分类I型型：复复合功功能酶酶－内内切(识别别位点点周围围400-700bp)、、甲基基化、、ATP酶酶和DNA解旋旋；III型：：内切切(识识别位位点周周围25-30bp)、、甲基基化II型型：：识别别和切切割双双链DNA的特特异顺顺序(识别别位点点内)命名：：根据据酶的的微生生物学学名命命名：：如：Escherichiacoli,R株中几几种限限制酶酶：EcoRI，EcoRII，，EcoRV第一字字母（（大写写，斜斜体）），示示该酶酶微生生物属名；第二、、三字字母（（小写写，斜斜体）），示示该酶酶微生生物种名；第四字字母（（大写写，斜斜体）），示示该酶酶微生生物株或型型；如一种种菌株株中有有多种种限制制性内内切酶酶，用用罗马马数字字表示示发现现分离离的先先后顺顺序。。II型型限制制性内内切酶酶的作作用特特点识别序序列４４～６６个碱碱基，，4个个核苷苷酸序序列，，则每每４４（２５５６））个碱碱基出出现一一个靶靶序列列；6个核核苷酸酸序列列出现现的间间隔是是4kb,8个核核苷酸酸序列列则是是65kb。。回文结结构（（palindrome）三种不同的切切口：平末(bluntend)端、５’－突出粘粘性末端(cohensiveendorstick)３３’－－突出粘性末末端限制性核酸内内切酶三种切切口产生5′突出出粘性末端（（stickyend):以EcoRI为为例：5′---GAATTC---3′5′---GPOHAATTC---3′3′---CTTAAG---5′EcoRI3′---CTTAAOHPG---5′′产生3′突出出粘性末端:以PstI为例：5′---CTGCAG---3′5′---CTGCApOHG---3′′3′---GACGTC---5′PstI3′---GOHpACGTC---5′产生平末端（（bluntend):以NruI为例例：5′---TCGCGA---3′5′---TCGpOHCGA---3′3′---AGCGCT---5′NruI3′---AGCOHpGCT---5′II型限制性性内切酶的用用途：DNA克隆DNA杂交与与序列分析改建质粒构建基因组图图谱和文库限制与修饰系系统（restriction–modification，R-M系统））：甲基化酶与相相关的II型型限制性内切切酶组成，它它们识别相同同序列，发挥挥不同功能。。如：EcoRIrestrictionendonuclease和EcoRImethylaserestriction–modification(a)EcoRI,arestrictionenzymefromE.coli,makesstaggeredcutsatthespecific6-bpinvertedrepeatsequenceshown.Thiscleavageyieldsfragmentswithsingle-stranded,complementary““sticky”ends.Manyotherrestrictionenzymesalsoproducefragmentswithstickyends.(b)Bacterialcellswithrestrictionendonucleasesalsocontaincorrespondingmodificationenzymesthatmethylatebasesintherestriction-recognitionsite.Forexample,E.colicellscontainingtheEcoRIrestrictionenzymealsocontainEcoRImethylase,amodificationenzymethatcatalyzesadditionofamethylgrouptotwoadeninesintheEcoRIrecognitionsequence.ThemethylatedrestrictionsiteisnotcleavedbyEcoRI,assuringthatacellmakingthisrestrictionenzymedoesnotdestroyitsownDNA.2、DNA聚合酶（（DNApolymerases））能合成DNA的酶称称DNA聚聚合酶。常常用的酶：：大肠杆菌DNA聚合合酶Ⅰ及其其大片断（（Klenow片段段）TaqDNA聚合合酶反（逆）转转录酶末端脱氧核核糖核酶转转移酶（末末端转移酶酶）(1)大大肠杆菌DNA聚合合酶Ⅰ5’3’外切切酶5’3’聚合合酶3’5’外外切酶枯草杆菌蛋蛋白酶Klenow片段段作用特点：：多功能酶：：5′→3′′DNA聚聚合酶活性性3′→5′′外切酶活活性5′→3′′外切酶活活性主要用途:催化DNA切口平平移反应，，制备高比比活探针；；DNA测序、合合成cDNA第二链链，及DNA末端标标记（Klenow片段）5’5’5’5’5’5’DNA酶IDNA聚合合酶I（全全酶）利用大肠杆杆菌DNA聚合酶I进行切口平平移法Mg2+dATPdCTPdGTPα-32PdTTPT*T*T*T*T*T*5’5’5’5’5’5’5’5’限制性内切切酶Klenow片段段α-32PdNTP变性3’末端32P标记的单单链DNA探针利用Klenow片片断进行3’端标记记5’末端突突出的DNA（2）TaqDNA聚合酶酶1988年年saiki在嗜热热水生菌(thermusaquaticus)分离离出耐热的依赖于DNA的DNA聚合合酶，MW=65kD，主要要应用于聚聚合酶链反反应（polymerasechainreaction,PCR）中对DNA分子子的特定序序列进行体体外扩增（3）反转转录酶(reversetranscriptase)亦称依赖于于RNA的的DNA聚聚合酶（RDDP)催化以RNA为模板板的DNA聚合反应应，以mRNA为模模板，催化化合成出互互补的DNA，称为为cDNA(com-plementaryDNA)。主主要用于cDNA文文库的构建建。3′→→5′′外切切酶活活性（（又称称RNA酶酶H活活性）），特特异性性降解解RNA-DNA杂杂交分分子中中的RNA部分分（4）末端端脱氧氧核糖糖核酸酸转移移酶（（末末端转转移酶酶,terminaltransferase）催化作作用：：在二价价阳离离子存存在下下，它它催化化dNTP加到到DNA分分子的的3′′羟基基端。。用途：：用于给给载体体或cDNA加加上互互补的的多聚聚体尾尾巴，，造成成便于于重组组的人人工粘粘性末末端；；用于DNA片断断3′′-末末端标标记。。AAAA·······An3’mRNAAAAA·······An3’mRNATTTT5’cDNATTTT5’GGGGGGGGTTTT5’’5’’CCCCAAAAOligo(dT)引引物物反转转录录酶酶dNTPOligo(dC)引引物物TaqDNA聚聚合合物物（（或或Klenow片片段段））dNTP去除除mRNA链链加oligo(dG)末端端转转移移酶酶cDNA双双链链全长长双双链链cDNA的的合合成成5’’5’’3’’3’’3’’3’’3、、DNA连连接接酶酶(ligase)催化化两两个个独独立立DNA片片段段的的5′′磷磷酸酸基基与与3′′羟羟基基之之间间形形成成磷磷酸酸二二酯酯键键，，使使DNA片片段段拼拼接接起起来来T4连接酶酶：粘性末端端和平末端端；大肠杆菌连连接酶：粘性末端端4、多核苷苷酸激酶（（polynucleotidekinase）寡核苷酸探探针标记；；用于连接接反应，使使缺少５５’端磷酸酸的DNA片段合成成接头磷酸酸化NNNNNHOAd-P-P-P53NNNNNP53+Ad-P-P+[-32P]ATPADP寡核苷酸片片段32P标记的寡核苷酸片片段多核苷酸激激酶（二）基因因载体（vector）载体（vector）：携带目的DNA片段段进入宿主主细胞进行行扩增和/或表达的的一类DNA分子。。载体特征：：自主复制即即有复制制原点（必必需）酶切位点（（必需）大小适合筛选标记:如抗药药性、营养养标记、-半乳糖苷苷酶显色反反应等拷贝数高载体类型：来源:质粒；噬菌菌体；病毒毒,酵母母人工染色色体功能:克隆载型体体和表达型型载体受体细胞:原核细胞载载体、真核核细胞载体体和穿梭载载体（shuttlevector）质粒（plasmid）：细菌染色体体外小型双双链环状DNA。质粒复制的的类型：严紧型：1-5拷贝贝，与细菌菌复制密切切相关松弛型：10-200拷贝以以上常用载体：pBR322：4.36kb；人工工构建；Tetr和Ampr；多克隆位点点，松弛型pUC系列质质粒：pBR322和和M13噬菌菌体改建,2.674kb；Ampr；蓝白斑筛选选（lacZ'，-肽）；高拷贝贝（500-700）1、质粒载体体用途：保存与扩增<2kb的的目的基因构建cDNA文库测序制备探针复制点：ori筛选标记：ampr,tetr克隆位点：多个单一限限制性内切酶酶位点2、噬菌体载载体（（bacterieophagevector）基因组特点：50kb双链链DNA分子子，末端12bp为互补补单链（cos位点，又又称粘端）两个启动子：：PR和PL编码基因：包包装蛋白，裂裂解功能蛋白白等生长方式：溶菌性生长（（组装噬菌体体）溶源性生长（（整合入细菌菌DNA内））λ噬菌体载体（（BacteriophageLambda）cosTACGGGGCGGCGACCTCGCGATGCCCCGCCGCTGGAGCGCCos序列及及酶切割位点点载体种类：插入载体（insertionvector）：外外源性DNA直接插入酶酶切位点（EcoRⅠ））容量：几个kb代表载体：λgt10；；λgt11用途：构建cDNA文库库替代载体（substitutionvector））：外源性DNA替代载载体中央部分分酶切位点：EcoRⅠ；；BamHⅠⅠ；SalⅠⅠ容量：9-22kb代表载体：EMBL4用途：构建基基因组文库coscoscoscoscoscoscIEcoRIEcoRIlacZE,B,SE,B,Sgt10gt11EMBL4噬菌体插入入载体和替代代载体示意图图3、柯斯质粒粒载体（cosmid）基因组组成：：质粒与噬菌体体的cos位位点联合构成成、4-6kb、质粒粒复制起始位位点、酶切位位点、抗药性性基因；容量：29-45kb代表载体：pGEM-3Zf（-））工作方式：具有噬菌体样样的包装和感感染，又具有有质粒样的复复制用途：基因组文库（三）目的基基因（targetgene））1、目的基因因的用途研究该基因的的全貌与内涵涵：结构、功功能、调控寻找异常基因因异常点，探探索疾病的机机理与治疗研究生物种系系进化与相关关同源性基因工程重组组表达改造某些基因因，以改良品品种基因治疗2、获得目的的基因的方法法原核目的基因因获得：直接分离真核目的基因因获得：基因组文库筛筛选cDNA文库库筛选人工合成PCR合成DNA文库概概念DNA文库（（DNAlibrary）：通过重组、克克隆方法保存存在宿主细胞胞中的各种重重组DNA分分子的集合体体。分分两类：：基因组文库(genomiclibrary)：将某种生物细细胞的基因组组DNA切割割成一定大小小的片段后，，分别与合适适的载体重组组并导入宿主主细胞内克隆隆保存。这种种保存在宿主主细胞内的整整个基因组DNA片段集集合体称~。。cDNA文库库(cDNAlibrary)：：将分离纯化获获得某种真核核细胞中的全全部mRNA逆转录成cDNA，并并通过重组、、克隆方法保保存在宿主细细胞中。这种种保存在宿主主细胞内的cDNA集合合体称~。用聚合酶链反反应（PCR）方法获取取目的基因3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’第一次循环：：变性（95oC）退火延伸（72oC）第二次循环3’5’5’3’3’5’5’3’第三次次循环环25~30次循循环后后模板板DNA含含量可可以扩扩大100万百百倍以以上PCR原理理模板DNA引物引物用聚合合酶链链反应应（PCR）方方法获获取目目的基基因一对引引物分分别含含有BamHI和和HindIII位位点点，PCR产物物经双双酶切切后，，可定定向插插入载载体。。（四））外源源基因因与载载体的的连接接作用酶酶：DNA连接接酶连接方式：：粘性末端连连接平末端同聚物加尾尾连接人工接头人工接头连连接法BamHI接头连接酶BamHI切割连接酶+BamHI切割割的pBR322（五）重组组DNA导导入受体菌菌1、重组子子导入受体体菌的方式式：转化（transformation）：特指将质粒粒DNA或或以它为载载体构建的的重组子导导入细菌的的过程。转染（transfection）：：病毒及其重重组子导入入受体细胞胞。2、导入方方法氯化钙法感受态：细菌处于容容易吸收外外源DNA的状态称称感受态制备条件：：冰浴、低渗渗CaCl2（0.1mol/L））转化反应：：冰浴30分分短暂热休克（42℃）转化效率：：105-106/µgDNA;环环状DNA高于线状状DNA1000倍电穿孔法：：电穿孔仪（六）重组组子的筛选选与鉴定1、阳性菌菌落筛选：：抗药性标志志：ampr、tetr、neor插入抗抗性失失活互补筛筛选：：蓝白白斑筛筛选（（α-互互补））、营营养缺缺陷互互补分子杂交：：原位杂交交、southern杂交2、插入外外源性DNA的鉴定定：酶切（目的的片段长度度）PCR测序3、表达蛋蛋白的鉴定定：免疫学、生生物学活性性抗药性筛选选多克隆位点点启动子裂开的N端端裂开的N端端外源DNA半半乳糖苷酶酶N端端编码序列列pUC182686bppUC182686bp染色体重组体pUC18细菌在含X-gal和乳糖操纵纵子诱导剂剂的琼脂上上培养细菌在含X-gal和乳糖操纵纵子诱导剂剂的琼脂上上培养pUC18含重组体pUC18的白色菌菌落蓝色菌落含载体pUC18的的蓝色菌落落半乳糖糖苷酶C端编码码序列转化转化利用互补原原理筛选（（兰白斑筛筛选）重组组子pUC18amprampr蓝白斑筛选选重组质粒粒原位杂交RadioactiveprobewillhybridizewithitscomplementaryDNAWashfilter,prepareautoradiographandcomparewithmasterplatePlacenitrocellulosefilterinsealableplasticbagwithsolutionoflabeledDNAprobeSouthernblot免疫学方法法筛选重组组子DNA重重组技术实实例：基基因因文库构建建与筛选人基因组文文库构建ConstructionofagenomiclibraryofhumanDNAinabacteriophagelvector.人基因组DNA用限限制性内切切酶（Sau3A）部分消消化产生约约20-kb带粘性性末端的部部分重叠的的随机片段段；载体消化：：噬菌体DNA用BamH1消化，，去掉中间间的可置换换片段，并并产生左右右两个带粘粘性末端的的片段基因组片段段与噬菌菌体DNA拼接成重重组DNA体外装配有有活性的噬噬菌体，并并感染大肠肠杆菌菌种培养、、筛选、扩扩增保存InfectE.coliIndividualclonesProductionofoverlappingrestrictionfragmentsbypartialdigestionofhumangenomicDNAwithSau3A.Thisrestrictionendonucleaserecognizesthe4-bpsequenceGATCandproducesfragmentswithsingle-strandedstickyendswiththissequenceonthe5’endofeachstrand.AhypotheticalregionofhumangenomicDNAshowingtheSau3Arecognitionsites(red)isshownatthetop.PartialdigestionofthisregionofDNAwouldyieldavarietyofoverlappingfragments(blue)≈20kblong.UseofsuchoverlappingfragmentsincreasestheprobabilitythatallsequencesinthegenomicDNAwillberepresentedinallibrar